專利名稱：葫蘆素藥理新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，確切地說它是葫蘆素藥理新用途，涉及葫蘆素在提高白細胞中應用，通過與其它抗腫瘤藥物聯合應用，提高抗腫瘤效果；可以口服、注射或外用。
葫
背景技術：
葫蘆素(Cucurbitacins)屬于19-甲基出現在C-9位上的一類四環三萜化合物，主要分布于葫蘆科植物中，在十字花科、玄參科、秋海棠科、杜英科、四數木科等高等植物及一些大型真菌中也有發現(包括葫蘆素A、B、C、D、E、I、Q等)。中國科學院昆明植物所研究員邱明華帶領科技人員在發現的一系列新型葫蘆素的基礎上，研究了229個幾乎所有的葫蘆素類化合物，提出了新的結構分類模式，由此前的5類結構類型重新分為12類，得到了國際學術界的認可。目前，我國批準生產的葫蘆素又叫葫蘆素BE，為中藥甜瓜蒂(別名苦丁香)提取物，主要含葫蘆素B、E等成分，現有的提取物中葫蘆素B含量為60％以上，純化后葫蘆素B含量可達90％以上。葫蘆素片用于治療慢性肝炎(葫蘆素片藥學通報1986，21(6)357)，經上海、北京、重慶等地十三家醫院臨床，其有效率為75.2％，顯效率為44.6％。臨床上觀察到葫蘆素片能較全面地改善慢性肝炎常見癥狀和主要體征，并有明顯的降酶(S-GPT)、降濁(TTT、ZnTT)和降膽紅質作用，停藥后不引起S-GPT反跳，對蛋白倒置和高球蛋白血癥也有明顯的糾正作用，還能提高慢性肝炎患者的非特異性細胞免疫能力，無明顯毒副作用。除此而外，葫蘆素片還能用于治療原發性肝癌，經上海、北京、廣西等地六家醫院臨床觀察，統計169例，有效率69％，顯效率39％。臨床觀察表明，該藥與5-氟脲嘧啶比較，其改善癥狀、消除肝痛、縮小瘤體、延長生存期、恢復體力等，均優于對照組，且無一般化療藥物的毒副作用(治療肝炎、肝癌新藥葫蘆素片中草藥1987，18(10)21，葫蘆素治療原發性肝癌50例臨床觀察新藥與臨床1984，3(2)21-22，葫蘆素的藥理與臨床應用中草藥1992，23(11)605～608)。最近有作者將葫蘆素片與化療藥聯合，治療中晚期肝癌，中位生存期由單一化療藥的6.1±7.12月，提高到12.5±7.54月(葫蘆素片加化療藥治療中晚期原發性肝癌的臨床療效觀察癌癥1989，8(6)434～436)；另有文發現葫蘆素B，E(II)20μg/ml對癌細胞的殺傷率為82.6％，濃度提高至80μg/ml時，其殺傷率達94.1％，而對正常人淋巴細胞轉化率的影響則分別為90.6％及89.5％，表明(II)對鼻咽癌細胞具有較強的殺傷作用，它同時能促進正常淋巴細胞的轉化功能；在進行葫蘆素片與現有藥物-滅澳靈治療慢性乙肝療效比較時發現，治療組服用葫蘆素片，飯后口服，1日3次，每次2片，以3～6個月為一療程。對照組服用滅澳靈片。結果治療組總有效率為67.4％，而對照組總有效率為35.9％，P＜0.01(葫蘆素片治療慢性乙型肝炎89例療效觀察浙江中醫學院學報1994，18(4)18～19)；有文獻指出，長療程用藥(6周)能明顯抑制肝纖維組織增生，防止肝脂肪變性以及肝硬變的形成和發展。現有劑型為片劑等，對于口服固體制劑而言，由于葫蘆素的水溶性差，片劑的體外溶出波動較大，且溶出慢，如此不利于臨床治療。針對此類問題，有人申請了納米葫蘆素制劑藥物及其制備方法的專利，申請號01103658.3，在該專利申請中，公開了一種采用微波萃取、減壓濃縮、超音速射流技術噴霧干燥等步驟制成的納米葫蘆素制劑藥物，其顆粒細度達1200-1500目，粒徑為0.1-200nm，其中絕大部分粒徑小于100nm。該藥物生物利用度高，治療效果顯著。