專利名稱：一種防治結直腸癌的基因藥物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子藥物學、分子醫學和疾病防治領域，具體涉及基于基因kallistatin和vasostatin的兩種治療結直腸癌的基因藥物、制備工藝、以及采用該藥物進行結直腸癌的治療，以及增強結直腸癌化療或放療療效的應用。
背景技術：
結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發病率占全球常見腫瘤的第3位。在歐洲和美國結直腸癌的發病率則排在第2位，僅次于肺癌(男性)和乳癌(女性)。目前結直腸癌的新發病例超過90萬/年，死亡病例為50萬/年。
結直腸癌的發病原因為遺傳因素和環境因素的結合。遺傳因素約占20％，主要為遺傳性易發病，如家族性腺瘤性息肉，遺傳性非息肉病性結腸癌，以及其它家族性腫瘤。環境因素約占80％，主要為飲食結構中低纖維，低蔬菜，低葉酸，高脂肪，高牛羊肉；抽煙，喝酒；體力活動缺乏等。盡管結直腸癌可以發生于不同的年齡，產生于不同的原因，但一個特點是共同的即均經過從正常上皮細胞，轉化為息肉，再變化為腫瘤細胞的過程。在這個過程中，可以發生一系列遺傳基因的變化，如抑癌基因的失活，致癌基因的活化；分子生物學研究發現有p53，Apc和k-ras基因的突變，APC蛋白的變化，微衛星DNA的不穩定，基因雜合性丟失等。遺傳性生殖細胞缺陷，或環境因素引起的體細胞的突變，都可以促進結直腸癌的的發展。
手術治療是目前結直腸癌最主要的治療手段。但結腸直腸癌的手術治療預后與其所處階段密切相關。在20世紀80年代，Dukes’A期、Dukes’B期、Dukes’C期的腫瘤病人5年生存率分別為82％、73％、40％。隨著診療技術上的進步，新的治療策略使得結腸直腸癌病人的手術治療后5年生存率均得到了一定的提高，發達國家Dukes’A期提高為90％，Dukes’B期提高為75％。但在國內，由于早期發現、早期診斷率很低，往往確診后即為腫瘤晚期或已轉移，手術治療的效果非常不理想，術后總體的五年生存率僅在50％-60％。對于腫瘤晚期病人和術后腫瘤轉移病人，特別需要其它輔助性手段，在腫瘤細胞長大并危害病人身體之前，將潛在的腫瘤細胞加以徹底消滅。放療和化療作為的常規輔助性治療手段，雖然可以取得明顯的效果，但由于其固有的嚴重不良反應，臨床上迫切需要新的結直腸癌治療藥物的開發。
腫瘤的生長浸潤依賴于腫瘤內新生血管的形成，以腫瘤新生血管為靶點的抗血管生成治療已成為抗腫瘤研究的熱點。
在眾多血管生成抑制因子中，Kallistatin是一新型的具有抗血管生成作用的內源性蛋白(Miao RQ，et al.Blood 2002；1003245-52)，其抗血管生成作用與內皮抑素類似。內皮抑素通過其肝素結合活性介導其對血管生成的抑制作用。各種生長因子必須結合細胞表面兩種不同的受體，才能引發一個信號。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受體，在調節多種生長因子的作用時，發揮關鍵作用。許多生長因子，如VEGF和bFGF是肝素結合生長因子，VEGF和bFGF與內皮細胞表面的HSPGs結合，可以調節它們與專屬受體的結合。Kallistatin是肝素結合蛋白，可以與VEGF和bFGF，以及其它含有肝素結合區的生長因子競爭結合HSPGs，因此阻斷了這些生長因子與HSPGs的結合，阻斷了這些生長因子引發的血管生成事件。另外，kallistatin還是絲氨酸蛋白酶抑制劑的一員，最初被認為是組織胰激肽原酶結合蛋白。越來越多的證據顯示，組織胰激肽原酶在腫瘤相關事件中非常重要，其中包括腫瘤生長調節，血管生成，侵入和轉移等。
Vasostatin因可以顯著抑制內皮細胞的增殖和小鼠腫瘤的生長(Pike SE，et al.J ExpMed 1998；1882349-56)，也是腫瘤抗血管生成的良好候選對象。
