專利名稱：抗氧化劑化合物用于肌肉復(fù)原的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗氧化劑化合物用于保持或恢復(fù)肌肉健康的用途。這些化合物可用于制造下述組合物，所述組合物用于保持或恢復(fù)肌肉健康，由此例如預(yù)防和/或治療鍛煉導(dǎo)致的肌肉損傷。更具體地，此類組合物包括食物、飲料、補(bǔ)充劑和飼料。
運(yùn)動(dòng)員要進(jìn)行常規(guī)的強(qiáng)烈和/或長時(shí)間的肌肉鍛煉。研究表明，在艱苦的鍛煉期間，活性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生被提高至超過了組織抗氧化防御系統(tǒng)的水平。其結(jié)果是氧化脅迫(oxidative stress)，這可能對(duì)組織(例如肌肉組織)造成損傷。通常，良好的肌肉健康狀況對(duì)于其性能來說非常重要，尤其是骨骼肌的。鍛煉因此可能損傷肌肉健康，導(dǎo)致例如疲勞、較低的耐力、損失功能。已提出用抗氧化劑補(bǔ)充劑來預(yù)防此類損傷(Dietaryanti-oxidants and exercise，Journal of Sports Sciences，2004，22，81-94，Powerset al.)。
但是并非所有抗氧化劑都適用于復(fù)原肌肉損傷。研究已顯示，一些抗氧化劑幾乎沒有作用。這可能由于多種原因。首先，抗氧化劑的生物可利用性可能較低。因此腸對(duì)抗氧化劑的吸收相對(duì)較低，導(dǎo)致需要大量的抗氧化劑來發(fā)揮作用。第二，并非所有抗氧化劑都能通過肌肉細(xì)胞的膜。此外，一些抗氧化劑使用中被消耗，還使得必須要有相對(duì)高含量的抗氧化劑的攝取來獲得效果。而不管從健康的角度(體內(nèi)很多代謝產(chǎn)物)還是從成本的角度來看，這都不是人們想要的。
一些抗氧化劑已知能在所謂的抗氧化劑網(wǎng)絡(luò)(network)中再生，例如，維生素E通過維生素C再生。但是關(guān)于維生素E的體內(nèi)研究沒有顯示出對(duì)于抗氧化劑標(biāo)記的任何顯著效果。
本發(fā)明的目的是提供適用于肌肉復(fù)原的組分，其可參與抗氧化劑網(wǎng)絡(luò)，并且具有良好的生物可利用性。
令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)，根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的可食用化合物可用于保持或恢復(fù)肌肉健康 其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或 其中，m是1、2或3前提條件是R和R1不同時(shí)為H。
合適的根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物的例子是羥基酪醇(hydroxytyrosol)及其乙酸酯、橄欖苦苷(oleuropein)、對(duì)羥苯基乙醇(tyrosol)及其乙酸酯、高香草酸醇(homovanillic alcohol)和/或鄰苯二酚(cathechol)。這些化合物的混合物也可以使用。
我們吃驚地發(fā)現(xiàn)，該化合物可用維生素C再生。這使得根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物適于制造用于預(yù)防或治療氧化脅迫導(dǎo)致的肌肉損傷的組合物。
優(yōu)選地，R是OH。更優(yōu)選地，至少羥基酪醇或其乙酸酯用于組合物中。羥基酪醇具有額外的優(yōu)點(diǎn)其是兩性的。其可溶解于水性和脂肪組合物中，例如細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外流體和膜中。
根據(jù)結(jié)構(gòu)式1的化合物可用于制造用于治療或預(yù)防肌肉損傷的組合物。優(yōu)選地，該組合物不含紅景天苷(salidroside)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的用途，其中，適用于肌肉復(fù)原的組分被用在適合人類使用的營養(yǎng)產(chǎn)品中。任何營養(yǎng)產(chǎn)品都可能是適合的，例如，食物、飲料或膳食補(bǔ)充劑。優(yōu)選地，營養(yǎng)產(chǎn)品不是口香糖。
優(yōu)選地，根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的抗氧化劑化合物存在于運(yùn)動(dòng)員攝取的運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)產(chǎn)品中。已知運(yùn)動(dòng)員可從針對(duì)普通人群的推薦膳食指導(dǎo)之外的特殊食物或食物成分中獲得好處。術(shù)語“運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)產(chǎn)品”在本文中被用來表示特別針對(duì)運(yùn)動(dòng)員改良過的任何食物或飲料。