除此之外，尚有如下一些專利葫蘆素環糊精包合物及其制劑申請(專利)號02153647.3；葫蘆素脂質體組方及其制劑申請(專利)號02144633.4；葫蘆素滴丸及其制備方法申請(專利)號200310100943.3。亦有文獻將葫蘆素制備成乳劑，并考察了制備工藝(中南藥學2004，2(2)73-76)。在該文獻中，作者采用大豆油制備脂肪乳劑，其油相的濃度為20％，磷脂濃度為1.2％，甘油濃度為2.1％，藥物用量為0.01％(0.1mg/ml)，所得乳劑于115℃滅菌30分鐘，粒度為390nm。作者還考察了pH值對藥物的穩定性影響，發現滅菌前將pH值調節為8.50、9.50，滅菌后的pH值為6.96、7.30，而藥物的含量大大下降，特別是后者，含量下降約10％。為了解決這一問題，有專利申請了可過濾除菌的乳劑。
最近，美國的研究人員報道，葫蘆素抗癌的作用機理為抑制STAT3活性，Bolleddula Jayaprakasam等比較了葫蘆素B、D、E、I與阿霉素對人直腸癌(HCT-116)、乳腺癌(MCF-7)、肺癌(NCI-H460)和中樞神經系統癌(SF-268)細胞的抗癌活性，結果表明，在所選擇的四種瘤細胞中，葫蘆素B在0.4μM時，對人直腸癌的抑制率為81.5％、人乳腺癌87％；在0.1μM時對人肺癌的抑制率為96％；0.05μM對人CNS癌的抑制率為92％，均高于阿霉素的抑制率(分別為64％、47％、45％、71％，3μM)，即葫蘆素B對相應的瘤細胞毒性至少是阿霉素的7.5、30、60倍(BolleddulaJayaprakasam et al.Anticancer and antiinflammatoru activity of cucurbitacinsfrom Cucurbita andreana Cancer Letters 2003，18911～16)。在同一篇文獻中，作者還發現，葫蘆素B對COX-2有選擇性抑制作用。另外，JuditBartalis等報道葫蘆素B抗肝癌細胞(HepG2)的IC50為27.7μM，葫蘆素E為15.3μM(Judit Bartalis et al Relationship between cucurbitacinsreversed-phase high-performance liquid chromatography hydrophobicity indexand basal cytotoxicity on HepG2 cells Journal of Chromatography B，818(2005)159～166)。

發明內容
本發明的目的是提供葫蘆素藥理新用途，即葫蘆素及其藥物組合物在提高白細胞中應用，通過與其它抗腫瘤藥物聯合應用，提高抗腫瘤效果；可以口服、注射或外用。本發明是通過反復篩選和試驗得出的。
至今，所有的文獻中尚未見有關采用葫蘆素來提高白細胞，減少放、化療的毒副作用，提高聯合用藥的抗腫瘤效果。我們經過大量試驗發現，葫蘆素可以提高白細胞，明顯改善化療藥物對骨髓的傷害作用，可以與化療藥物聯合，提高療效，減低骨髓抑制作用。
具體實施例方式本發明的詳細組分由下列實施例給出，但本發明的保護范圍，不僅局限于此。
實施例1、葫蘆素提取物(葫蘆素B含量大于50％)1、藥理實驗樣品-葫蘆素BE混懸劑的制備采用購買的葫蘆素BE原料，以CMC-Na為助懸劑，按照常規方法配制混懸劑，濃度為0.1mg/ml。
2、藥理實驗正常昆明小白鼠48只，隨機分為8組，每組6只。隔天給藥，CTX腹腔注射給藥，葫蘆素混懸劑灌胃給藥，隔天給藥，給藥5次，給藥結束后第二天小鼠眼眶后靜脈采血20μl，用常規血白細胞計數法進行計數。結果見表1。
