專利名稱：：連翹酯苷在制備治療或預防急慢性肝損傷及肝纖維化的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于治療肝病的藥物，具體涉及連翹酯苷在預防或治療因病毒、化學物質、藥物引起的急慢性肝損傷及肝纖維化藥物中的應用。
背景技術：
：肝炎指肝臟發炎。許多病原微生物如病毒、細菌、真菌、立克次體、螺旋體及某些原蟲和寄生蟲的感染都可能引起肝臟發炎；各種毒物(如砒霜)、毒素(細菌的內外毒素)、化學物質(乙醇等)和某些藥物(如雷米封、消炎痛、氯丙嗪等)的中毒都可引起中毒性肝炎。由藥物中毒引起的稱為藥物性肝炎；由化學物質引起的肝炎稱為化學性肝炎；由病毒引起的肝炎稱病毒性肝炎，該病毒包括各類肝炎病毒、皰疹病毒、EB病毒、巨細胞病毒、水痘病毒、腸道病毒及腺病毒等。我國是病毒性肝炎的高發地區，五型病毒性肝炎在國內均有發生和流行。據衛生防疫部門的疫情報告，我國病毒性肝炎的年發病率為950/10萬，在法定傳染病中其發病率位居第三，僅次于感染性腹瀉和流行性感冒。而根據1988年美國的疫情報告，其病毒性肝炎的年發病率僅為23.1/10萬，我國的發病率為美國的41倍多。肝炎使患者在生活，社交，就學，就業等發面受到不同程度的限制，給家庭，社會造成極大的精神負擔。慢性肝炎病程長，難治愈，易反復，并引起癌癥的發生，患者的身心健康負擔很大。目前對肝炎的治療，西藥有干擾素，干擾素誘導劑、核苷衍生物等等。干擾素為首選藥物，但存在用藥劑量大，費用高，毒副作用大，有效率不高，停藥后易復發等缺點。中藥的治療效果亦不能令人滿意，其藥品療效不確切，治療期長，費用高，長期服用會產生副作用，有損于身體的健康。迫切需要提供新的治療肝炎有效藥物。肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征。病毒、乙醇、自身免疫性疾病等病因均可引起肝細胞壞死、再生和持續性纖維增生，最終導致肝硬化。現已證實肝纖維化是可逆病變，肝硬化則是不可逆的。因此，在慢性肝病的治療過程中，肝纖維化的防治占有重要地位。本發明人通過大量的實驗研究，發明了連翹酯苷在制備治療或預防急慢性肝損傷及肝纖維化的藥物中的應用。
發明內容本發明提供了連翹酯苷在制備治療或預防急性肝損傷的藥物中的應用。本發明提供了連翹酯苷在制備治療或預防慢性肝損傷的藥物中的應用。本發明提供了連翹酯苷在制備治療或預防肝纖維化的藥物中的應用。本發明提供的連翹酯苷在用于上述任一用途時，其注射使用劑量范圍為25mg800mg，優選劑量范圍為25mg400mg;其灌胃使用劑量范圍為50mg1500mg，優選劑量范圍為50mg750mg。本發明還提供了以連翹酯苷為活性成分的藥物，其可以以注射劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、糖漿等劑型存在，優選為凍干粉針和膠囊。本發明提供的各種劑型均可以采用藥學常規方法制備而成。本發明提供的連翹酯苷可以按文獻[張立偉等，連翹酯甙分離提取及抑制彈性蛋白酶活性研究，化學研究與應用，2002年4月]的方法獲得,也可以按本發明提供的方法制備而得。-本發明人通過下列試驗證實了該藥物具有抗肝炎、肝纖維化及肝損傷的作用，但并不意味著本發明僅限于此。具體實施方式-制備例l連翹酯苷的制備取連翹果實5Kg，粉碎至可過三號篩，加50%乙醇室溫提取兩次，第一次用20倍量乙醇溶液，浸泡4小時，第二次加10倍量乙醇溶液，室溫浸泡3小時。合并兩次提取液，調p^4左右，低溫減壓脫醇，上NK-9型大孔樹脂柱，先水洗3個柱體積，再用10%的乙醇水溶液洗5個柱體積，然后用40%乙醇洗脫5個柱體積。收集40%醇洗脫流出液，70。C減壓干燥，得含量為90.4%的連翹酯苷21.2經。制備例2連翹酯苷的制備取連翹葉lKg，粉碎后加50%乙醇室溫提取兩次，第一次用20倍量乙醇溶液，浸泡4小時，第二次加IO倍量乙醇溶液，室溫浸泡3小時。合并兩次提取液，調pH-4左右，低溫減壓脫醇，上聚酰胺樹脂柱，先水洗3個柱體積，再用25%的乙醇水溶液洗5個柱體積，然后用40%乙醇洗脫5個柱體積。收集40%醇洗脫流出液，7(TC減壓濃縮，低溫放置兩天，離心，干燥沉淀，得含量為95.1%的連翹酯苷36.8g。制備例3連翹酯苷凍干粉針制備取連翹酯苷20.0g，加注射用水2000ml使其溶解，，加甘露醇8g，攪拌溶解，超濾，得到無熱源的澄清液，灌入10ml西林瓶中，2ml/只，按凍干粉針工藝凍干，制成每支含連翹酯苷20.0mg的凍干粉針。制備例4連翹酯苷片劑制備稱取lOOg連翹酯苷，35g糖粉,40g乳糖和23g羧甲基淀粉鈉充分混合均勻后過100目篩，加入3呢PVPK3。水溶液適量制軟材，20目篩制粒，6(TC干燥3小時，18目篩整粒，加入2g硬脂酸鎂，混合均勻后淺凹沖壓片，調節片重約200mg，即得。