專利名稱：一種被乙型肝炎病毒x抗原上調表達的基因及其編碼產物與用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥工程技術領域，尤其涉及一種被乙型肝炎病毒(HBV)X抗原(HBxAg)上調表達的基因，及其編碼產物，以及它們在乙型肝炎相關肝癌的早期診斷及治療中的應用。
背景技術：
原發性肝細胞癌(HCC)是全世界范圍的惡性腫瘤之一，每年都有將近40萬的人被診斷患上HCC。從被診斷開始通常只有不到6個月的存活期，5年生存率低于3％。如此高的死亡率主要是因為癌組織的過快生長，還有就是初期通常無明顯癥狀。因此，盡管早期肝癌可以通過手術治療，實際上發現時大部分都已是晚期。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是導致HCC發生的重要原因之一。HBV基因組編碼的蛋白包括DNA聚合酶、核心蛋白、S蛋白、前S1蛋白和前S2蛋白以及X蛋白(HBx)。乙型肝炎病毒X抗原(HbxAg)是一種反式激活蛋白，其序列高度保守，為病毒基因組轉錄所必需，并與慢性HBV感染者發展為HCC有重要關系，具有轉錄調節活性，對于細胞增殖、信號轉導、DNA修復及凋亡等均有影響，可能參與HCC形成的多個環節。HBxAg反式激活的基因也可能參與肝細胞的惡性轉化，并可能作為肝細胞惡性轉化過程中的標志基因，在HBV相關肝癌的早期診斷和治療中具有應用價值。

發明內容
本發明的目的在于篩選在正常肝組織中不表達或極低水平表達，而在HBV感染的肝細胞中，被HbxAg顯著上調表達的基因，并對該基因進行克隆和表達，研究它在HBV相關肝癌的早期診斷和治療中的應用。
本發明利用消減雜交技術構建HBxAg反式激活的cDNA消減文庫，篩選差異表達的基因片段，并進行生物信息學分析，獲得一種被乙型肝炎病毒X抗原(HBxAg)上調表達的新的基因，命名為UG。UG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，由745個堿基組成，與人胎肝cDNA文庫中的H49417克隆有98.7％的同源性。UG基因編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，由99個氨基酸殘基組成，它和多藥抗性蛋白(MRP)家族的N端幾乎100％同源。
本發明提供了UG基因的篩選、克隆方法，以及對肝細胞中UG的檢測和對UG功能的驗證1、HBxAg表達質粒的構建和Huh7細胞穩定轉染擴增HBxAg基因，插入真核表達質粒pIRESneo，得到重組質粒pIRESneo-HBx。再分別將重組質粒pIRESneo-HBx和對照空載體質粒pIRESneo轉染Huh7細胞(人肝癌細胞，以含有5％小牛血清的DMEM培養液培養)，轉染24小時后，更換為含有600μg/ml G418的選擇性培養基，間隔2-3天換液一次，14天后待陽性克隆形成以后，用裂解液裂解細胞，以Western blotting檢測HBxAg蛋白的存在；2、消減雜交用Myltenyi Biotech的mMACS mRNA isolation kit純化pIRESneo穩定轉染的Huh7細胞的mRNA，逆轉錄成單鏈的cDNA，再與pIRESneo-HBx穩定轉染的Huh7細胞的mRNA進行雜交，洗脫未雜交的mRNA，用隨機引物擴增，即可得到差異表達的基因，即載體轉染的Huh7細胞不表達，而pIRESneo-HBx轉染的Huh7細胞表達的基因。將擴增產物與pMD18T載體連接，測序，序列再與GenBank進行對比分析，獲得UG基因；3、Real time PCR檢測分別抽提pIRESneo-HBx和pIRESneo穩定轉染的Huh7細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，再進行Real time PCR分析；結果在前者轉染的Huh7細胞可檢測到強烈的雜交信號，而在后者僅檢測到很微弱的信號甚至檢測不到信號。對臨床標本進行的檢測顯示，UG mRNA在HBV感染的肝臟細胞和HCC早期的肝細胞中過量表達，在未感染HBV的肝細胞中則很弱甚至未檢測到表達；4、UG表達對肝臟腫瘤細胞生長的影響分析UG基因的編碼序列，合成引物，PCR擴增cDNA片段，產物插入真核表達質粒載體pIRESneo，獲得重組質粒pIRESneo-UG測序；HBxAg能促進肝細胞的生長意味著其反式激活的基因也可能介導類似的功能。為了驗證UG是否也具有這種功能，將表達質粒pIRESneo-UG、pIRESneo-HBx以及pIRESneo轉染Huh7細胞，用含有10％胎牛血清的培養液培養。5天后隔天用臺盼蘭染色計數，同時用流式細胞術分析細胞的生長和DNA的含量。與轉入空載體的細胞相比，UG明顯刺激了Huh7細胞的生長，但未及HBxAg對Huh7生長的影響程度。這說明上調UG的表達是HBxAg刺激細胞生長的機制之一。