表1原料混懸口服治療組和對照組的白細胞計數結果(×109·L-1)

注與正常組比較◇p＜0.05；與CTX組比較×p＜0.05××p＜0.01實施例2、葫蘆素提取物(葫蘆素B含量大于80％)1、藥理實驗樣品-葫蘆素脂質體的制備將葫蘆素與蛋黃卵磷脂按照1∶300(W/W)投料，以適當量的乙醇溶解，減壓蒸干乙醇，加入水化介質水化脂質膜，最后經微射流進行分散，過0.22μm微孔濾膜除菌，粒度約160nm，即得。
2、藥理實驗H22荷瘤小鼠用手術刀割破尾靜脈采血，挑選體重20±2g、基礎外周血白細胞(WBC)接近者隨機分為7組，每組10只。另設一組正常小鼠作空白對照(給予葡萄糖注射液)。自造模后第二天開始給藥，氟尿嘧啶對照組于第1、3、5、7、9天給藥，其余組連續給藥10天，每日一次。除灌胃組外其余組給藥途徑均為尾靜脈注射。第11天各組小鼠眼眶后靜脈采血20μl，用常規血白細胞計數法進行計數。結果見表2。
表2、脂質體注射液治療組和對照組的白細胞計數結果(×109·L-1)

注與正常對照組比較Δp＜0.05ΔΔp＜0.01與模型對照組比較◇p＜0.05◇◇p＜0.01與氟尿嘧啶組比較×p＜0.05××p＜0.01外周血白細胞計數實驗結果表明，高、中、低劑量組相對于氟尿嘧啶組有非常顯著性差異(P＜0.01)，提示葫蘆素脂質體注射液在治療腫瘤的同時(抑瘤率分別為48.2％、45.2％、40.4％、25，4％、32.9％)，沒有骨髓抑制作用甚至有升白趨勢，明顯優于抑制骨髓造血功能的單純化療藥治療。
實施例3、葫蘆素提取物(葫蘆素B含量大于90％)1、藥理實驗樣品-葫蘆素乳劑的制備處方組成葫蘆素0.01g，HS15 1.5g，大豆磷脂1g，中鏈油(辛葵酸甘油酯)5g，大豆油5g，維生素E0.1g，甘油2.5g，鹽酸適量，其余為注射用水，共100ml。
制造方法1)將中鏈油、大豆油、維生素E置于燒杯中，加熱至60℃，加入大豆磷脂、HS15，強烈攪拌分散至溶解，加入藥物，攪拌溶解；2)水相的制備甘油加入注射用水中，在40℃下攪拌溶解(必要時用活性炭除熱原)；3)將水相加入油相，強烈攪拌5min，形成初乳；4)過均質儀，第一步調節勻化壓力至4000psi，第二步再調節至18000psi，將溶液反復勻化，得到均勻的乳劑，過0.3μm微孔濾膜除菌，分裝，充氮氣，封口，滅菌即得本品。平均粒徑為183nm。
2、藥理實驗正常昆明小白鼠78只，隨機分為13組，每組6只。隔天給藥，CTX(環磷酰胺)及其復方組給藥5次，多烯紫杉醇、紫杉醇、阿霉素(DXR)及各自的聯合組給藥3次，作空白對照給予葡萄糖注射液。給藥結束后，各組小鼠眼眶后靜脈采血20μl，用常規血白細胞計數法進行計數。結果見表3。
表3葫蘆素乳劑對白細胞計數的影響結果(×109·L-1)

注與空白對照組比較p◇＜0.05、p◇◇＜0.01；與相對應的化療組比較p×＜0.05注CTX與葫蘆素的比例為40mg/0.1mg(400/1)；DXR與葫蘆素的比例為10mg/0.2mg(50/1)；多烯紫杉醇與葫蘆素的比例為50mg/0.3mg(500/3)；紫杉醇與葫蘆素的聯合應用比例為100mg/0.3mg(1000/3)。
實施例4、自乳化組方口服給藥1、藥理實驗樣品-參照我們申請的專利“實施例12葫蘆素BE”(CN200410021536.8)進行配制。
2、藥理實驗正常昆明小白鼠30只，隨機分為5組，每組6只。隔天給藥，CTX腹腔注射(IP)給藥，葫蘆素自乳化組方灌胃給藥，隔天給藥，給藥5次，給藥結束后第二天小鼠眼眶后靜脈采血20μl，用常規血白細胞計數法進行計數。結果見表4。