試驗例l:連翹酯苷對四氯化碳引起小鼠急性肝損傷的影響1.1材料四氯化碳(分析純，煙臺三和化學試劑公司，批號050122);連翹酯苷(山東省天然藥物工程技術研究中心提供，含量95%，批號051012);聯苯雙酯(滴丸，北京協和制藥廠，規格L5mg，批號050512);ALT/GPT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060281);ASP/GOT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060201)全自動生化分析儀(意大利)昆明種小鼠，體重18-22g，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供，合格證號200203005。雌雄兼用。1.2方法小鼠130只，隨機分為13組，即正常對照組、模型組、聯苯雙酯灌胃10mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射2.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射25mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射75mg/kg組組、連翹酯苷靜脈注射150mg/kg組組、連翹酯苷灌胃5mg/kg組、連翹酯苷灌胃10mg/kg組、連翹酯苷灌胃50mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組、連翹酯苷灌胃300mg/kg組，各靜脈給藥組連續給藥3天，各灌胃給藥組連續給藥7天，末次給藥前16小時除對照組外各組用0.2%的四氯化碳油溶液腹腔注射，注射體積0.25m1/只，隨即禁食16小時，末次給藥1小時后眼眶采血，離心(4000rpm,10min)，收集血清，用藥盒檢測ALT/GPT、ASP/GOT活性。數據以數據用^士s表示，以組間1:檢驗進行統計學處理。1.3結果結果如表l所示，連翹酯苷靜脈注射5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射25mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射75mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射150mg/kg組、連翹酯苷灌胃10mg/kg組、連翹酯苷灌胃50mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組、連翹酯苷灌胃300mg/kg組明顯降低GOT、GPT水平(與模型對照組比較，p〈0.05或0.01)。連翹酯苷灌胃150mg/kg組降低GOT、GPT水平與連翹酯苷灌胃300mg/kg組比較，無顯著性差異；連翹酯苷靜脈注射75mg/kg組降低GOT、GPT水平與連翹酯苷靜脈注射150mg/kg組比較，無顯著性差異。表1連翹酯苷對CCL肝損傷小鼠的GOT、GPT的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與模型組比較'代0.05，"代0.01,試驗例2:連翹酯苷對D-半乳糖胺致小鼠肝損傷的保護作用2.1材料:四氯化碳(分析純，煙臺三和化學試劑公司，批號050122);連翹酯苷(山東省天然藥物工程技術研究中心提供，含量95%，批號051012);聯苯雙酯(滴丸，北京協和制藥廠，規格1.5mg，批號050512);ALT/GPT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060281);ASP/GOT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060201);D-半乳糖胺(SIGMA公司生產)。全自動生化分析儀(意大利)，昆明種小鼠，體重18-22g，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供，合格證號200203005。雌雄兼用。2.2方法:小鼠130只，隨機分為13組，即正常對照組、模型組、聯苯雙酯灌胃10mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射2.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射25mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射75mg/kg組組、連翹酯苷靜脈注射150mg/kg組組、連翹酯苷灌胃5mg/kg組、連翹酯苷灌胃10mg/kg組、連翹酯苷灌胃50mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組、連翹酯苷灌胃300mg/kg組，各靜脈給藥組連續給藥3天，各灌胃給藥組連續給藥7天，末次給藥lh后除對照組外各組用150mg/kg的D-半乳糖胺造模，禁食16h后眼眶采血，離心(4000rpm，10min)，收集血清，用藥盒檢測ALT/GPT、ASP/G0T活性。