有多種適于本發(fā)明目的的運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)物，例如特定膳食補(bǔ)充劑、運(yùn)動(dòng)飲品或運(yùn)動(dòng)食物。
運(yùn)動(dòng)飲品可以是低滲的、高滲的或者等滲的。運(yùn)動(dòng)飲品可以以液體形式、作為濃縮物或作為粉末(待溶解于液體，例如水中)獲得。運(yùn)動(dòng)食物可以是條棒狀、片劑或凝膠的形式。膳食補(bǔ)充物可以是藥丸或膠囊的形式。
營養(yǎng)物還可包含常用添加劑，例如加甜劑、香料、糖、脂肪、乳化劑、防腐劑。營養(yǎng)物還可包含其它活性組分，例如(經(jīng)水解)蛋白質(zhì)，如WO02/45524所述。此外，營養(yǎng)物中還可存在其它抗氧化劑，例如類黃酮、類胡蘿卜素、泛醌、蕓香苷、硫辛酸、過氧化氫酶、谷胱甘肽(GSH)和維生素，例如維生素C和E或其前體。根據(jù)結(jié)構(gòu)式1的化合物和維生素C或其前體的組合已顯示出了協(xié)同效果。優(yōu)選地，羥基酪醇或其乙酸酯與維生素C組合物。包含根據(jù)結(jié)構(gòu)式1的化合物和維生素C的組合物是新穎的，其是本發(fā)明的另一個(gè)方面。
根據(jù)結(jié)構(gòu)式1的化合物需要以有效量存在。通常，每份需要1mg至3克之間的化合物以提供效果，優(yōu)選地，每份10mg至1克之間。這取決于很多因素，例如，體重、年齡、膳食習(xí)慣和鍛煉強(qiáng)度。抗氧化劑的效果可通過某些標(biāo)記來測(cè)量。在肌肉鍛煉中，脂類氧化和蛋白氧化都會(huì)發(fā)生。針對(duì)脂類氧化的量的待測(cè)合適標(biāo)記是例如丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及異構(gòu)前列腺素(isoprotane)。針對(duì)蛋白氧化的量的合適標(biāo)記是例如蛋白羰基。
包含根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物的營養(yǎng)物可在鍛煉之前、期間或之后食用。當(dāng)在鍛煉前使用的情況下，優(yōu)選在之前大約一小時(shí)時(shí)食用。在鍛煉后使用的情況下，優(yōu)選在之后一小時(shí)內(nèi)食用，更優(yōu)選在鍛煉后立即食用。
除了適合人類使用的營養(yǎng)產(chǎn)品之外，還可在用于動(dòng)物的飼料(包括寵物食品)中使用根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物。因此這尤其適用于那些因?yàn)榧∪饬α勘皇褂玫膭?dòng)物，例如(賽)馬或犬(即，賽犬或雪撬犬)。
下文中通過下述非限制性實(shí)施例來闡述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1 器官浸浴(bath)實(shí)驗(yàn)使用雄性Lewis大鼠(12至14周齡之間)。斷頭處死后，迅速切下橫膈(diaphragm)，切成小條帶(大約2mm寬，1cm長)，隨后放進(jìn)恒溫器官浴(含有Krebs緩沖液，用95％O2和5％CO2的混合物對(duì)其充氣，pH 7.4)中。每條橫膈條帶與等容傳感器(isometric transducer)垂直相連。Krebs緩沖液的組分是(mM)NaCl(117.5)、KCl(5.6)、MgSO4(1.18)、CaCl2(2.5)、NaHPO4(1.28)、NaHCO3(25)和葡萄糖(5.5)。實(shí)驗(yàn)期間，緩沖液每15分鐘換一次。用鉑電極在每條肌肉條的全長上制造場(chǎng)刺激(field stimulation)。
在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，在室溫下45分鐘期間洗條帶，以使得溫度依賴型偏差最小。之后，打開水浴為37℃(在實(shí)驗(yàn)開始前15分鐘)。用顫搐收縮(1Hz)先將每條條帶調(diào)節(jié)至其最優(yōu)長度(Lo)。脈沖持續(xù)總是10ms。