Kallistatin和vasostatin通過循環系統分布后，可以靶向性作用于腫瘤活化的內皮細胞。因為宿主的大部分內皮細胞處于靜息狀態，僅在傷口愈合和再生等生理性血管生成過程中，內皮細胞才處于活化狀態。腫瘤生成血管的內皮細胞增殖活躍，分化度低，而成人組織的大部分內皮細胞增殖非常遲緩，為高分化表型。因此在循環系統的kallistatin和vasostatin，可以選擇性作用于應用腫瘤新生成血管。
抗血管生成治療腫瘤被賦予了極大的希望，但已進行的有關臨床實驗卻未取得預期的效果。其中最關鍵的原因是瘤體內難以達到有效藥物濃度，或不能長時間維持有效藥物濃度。
基因治療藥物，可以實現目的蛋白在人體內的長期穩定的表達，為解決上述問題提供了思路。AAV(腺相關病毒)作為基因治療的載體，具有可以同時感染分裂和非分裂細胞，無明顯致病性，表達時間長等優點，是非常具備應用前景的載體之一，本課題組在先期的專利申請(CN1836732A)中公開了rAAV(重組腺相關病毒)介導的kallistatin和vasostatin基因藥物，其在體內和體外均可以高效表達kallistatin和vasostatin，可以顯著抑制腫瘤血管的生成。
AAV作為基因治療的載體，具有可以同時感染分裂和非分裂細胞，無明顯致病性，表達時間長等優點，是非常具備應用前景的載體之一，但病毒滴度低，轉染效率差等缺點，限制了其進一步的應用。目前已發現多種血清型的AAV，對不同的組織和細胞有不同的感染效率，原因在于不同血清型AAV的衣殼蛋白的差別。對AAV載體的選擇和優化，將是提高感染效率的有效手段。
對于結直腸癌中晚期病人，腫瘤已侵入黏膜肌層，以及腸壁全層，甚至已經發生了淋巴結轉移，現有的治療方法已經難以有效治療。迄今，尚無人采用rAAV雜合載體介導kallistatin或vasostatin進行結直腸癌的治療報導，我們的研究為結直腸癌的治療提供了新手段。

發明內容
本發明的目的是提供可以治療結直腸癌的新的基因藥物。該基因藥物為雜合rAAV載體介導的kallistatin或vasostatin，該載體的基因表達框依次含有AAV2 ITR(invertedterminal repeat sequence)，CMV增強子/雞β-actin啟動子，WPRE(woodchuck hepatitisvirus post-transcriptional regulatory element)，polyA，和AAV2 ITR；含kallistatin或vasostatin cDNA的PCR產物經酶切后，插入上述AAV2載體中，構成rAAV2-kallistatin或rAAV2-vasostatin重組載體，經無輔助病毒多質粒法制備重組病毒，得到基因藥物。本發明所進行的實驗證明，無論在體外還是在體內，本發明的基因藥物rAAV-kallistatin或rAAV-vasostatin均可以高效表達kallistatin或vasostatin，荷瘤小鼠在應用本發明的基因藥物后，可以顯著地抑制腫瘤血管的生成、腫瘤細胞的增殖和腫瘤生長。本發明以30余個血管抑制基因為候選對象，通過荷瘤小鼠的體內抑瘤試驗，篩選出kallistatin和vasostatin兩種基因，對人結腸癌細胞株HCT 116具有明顯的抑瘤作用。kallistatin和vasostatin兩種基因通過rAAV介導，可以在小鼠體內長期穩定的高表達，從而發揮抑制/治療腫瘤的效果。本發明中所用的AAV皆為重組AAV即rAAV。
與以前所有的報道的有關抗血管形成因子不同，這些已報道的抗血管形成因子，包括angiostatin，沒有抑制內上皮細胞分裂的功能。本發明首次采用一種可以抑制內上皮細胞分裂的kallistatin基因直接于直腸癌防治。