數據以數據用x土s表示，以組間t檢驗進行統計學處理。2.3結果如表2所示，連翹酯苷靜脈注射5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射25mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射75呢/kg組、連翹酯苷靜脈注射150mg/kg組、連翹酯苷灌胃10mg/kg組、連翹酯苷灌胃50mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組、連翹酯苷灌胃300mg/kg組明顯降低GOT、GPT水平(與模型對照組比較，p〈0.05或0.01)。連翹酯苷灌胃150mg/kg組降低GOT、GPT水平與連翹酯苷灌胃300mg/kg組比較，無顯著性差異；連翹酯苷靜脈注射75mg/kg組降低GOT、GPT水平與連翹酯苷靜脈注射150mg/kg組比較，無顯著性差異。表2連翹酯苷對D-半乳糖胺致肝損傷小鼠的GOT、GPT的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>與模型組比較p<0.05，"p<0.01,試驗例3:連翹酯苷對大鼠慢性肝損傷的影響3.1藥品與試劑連翹酯苷(山東省天然藥物工程技術研究中心提供，含量95%，批號051012);聯苯雙酯(滴丸，北京協和制藥廠，規格1.5mg，批號050512);ALT/GPT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060281);ASP/GOT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060201);乙醇(分析純，煙臺三和化學試劑公司，批號050325)。實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重150-200g，SD大鼠，山東綠葉天然藥物研究開發公司實驗動物中心提供，合格號SYXK(魯)20030020。3.2實驗方法大鼠130只，隨機分為13組，即正常對照組、模型組、聯苯雙酯組灌胃5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射1mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射2.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射12.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射40mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射80mg/kg組、連翹酯苷灌胃2.5mg/kg組、連翹酯苷灌胃5mg/kg組、連翹酯苷灌胃25mg/kg組、連翹酯苷灌胃75mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組，每組10只。除正常組外，各組首次給予sc四氯化碳原液5ml/kg體重，以后每周2次sc25X四氯化碳溶液(橄欖油釋釋)2ml/kg體重,連續20周。除正常對照組外,其余按上述方法制備慢性肝損傷模型,于實驗第8周時，開始給藥，連續給藥12周，給藥結束后用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉，解剖，腹主動脈采血，留取肝組織，部分用10%中性福爾馬林溶液固定，24—48h內制石蠟塊。肝組織病理學檢查采用HE染色，對慢性肝損傷大鼠病理組織學改變進行評分，肝細胞漿疏松化分為0-3級，肝細胞脂肪變分為0-3級，肝細胞壞死分為0-3級，肝間質纖維增生分為0-3級，對大鼠病理組織學改變分數進行秩和檢驗。血樣離心(4000rpm,10min),收集血清，用藥盒檢測ALT/GPT、ASP/GOT活性。數據以數據用^土s表示，以組間t檢驗進行統計學處理。3.3實驗結果:如表3所示，連翹酯苷靜脈注射2.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射12.