首先測(cè)定Pt(1Hz刺激下的顫搐張力)和Po(在100Hz的刺激，250ms持續(xù)情況下的最大比張力)。之后，通過以250ms應(yīng)用10、20、33、50和100Hz的脈沖，在Lo測(cè)定橫膈肌條帶對(duì)于逐漸增加的刺激的應(yīng)答。在收縮之間使用2分鐘的復(fù)原期。在力-頻率方案完成后，應(yīng)用疲勞方案。在5Hz下對(duì)條帶進(jìn)行6分鐘的刺激。該刺激方案后，羥基酪醇(HT)或?qū)φ?運(yùn)載體，乙醇)孵育5分鐘。隨后，過氧化氫(H2O2)或?qū)φ?MilliQ)孵育10分鐘。之后再測(cè)定Pt、Po、力-頻率和疲勞。
羥基酪醇購自Cayman Chemical，Ann Arbor，USA。過氧化氫從Sigma，St.Louis，USA獲得。所有其它化學(xué)品都是分析純級(jí)別的。


圖1顯示了H2O2對(duì)肌肉力量的作用。在應(yīng)用的所有刺激頻率下，較之對(duì)照，H2O2都劑量依賴性地降低力量。數(shù)據(jù)作為基于至少兩次重復(fù)測(cè)量的平均值表示。
圖2顯示了HT針對(duì)H2O2介導(dǎo)的肌肉損傷的的保護(hù)作用。在所有刺激頻率(10、20、33、50和100Hz)下，HT針對(duì)H2O2介導(dǎo)的肌肉損傷均提供保護(hù)。沒有H2O2孵育的300μM HT甚至保持了肌肉功能。數(shù)據(jù)作為基于至少兩次重復(fù)測(cè)量的平均值表示。
圖3顯示了HT針對(duì)H2O2介導(dǎo)的肌肉損傷的的保護(hù)作用。HT針對(duì)H2O2誘導(dǎo)的力量減少提供劑量依賴性的保護(hù)。刺激頻率為50Hz，H2O2濃度為1mM。數(shù)據(jù)作為基于至少兩次重復(fù)測(cè)量的平均值表示。
實(shí)施例2 清除實(shí)驗(yàn)以及與硫辛酸的比較材料羥基酪醇購自Cayman Chemical，Ann Arbor，USA。對(duì)羥苯基乙醇和KO2購自Fluka，Buchs，Switzerland。高香草酸醇、2-甲氧基苯酚、苯酚以及二氫若丹明-123(DHR-123)獲得自Sigma，St.Louis，USA。鄰苯二酚獲得自Janssen Chimica，Geel，Belgium。硫辛酸購自Asta Medicac AG，F(xiàn)rankfurt，Germany。一氧化氮購自AGA，Hamburg，Germany。所有其它化學(xué)品都是分析純級(jí)別的。
ONOOH清除按照Kooy et al(Peroxynitrite-mediated oxidation of dihydrorhodamine123.Free Radic Biol Med，16；149-56)所述來測(cè)量針對(duì)ONOOH誘導(dǎo)的化合物DHR-123氧化的保護(hù)。簡言之，在100mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)中于37℃孵育5μM的DHR-123和多種濃度的清除劑(scavernger)。隨后，在快速震蕩下向管中移入10μl的一份來ONOOH，達(dá)到0.7μM的終濃度。用分別為500nm和536nm的激發(fā)波長和發(fā)射波長來進(jìn)行熒光測(cè)量。以提供對(duì)DHR-123氧化的50％抑制的清除劑的濃度(IC50)來表示效果。
O2·-清除O2·-通過黃嘌呤(150μM)和黃嘌呤氧化酶(XO)(5.5mU/ml)在50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.8)中的反應(yīng)產(chǎn)生。通過氮藍(lán)四唑(NBT，50μM)來檢測(cè)O2·-自由基。NBT經(jīng)歷O2·-的還原，成為其甲臜(formazan)。在2分鐘期間，于560nm對(duì)該還原的速率進(jìn)行分光光度監(jiān)測(cè)。加入多種濃度的清除劑，在37℃孵育。通過加入XO來起始反應(yīng)。O2·-清除能力被表示為使NBT還原降低50％的清除劑的濃度(IC50)。為調(diào)節(jié)清除劑對(duì)XO活性的可能的抑制影響，在37℃孵育最高濃度的清除劑，隨后在2分鐘期間于293nm測(cè)量尿酸鹽形成的速率。
清除試驗(yàn)的結(jié)果顯示于下表1中。
表1試驗(yàn)化合物對(duì)于ONOO-和O2·-的清除活性。顯示為IC50值±SEM(以μM表示)，n＝3。
實(shí)施例3 羥基酪醇(HT)通過抗壞血酸鹽/酯的再生HT(Cayman Chemical，Ann Arbor，USA)的氧化在145mM磷酸緩沖液(pH 7.4，含有50μM HT和5U/ml酪氨酸酶(Sigma，St.Louis，USA))中于37℃進(jìn)行。對(duì)酪氨酸酶和HT的孵育導(dǎo)致醌(HTQ)的形成。通過分光光度方法和高效液相色譜(HPLC)對(duì)反應(yīng)加以監(jiān)測(cè)。以240nm/分鐘的掃描速度記錄光譜。使用Supelcosil LC318柱進(jìn)行孵育混合物的HPLC分析。用含有0.1％(v/v)三氟乙酸和5％(v/v)乙腈的蒸餾水以每分鐘1ml的流速對(duì)柱進(jìn)行洗脫。使用280nm處的二極管陣列檢測(cè)(DAD)。抗壞血酸鹽/酯與HTQ反應(yīng)的能力按照下文所述來測(cè)定。首先，在兩分半鐘期間形成HTQ。隨后，向HTQ中加入150μM抗壞血酸鹽/酯(Sigma，St.Louis，USA)，立即在三分鐘手工將混合物注射進(jìn)HPLC。