AAV感染細胞，必須首先與細胞相應的表面受體結合，然后被攝入胞內，轉運至細胞核，才能進行復制和表達。不同血清型的AAV，其衣殼蛋白雖然具有高度的同源性，但氨基酸序列的細微差異，決定了其細胞趨向性(tropism)的差別，即它們可以結合的細胞表面受體或共受體各有不同。細胞趨向性的差別，導致不同血清型的AAV轉染細胞的類型和感染效率各有差異。如將AAV衣殼蛋白的結構和組成加以改變，則有可能產生細胞趨向性迥然不同的新rAAV載體，其可以結合的受體種類，對某種細胞的感染效率也會發生變化。本發明在組裝rAAV載體時，將原來單一的AAV輔助質粒，改為兩種不同的AAV輔助質粒，結果在得到的rAAV的衣殼中，含有不同血清型的衣殼蛋白，試驗發現，這樣新的雜合rAAV的細胞趨向性，不僅繼承了兩種親代AAV的細胞趨向性，并且感染效率得到大大提高。
我們將AAV1，AAV7和AAV8進行雜合試驗，發現所生成的不同的雜合衣殼蛋白對肌肉的感染效率均較親代有明顯提高。我們以eGFP為報導基因，利用雜合rAAV介導，比較了雜合rAAV和親代rAAV以及常用載體rAAV2的感染效率。所采用的制備工藝與實施例一致。試驗所采用的感染復數(MOI)為5×104。通過流式細胞儀分析轉染效率。
其結果為rAAV7/8-eGFP＞rAAV1/8-eGFP＞rAAV1/7-eGFP＞rAAV8-eGFP≥rAAV7-eGFP≈rAAV1-eGFP＞rAAV2-eGFP。
rAAV1/7表示雜合的衣殼蛋白組合為AAV1和AAV7(rAAV1/8、rAAV7/8同)。
可見雜合rAAV的轉染效率均有所提高，其中rAAV7/8在所有的實驗載體中，轉染效率最高，可作為kallistatin和vasostatin攜帶載體，可望在循環系統中長期維持較高的kallistatin或vasostatin的藥物濃度水平。
下面是本發明的基因藥物的部分藥理學試驗一、取7-8周齡裸鼠，皮下接種2×106人結腸癌細胞HCT 116。一周后將實驗動物分為3組a)rAAV7/8-eGFP對照組；b)rAAV7/8-kallistatin治療組；c)rAAV7/8-vasostatin治療組。每組5只，瘤內注射給藥，劑量為2×1011病毒滴度/鼠，所用藥物分別為實施例1和2所制備。
在不同的時間，測定動物腫瘤體積。腫瘤體積按照公式V＝LW2/2計算，式中V為腫瘤體積，L為腫瘤長度，W為腫瘤寬度。不同組動物腫瘤體積變化情況見圖1，可見治療組腫瘤體積增加速率明顯慢于對照組。
給藥28天后將小鼠處死，比較典型病例腫瘤的體積(見圖2)，可見治療組腫瘤的體積明顯小于對照組。
二、取7-8周齡裸鼠，皮下接種2×106人結腸癌細胞HCT 116。一周后將實驗動物分為3組a)rAAV7/8-eGFP對照組；b)rAAV7/8-kallistatin治療組；c)rAAV7/8-vasostatin治療組。每組5只，肌肉注射給藥，劑量為2×1011病毒滴度/鼠，所用藥物分別為實施例1和2所制備。觀察不同組動物腫瘤生長情況。給藥28天后將小鼠處死，進行腫瘤組織切片，測定微血管密度。
將小鼠腫瘤進行病理切片，經HE染色，結果見圖3。
將小鼠腫瘤進行腫瘤組織切片，通過內皮細胞抗原CD34染色，測定微血管密度，結果見圖4。可見兩組治療組的腫瘤微血管密度，明顯低于對照組。
以上結果說明rAAV7/8-kallistatin和rAAV7/8-vasostatin經肌肉注射后，可以產生具有血管抑制作用的蛋白kallistatin和vasostatin，并發揮了明顯的腫瘤血管抑制作用。
三、取7-8周齡裸鼠20只，分為4組a)rAAV7/8-eGFP對照組；b)rAAV7/8-kallistatin實驗組；c)rAAV7/8-vasostatin實驗組；d)正常組(無病毒注射)。rAAV肌肉注射給藥，劑量為2×1011病毒滴度/鼠，給藥28天后將小鼠處死。觀察所有動物的行為變化。
結果顯示病毒注射組與無病毒注射其動物的行為變化沒有明顯差異。表明雜合rAAV病毒注射不影響動物的行為變化。