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射40mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射80mg/kg組、連翹酯苷灌胃5mg/kg組、連翹酯苷灌胃25mg/kg組、連翹酯苷灌胃75mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組明顯降低GOT、GPT水平及肝指數(與模型對照組比較，p<0.05或0.01)。連翹酯苷灌胃75mg/kg組降低GOT、GPT水平及肝指數與連翹酯苷灌胃150mg/kg組比較，無顯著性差異；連翹酯苷靜脈注射40mg/kg組降低GOT、GPT水平及肝指數與連翹酯苷靜脈注射80mg/kg組比較，無顯著性差異。肝組織病理變化顯示CC14慢性肝損組大鼠，正常肝小葉結構破壞,有廣泛的脂肪變性，肝細胞壞死及不同程度的間質纖維增生，而經連翹酯苷治療的大鼠,損傷性病理變化減輕。如表4所示，連翹酯苷靜脈注射2.5rag/kg組、連翹酯苷靜脈注射12.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射40mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射80mg/kg組、連翹酯苷灌胃5mg/kg組、連翹酯苷灌胃25mg/kg組、連翹酯苷灌胃75mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組明顯降低肝細胞漿疏松化、肝細胞脂肪變、肝細胞壞死及肝間質纖維增生(與模型對照組比較，P〈0.05或O.Ol)。連翹酯苷灌胃75mg/kg組降低肝細胞漿疏松化、肝細胞脂肪變、肝細胞壞死及肝間質纖維增生與連翹酯苷灌胃150mg/kg組比較，無顯著性差異；連翹酯苷靜脈注射40mg/kg組肝細胞槳疏松化、肝細胞脂肪變、肝細胞壞死及肝間質纖維增生與連翹酯苷靜脈注射80mg/kg組比較，無顯著性差異。表3連翹酯苷對慢性肝損傷的大鼠GOT、GPT水平及肝指數影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與模型組比較'代0.05，"代0.01表4連翹酯苷對慢性肝損傷的大鼠病理組織學改變的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與模型組比較'代0.05，"代0.01試驗例4:連翹酯苷對肝纖維化的影響4.1藥品與試劑連翹酯苷由山東省天然藥物工程技術研究中心提供，含量95%以上，批號041205;文迪雅(馬來酸羅格列酮片，GlaxoSmithKline公司，批號051023)HA(透明質酸)、LN(層粘連蛋白)及PcIII(III型膠原)放免試劑盒購買于上海海研醫學中心；羥脯氨酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重150-200g，SD大鼠，山東綠葉天然藥物研究開發公司實驗動物中心提供，合格號SYXK(魯)20030020。4.2實驗方法大鼠130只，隨機分為13組，即正常對照組、模型組、羅格列酮組灌胃8mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射1mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射2.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射12.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射40mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射80mg/kg組、連翹酯苷灌胃2.5mg/kg組、連翹酯苷灌胃5mg/kg組、連翹酯苷灌胃25mg/kg組、連翹酯苷灌胃75mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組，每組10只。大鼠肝纖維化模型復制及各組處置方法參考吳孟超等復制大鼠肝纖維化模型的方法吳孟超，楊廣順.大鼠肝硬變模型復制的研究.中華實驗外科雜志，1984，1(4):145—147，除正常對照組外，各組每3d每100g體重皮下注射40免四氯化碳油溶液0.3ml，首劑量加倍，正常對照組大鼠每3d皮下注射油溶液0.3ml/100g體重，6周后，各組開始給藥，連續給藥6周，給藥結束后用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉，解剖，腹主動脈采血，留取肝組織，部分用10%中性福爾馬林溶液固定，24—48h內制石蠟塊。肝組織病理學檢查采用HE染色，纖維增生程度分為0-4級栗坤，趙玉珍，朱秋霜等.川芎嗪對老齡小鼠心、肝超氧化物歧化酶活力的影響.