原位雜交和免疫印跡顯示UG和HBxAg共表達于HBV感染者的肝組織中，HBxAg和UG在HCC早期都過量表達，體外實驗證實UG的過量表達會刺激人肝癌細胞(HepG2)的生長。簡言之，在HBV感染早期，HBxAg反式激活UG基因的表達，而UG則刺激細胞增殖UG和促進細胞惡性轉化。因此，UG可以作為乙型肝炎所致的HCC的早期診斷指標，并可能作為基因或藥物治療的靶點，本發明也為進一步探討HBV致病及致癌機制提供新的研究方向。


圖1pIRESneo-HBx質粒的結構圖2HBx基因對Huh7細胞細胞內UG基因的上調作用圖3HBV感染的肝組織和肝癌組織中UG基因的表達圖4pIRESneo-UG質粒的結構圖5UG的促腫瘤細胞增殖作用
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述。
實施例11.HBxAg表達質粒的構建根據HBxAg核苷酸序列設計引物，上、下游引物中分別引入EcoRI、BamH I酶切位點，以含有HBV全基因組的質粒pBR322-HBV(本實驗室構建)為模板，PCR擴增HBxAg編碼基因，PCR擴增試劑為TaKaRa產品。
引物15′-cccgaattcatggctgctcgggtgtgctg-3′引物25′-cccggatccttaggcagaggtgaaaaagttgc-3′在0.5毫升離心管建立以下反應體系質粒pBR322-HBV10ng10×Taqase緩沖液 5μl引物1(5mM)2μl引物2(5mM)2μldNTP(10mM)2μlMgCl2(25mM) 2μlTaqase(2U/μl)0.5μl補充雙蒸去離子水至總反應體積50μl，在PE2400型PCR儀進行熱循環反應先94℃變性2分鐘，再94℃變性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸50秒，共進行30個循環，然后72℃延伸5分鐘，溫度降至4℃結束反應。PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶回收，以EcoRI、BamH I酶切，酶切產物插入經過EcoRI、BamHI酶切線性化的真核表達質粒載體pIRESneo。
在0.5毫升離心管建立以下反應體系EcoRI、BamH I酶切的HBxAg基因片段6μl5×T4DNA連接酶緩沖液2μlEcoRI、BamH I酶切的質粒載體pIRESneo 2μlT4DNA連接酶(2U/μl) 1μl混勻，置于16℃水浴16小時，取5μl轉化感受態大腸桿菌DH5α，得到的氨芐青霉素抗性菌落接種于含有氨芐青霉素100μg/ml的LB液體培養基，再提取重組質粒進行酶切鑒定，命名為pIRESneo-HBx，其結構如圖1所示，PCMV為巨細胞病毒啟動子，IVS為內含子，IRES為內部核糖體進入位點，Neo為新霉素磷酸轉移酶基因，即G418抗性基因，polyA為牛生長激素轉錄終止序列。
2.Huh7細胞穩定轉染(1)用QIAprep SpinMiniprep Kit(Qiagen)試劑從大腸桿菌中提取重組質粒pIRESneo-HBx以及對照質粒pIRESneo，并用紫外分光光度法測定質粒DNA的含量和純度。
(2)用含有5％小牛血清的DMEM培養液傳代培養細胞人肝癌細胞Huh7，轉染前一天，胰酶消化生長狀態良好的Huh7細咆，傳代接種24孔板，次日細胞達到90％～95％匯合時，用脂質體LipofectamineTM2000(Invitrogen)轉染，在無血清無抗生素的DMEM培養液中進行。分別取pIRESneo-HBx和對照質粒pIRESneo 0.8μg，與50μlDMEM培養液混合；再取LipofectamineTM20002μl與50μl DMEM培養液混合；室溫孵育5分鐘以后，將質粒DNA溶液與LipofectamineTM2000溶液輕輕混合，室溫下放置不超過5分鐘，以形成DNA-脂質體復合物。同時，用DMEM培養液洗細胞3次。每孔再加入100μlDMEM培養液。將DNA-脂質體復合物溶液加入孔內，將培養板前后輕輕晃動使分布均勻。37℃孵育4～6h后，吸除轉染液移去，加入2ml完全DMEM培養液，37℃，5％CO2培養24小時。
(3)轉染24小時后，吸除原培養液，換用含有600μg/ml G418的完全DMEM培養液進行加壓篩選，3天換液一次。14天后待陽性克隆生長，并達到70％以上匯合成片時，收集細胞。
(4)分別收集pIRESneo-HBx以及對照質粒pIRESneo穩定轉染的Huh7細胞，與4×SDS凝膠加樣緩沖液混合。100℃煮沸10分鐘，行SDS-PAGE(分離膠濃度12％)。電泳4h后，將SDS-PAGE電泳的蛋白條帶電轉移到硝酸纖維素膜上，用封閉液(5％的脫脂奶粉溶液，溶于PBS中)室溫封閉2小時，再加入按1∶1000稀釋的兔抗HBxAg多克隆抗體，37℃反應1小時，TBS溶液洗三遍，加入1∶500稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，37℃反應1小時，TBS溶液洗3遍，然后用DAB顯色反應。