表4、自乳化組方口服治療組和對照組的白細胞計數結果(×109·L-1)

注與正常組比較◇p＜0.05；與CTX組比較×p＜0.05實施例5、聯合應用提高療效將H22模型小鼠接種24h后隨機分為7組，每組10只①模型對照組(給予葡萄糖注射液)②CTX(5mg/kg)(占復方的98.9％)③CTX(10mg/kg)(占復方的99.45％)④CTX(20mg/kg)(占復方的99.7％)⑤葫蘆素脂質體注射液(0.055mg·kg-1)⑥葫蘆素脂質體注射液(0.055mg·kg-1)+CTX(5mg/kg)⑦葫蘆素脂質體注射液(0.055mg·kg-1)+CTX(10mg/kg)。CTX低、中、高化療組分別于第1、3、5、7天0.1ml/10g腹腔注射5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，給藥四次。葫蘆素脂質體注射液組連續7天每日1次尾靜脈注射0.055mg·kg-1。葫蘆素脂質體注射液合并CTX化療藥組(5mg/kg、10mg/kg)相應于第1、3、5、7天腹腔注射CTX，給藥四次。第8天稱重處死，取瘤塊稱重，計算。結果見表5。
表5、與CTX聯用對小鼠肝癌H22的抑瘤作用研究(x±SD)


注與模型組比較，*P＜0.05 **P＜0.01與對應CTX組比較，Δp＜0.05ΔΔp＜0.0權利要求
1.葫蘆素藥理新用途，其特征在于將葫蘆素藥應用于制備提高外周血白細胞的藥物，或與其它抗腫瘤藥物組合制備減少化療藥物毒副作用，提高抗腫瘤藥物效果的復方制劑。
2.根據權利要求1所述的葫蘆素藥理新用途，其特征在于所述的葫蘆素為葫蘆科植物、十字花科、玄參科、秋海棠科、杜英科、四數木科植物及一些大型真菌中提取的一類四環三萜化合物。
3.根據權利要求1或2所述的葫蘆素藥理新用途，其特征在于所述的葫蘆素主要成分為葫蘆素B，也可以包括葫蘆素A、葫蘆素C、葫蘆素D、葫蘆素E、葫蘆素I、葫蘆素Q其中的一種或者多種成分；葫蘆素B含量大于50％。
4.根據權利要求1所述的葫蘆素藥理新用途，其特征在于給藥途徑包括外用、口服和注射給藥；給藥劑型為片劑、散劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、糖漿劑、口服液、乳劑、納米粒、脂質體、軟膏劑、貼劑、注射劑。
5.根據權利要求1所述的葫蘆素藥理新用途，其特征在于，所述葫蘆素給藥劑量按照總葫蘆素計算，小鼠以0.001mg/公斤～1mg/公斤體重給藥，健康成人用劑量為0.1mg～5mg/日。
6.根據權利要求1或4所述葫蘆素藥理新用途，其特征在于在組方制劑中，葫蘆素占0.0001％～99.9％重量。
全文摘要
本發明公開了葫蘆素藥理新用途，將葫蘆素應用于制備提高外周血白細胞的藥物，或與其它抗腫瘤藥物組合制備減少化療藥物毒副作用，提高抗腫瘤藥物效果的復方制劑。所述的葫蘆素為葫蘆科植物、十字花科、玄參科、秋海棠科、杜英科、四數木科植物及一些大型真菌中提取的一類四環三萜化合物。采用葫蘆素來提高白細胞，減少放、化療的毒副作用，提高聯合用藥的抗腫瘤效果。明顯改善化療藥物對骨髓的傷害作用，可以與化療藥物聯合，提高療效，減低骨髓抑制作用。
文檔編號A61K9/127GK1883484SQ200610046738
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月30日 優先權日2006年5月30日
發明者鄧意輝, 陳大為, 馬恩龍, 曹穎林, 黃漢洲, 李必昌, 王紹寧, 王寧, 沈琳, 王雋偉 申請人:沈陽藥科大學, 江蘇亞勝生物科技開發有限公司