黑龍江醫藥科學，1998;21:4—5，對血清中HA(透明質酸)、LN(層粘連蛋白)及PcIII(III型膠原)、及肝中HYP(羥脯氨酸)進行測定，HA、LN、PcIII、HYP按檢測試劑盒測定方法測定。4.3實驗結果病理學檢查正常對照組大鼠肝臟結構正常；模型組大鼠肝臟12周均出現明顯的纖維化;連翹酯苷各組中纖維化程度均較模型組輕。光鏡觀察HE常規染色和VG膠原染色肝組織切片顯示，肝纖維化模型對照組大鼠肝組織中可見肝細胞脂肪變性，壞死，炎細胞浸潤；匯管區內膠原纖維沉積，Henny管增生；纖維結締組織增生明顯，纖維間隔增粗，并有典型假小葉形成。連翹酯苷治療組大鼠肝組織纖維結締組織增生程度減輕，纖維間隔變細，假小葉形成不明顯。對各組纖維增生程度分值進行秩和檢驗。結果見表5，連翹酯苷靜脈注射2.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射12.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射40mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射80mg/kg組、連翹酯苷灌胃5mg/kg組、連翹酯苷灌胃25mg/kg組、連翹酯苷灌胃75mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組明顯降低纖維增生程度(與模型對照組比較，p〈0.05或0.01)。電鏡觀察正常對照組大鼠肝細胞間緊密相連，細胞內各種細胞器分布規整，結構典型。血竇排列整齊，Disse腔內可見肝貯脂細胞，細胞質內有脂滴。模型對照組大鼠肝組織中則出現典型的肝細胞損傷結構，相鄰肝細胞間隙增寬，肝細胞變性壞死，核固縮，細胞質內出現大小不等、分布不規則的脂滴。肝組織中存在輕重不等的纖維化病變。肝竇毛細血管化，Disse間隙內可見較多成纖維細胞(活化的肝貯脂細胞)，且周圍有大量膠原纖維沉積。匯管區內可出現大量的膠原纖維。連翹酯苷治療組中，肝細胞損傷有不同程度的減輕，肝細胞間隙較緊密，細胞質內脂肪小滴減少，細胞內結構趨向正常。肝纖維化病變不明顯，肝血竇和Disse間隙內膠原纖維沉積及成纖維樣細胞數量減少。對各組HA、LN、PcIII、HYP進行T檢驗。結果見表6，連翹酯苷靜脈注射2.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射12.5mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射40mg/kg組、連翹酯苷靜脈注射80mg/kg組、連翹酯苷灌胃5mg/kg組、連翹酯苷灌胃25mg/kg組、連翹酯苷灌胃75mg/kg組、連翹酯苷灌胃150mg/kg組明顯降低HA、LN、PcIII、HYP水平(與模型對照組比較，p〈0.05或0.01)。連翹酯苷灌胃75mg/kg組降低HA、LN、PcIII、HYP水平與連翹酯苷灌胃150mg/kg組比較，無顯著性差異；連翹酯苷靜脈注射40mg/kg組降低HA、LN、PcIII、HYP水平與連翹酯苷靜脈注射80mg/kg組比較，無顯著性差異。表5連翹酯苷對大鼠肝纖維化病理形態的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求1.連翹酯苷在制備治療或預防急性肝損傷的藥物中的用途。2.連翹酯苷在制備治療或預防慢性肝損傷的藥物中的用途。3.連翹酯苷在制備治療或預防肝纖維化的藥物中的用途。4.根據權利要求1-3任一所述的用途，其注射使用劑量范圍為25mg800mg。5.根據權利要求4所述的用途，其注射使用劑量范圍為25rag40()mg。6.根據權利要求l-3任一所述的用途，其灌胃使用劑量范圍為50rag1500mg。7.根據權利要求6所述的用途，其灌胃使用劑量范圍為50mg750mg。8.以連翹酯苷為活性成分的用于治療或預防急慢性肝損傷及肝纖維化的藥物。9.根據權利要求8所述的藥物，其可以是注射劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊或糖漿劑。10.根據權利要求9所述的藥物，其可以是凍干粉針或膠囊。全文摘要本發明涉及連翹酯苷在制備治療或預防急慢性肝損傷及肝纖維化的藥物中的應用。連翹酯苷在用于上述任一用途時，其注射使用劑量范圍為25mg～800mg；其灌胃使用劑量范圍為50mg～1500mg。本發明還提供了以連翹酯苷為活性成分的藥物，其可以以注射劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、糖漿等劑型存在，優選為凍干粉針和膠囊。文檔編號A61K31/7028GK101134040SQ200610068588公開日2008年3月5日申請日期2006年8月30日優先權日2006年8月30日發明者曲桂武,田京偉,蔣王林申請人:山東綠葉天然藥物研究開發有限公司