(5)mRNA提取使用QuickPreP mico mRNA純化試劑盒從Huh7細胞中提取重組質粒pIRESneo-HBx以及對照質粒pIRESneo穩定轉染的細胞的mRNA，以分光光度計分別定量檢測。
3.消減雜交分別抽提pIRESneo-HBx以及對照質粒pIRESneo穩定轉染的細胞的mRNA，將pIRESneo穩定轉染的細胞的mRNA加入耦聯有oligo dT的磁珠，將吸附mRNA的磁珠置于磁場中，反復淋洗，以去除mRNA以外的其他成分，再利用磁珠上的oligo dT作為引物直接進行逆轉錄反應，再用洗脫緩沖液洗去mRNA，使磁珠上只保留單鏈cDNA，然后加入適量(少量)的pIRESneo-HBx穩定轉染的細胞的mRNA，使共同表達的基因所對應的mRNA吸附于磁珠，再進行淋洗，將未吸附的mRNA洗脫，對洗脫的mRNA進行RT-PCR擴增，即可大量富集差異表達的基因，即載體轉染的Huh7細胞不表達，而pIRESneo-HBx轉染的Huh7細胞表達的基因。將擴增產物與pMD18T載體連接，測序，序列再與GenBank進行對比分析。經過6次試驗，得到一種高度富集的差異表達基因，該基因片段長745個堿基，與人胎肝cDNA文庫中的H49417克隆有98.7％的同源性，命名該基因為UG。對篩選得到的克隆進行DNA測序，再與GenBank中的序列數據中進行比對分析。結果所得克隆的序列如SEQ NO1所示，其編碼氨基酸的序列如SEQ NO2所示。
4.逆轉錄實時熒光定量PCR(1)RNA提取質粒轉染的Huh7細胞直接在培養皿上加Trizol試劑，再用QuickPreP mico mRNA純化試劑提取、純化mRNA。臨床標本則先進行組織勻漿，再用Trizol和QuickPreP mico mRNA純化試劑提取、純化mRNA。以紫外分光測定mRNA濃度。
(2)逆轉錄實時熒光定量PCR從細胞或組織中提取的mRNA各取1μg，加入下列組分配制實時定量一步RT-PCR反應液(One step SYBRRT-PCRkit，TaKaRa)2×SYBR one step RT-PCR緩沖液12.5μlTaqase(5U/μl) 0.5μlM-MLV RTase(200U/μl)0.25μlRNase抑制劑(40U/μl) 0.5μl引物F(10μM) 0.5μl引物R(10μM) 0.5μlRNase Free dH2O8.25μl總體積 25μl。
引物15′-ctgctgagcctgtgcttcc-3′
引物25′-catggtggtggatgaagag-3′以10倍系列稀釋的質粒pMD-UG為標準品，儀器為Roche的Lightcycler。反應條件42℃逆轉錄15分鐘，95℃2分鐘滅活逆轉錄酶，然后進行PCR反應95℃5秒，60℃20秒，45個循環。然后分析融解曲線。
結果如圖2所示，未經轉染的Huh7細胞、以及空載體pIRESneo轉染的Huh7細胞內的UG基因幾乎不表達，而pIRESneo-HBx轉染的Huh7細胞內的UG基因相對高水平表達，表明HBxAg能顯著激活UG基因的表達。如圖3所示，UG基因在正常肝組織內不表達，而HBV感染的肝組織以及HCC組織內，UG基因高水平表達。
實施例21、UG cDNA表達質粒的構建合成UG基因的擴增引物，上、下游引物中分別引入EcoRI、BamHI酶切位點，PCR擴增UG基因的cDNA片段。
引物15′-gaattcatggccgcgcctgccctgctg-3′引物25′-cccggatccttaagacttcaccaggttcc-3′在0.5毫升離心管建立以下反應體系質粒pMD18-UG 10ng10×Taqase緩沖液 5μl引物1(5mM)2μl引物2(5mM)2μldNTP(10mM)2μlMgCl2(25mM) 2μlTaqase(2U/μl)0.5μl補充雙蒸去離子水至總反應體積50μl，在PE2400型PCR儀進行熱循環反應先94℃變性2分鐘，再94℃變性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸50秒，共進行30個循環，然后72℃延伸5分鐘，溫度降至4℃結束反應。PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶回收，以EcoRI、BamH I酶切，酶切產物插入經過EcoRI、BamHI酶切線性化的真核表達質粒載體pIRESneo。
在0.5毫升離心管建立以下反應體系EcoRI、BamH I酶切的HBxAg基因片段6μl5×T4DNA連接酶緩沖液2μlEcoRI、BamH I酶切的質粒載體pIRESneo 2μlT4DNA連接酶(2U/μl) 1μl混勻，置于16℃水浴16小時，取5μl轉化感受態大腸桿菌DH5α，得到的氨芐青霉素抗性菌落接種于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養液，再提取重組質粒進行酶切鑒定，命名為pIRESneo-UG，其結構如圖4所示，PCMV為巨細胞病毒啟動子，IVS為內含子，IRES為內部核糖體進入位點，Neo為新霉素磷酸轉移酶基因，即G418抗性基因，polyA為牛生長激素轉錄終止序列。