圖4顯示了僅HT時(shí)的HPLC測(cè)量結(jié)果(對(duì)照)。
圖5顯示了向HT加入酪氨酸激酶(tyrokinase)的效果，由此顯示了其醌的形成(對(duì)照)。
圖6顯示了向HT和酪氨酸激酶的混合物加入抗壞血酸鹽/酯的效果。
其顯示，HT再次形成，三分鐘后不再存在HTQ。HT通過抗壞血酸鹽/酯的再生已發(fā)生(實(shí)施例)。
實(shí)施例4 包含羥基酪醇的曲奇餅配方活性成分羥基酪醇10-50mg/每份(典型的為30g)
所有成分都在混合下緩慢加入，以形成甜味油酥團(tuán)。之后，將油酥團(tuán)冷藏(4℃)至少2小時(shí)，之后將油酥團(tuán)碾平為大約5mm的厚度。切成塊，烘焙之前表面刷上蛋黃。烘焙可于180℃在風(fēng)烤箱(fan oven)中進(jìn)行15分鐘。
權(quán)利要求
1.包含根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物的組合物用于保持或恢復(fù)肌肉健康的用途 其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或 其中，m是1、2或3前提條件是R和R1不同時(shí)為H。
2.根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物在制造用于保持或恢復(fù)肌肉健康的組合物中的用途 其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或 其中，m是1、2或3前提條件是R和R1不同時(shí)為H。
3.如權(quán)利要求1-2中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述化合物是羥基酪醇、其乙酸酯或其前體。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，其中所述組合物額外包含另一種抗氧化劑。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述額外的抗氧化劑是維生素C。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述組合物是飲料、膳食補(bǔ)充劑、食物或飼料。
7.用于制備飲料、膳食補(bǔ)充劑、食物或飼料的方法，其特征在于，向其中加入包含根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物的組合物，用于保持或恢復(fù)肌肉健康 其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或 其中，m是1、2或3前提條件是R和R1不同時(shí)為H。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述食物、飼料或飲料包含每份至少1mg的根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物。
9.一種組合物，其包含維生素C或其前體以及根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物 其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或 其中，m是1、2或3前提條件是R和R1不同時(shí)為H。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求9的組合物的食物、飲料、膳食補(bǔ)充劑或飼料。
全文摘要
本發(fā)明描述了下述組合物用于保持或恢復(fù)肌肉健康的用途，所述組合物包含根據(jù)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物，結(jié)構(gòu)式(1)中R可以是H、OH或CH
文檔編號(hào)A61K36/00GK101060794SQ200580039200
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者阿利亞·卡斯特·濟(jì)斯, 薩斯卡·約翰內(nèi)斯·瑞提基斯, 蓋德·瑞勃圖斯·米歇爾·馬莉亞·哈恩, 阿爾特·巴斯特 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司