2、UG表達對肝臟腫瘤細胞生長的影響分別將質粒pIRESneo-HBx、pIRESneo-UG以及對照質粒pIRESneo轉染Huh7細胞，轉染方法同前所述，轉染2天后，以胰蛋白酶消化細胞，懸浮于含有5％胎牛血清的DMEM培養液，計數，調整細胞濃度1.0×104/ml，接種96孔板，每天檢測細胞的增殖活性。檢測時，首先吸除培養液，每孔加新鮮不含胎牛血清的DMEM培養液，再加MTS/PES溶液20μl(Promega)，然后將96孔板敞開于細胞培養箱中繼續孵育4小時，于酶標儀上檢測A490-A630，結果如圖5所示，表明UG具有類似于HBxAg的促進細胞增殖的功能，然而其作用強度不及HBxAg。
SEQUENCE LISTING<110>中國人民解放軍第二軍醫大學<120>一種被乙型肝炎病毒X抗原上調表達的基因及其編碼產物與用途<130>說明書，權利要求書<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>745<212>DNA<213>人工序列<400>1tgagcctgcg cggagacgct gggacccacg acgacagaag gcgccgatgg ccgcgcctgc60tgagccctgc gcggggcagg gggtctggaa ccagacagag cctgaacctg ccgccaccag120cctgctgagc ctgtgcttcc tgagaacagc aggggtctgg gtacccccca tgtacctctg180ggtccttggt cccatctacc tcctcttcat ccaccaccat ggccggggct acctccggat240gtccccactc ttcaaagcca agatggtagc tgccatccct gggagcctgg aaccaggcaa300tgttcggggg aggcagggga caggctggaa cctggtgaag tcttaaagta gactcctcct360atcggggtgt agaagggaat ctgttaatca aacagagcaa tattagaaag gctacagagg420tcaactcagt ggaacacggt tctcccaaac agattttgta attccgaaaa tccacgcatg480cgcaaacata cgcatacact cccatgttcc tggacagttt atagctacca taacctggca540ttttccaaaa cataccatgt agactcttgg atacacaagg taattttaga gccacattag600
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權利要求
1.一種被乙型肝炎病毒X抗原上調表達的基因，其特征在于它編碼的多肽具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的一種被乙型肝炎病毒X抗原上調表達的基因，其特征在于它具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.權利要求1或2所述的一種被乙型肝炎病毒X抗原上調表達的基因在乙型肝炎相關肝細胞癌的早期診斷中的應用。
4.權利要求1或2所述的一種被乙型肝炎病毒X抗原上調表達的基因在乙型肝炎相關肝細胞癌的治療中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥工程技術領域，原發性肝癌具有很高的死亡率，但初期通常無明顯癥狀，由于乙型肝炎病毒X抗原反式激活的基因可能參與肝細胞的惡性轉化，本發明的目的就在于篩選在HBV感染的肝細胞中，被HbxAg顯著上調表達的基因，該基因在正常肝組織中不表達或極低水平表達。本發明提供了一種被乙型肝炎病毒X抗原上調表達的基因，它具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發明的基因及其編碼產物可以作為乙型肝炎相關肝細胞癌的早期診斷指標和治療靶點，本發明為進一步探討HBV致病及致癌機制提供新的研究方向。
文檔編號A61K48/00GK1821403SQ200610024200
公開日2006年8月23日 申請日期2006年2月28日 優先權日2006年2月28日
發明者廖小玲, 任浩, 趙平, 戚中田 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學