四、取7-8周齡小鼠，分為2組，每組5只a)rAAV2-vasostatin組；b)rAAV7/8-vasostatin組。rAAV肌肉注射給藥，劑量為2×1011病毒滴度/鼠，在給藥后2和4周尾靜脈取血，W-blotting法測定vasostatin蛋白表達。結果見圖5，可見rAAV7/8-vasostatin組vasostatin表達水平較rAAV2-vasostatin組高。
本發明的基因藥物的制備方法包括無輔助病毒多質粒法，即采用磷酸鈣法將表達質粒與輔助質粒共轉染293細胞，60-72小時后收獲重組病毒，經層析純化后備用，其特征在于rAAV重組表達質粒的基因表達框中依次含有AAV2 ITR，CMV增強子/雞β-actin啟動子，kallistatin或vasostatin cDNA，WPRE，polyA，和AAV2 ITR；AAV輔助質粒為兩種，分別表達不同血清型rAAV的衣殼蛋白。
本發明提供一種新的給藥途徑，采用雜合rAAV載體直接腫瘤注射方法，取得良好的治療效果。
本發明還公開了一種藥物組合物，含有本發明的基因藥物及藥學上可以接受的載體。所述組合物可以是藥學上常用的劑型，優選注射劑或凍干粉針。
本發明提供了基因藥物kallistatin或vasostatin一種最方便的給藥途徑。本發明發現雜合rAAV可以高效率地轉染肌肉細胞，因而肌肉注射rAAV-kallistatin或rAAV-vasostatin后，可望在循環系統中長期維持較高的kallistatin或vasostatin的藥物濃度水平。
本發明可以與放療和化療相結合應用，增強現有結直腸癌醫治手段的療效，降低毒副作用。同時本發明結果顯示病毒注射組與無病毒注射其動物的行為變化沒有明顯差異。表明雜合rAAV病毒注射不影響動物的行為變化。采用雜合rAAV載體直接腫瘤注射方法是安全可行的。


圖1.荷瘤裸鼠瘤內注射不同的rAAVs(劑量為2×1011病毒滴度/鼠，每組5只)后腫瘤的生長曲線。
圖2.荷瘤裸鼠瘤內注射不同的rAAVs后的代表病例。裸鼠皮下接種HCT 116，7天后瘤內注射rAAVs(劑量為2×1011病毒滴度/鼠)，28天后處死，測定腫瘤體積。左rAAV7/8-eGFP對照組；中rAAV7/8-kallistatin治療組；右rAAV7/8-vasostatin治療組。rAAV7/8-eGFP腫瘤體積明顯大于rAAV7/8-kallistatin和rAAV7/8-vasostatinr治療組。
圖3.荷瘤裸鼠肌肉注射不同的rAAVs后，腫瘤的病理切片。
腫瘤組織切片后，進行HE染色。(上圖)rAAV7/8-kallistatin；(下圖)治療組rAAV7/8-vasostatin。
圖4.荷瘤裸鼠肌肉注射不同的rAAVs后，腫瘤的微血管密度比較。
腫瘤組織切片后，進行CD34免疫組化染色。(上圖)對照組rAAV-EGFP；(中圖)治療組rAAV-kallistatin；(下圖)治療組rAAV-vasostatin。
圖5.荷瘤裸鼠肌肉注射rAAV7/8-vasostatin和rAAV2-vasostatin后，在2周和4周后取血，Western-blot法測定vasostatin的表達。
1.rAAV2-vasostatin(2周)；2.rAAV7/8-vasostatin(2周)；3.rAAV2-vasostatin(4周)；4.rAAV7/8-vasostatin(4周)。
以下將結合實施例具體說明本發明，本發明的實施例僅用于說明本發明的技術方案，并非限定本發明的實質。
具體實施例方式
實施例1rAAV7/8-kallistatin的制備人kallistatin全長cDNA通過PCR由人肝第一鏈cDNA擴增。擴增kallistatin的專屬引物為Kalli-F(5’-AAGAATTCGAGGATGCATCTTATCGAC)和Kalli-R(5’-AAGGTACCAAGCTTCTATGGTTTCGTGGGGTC)。限制性酶切位點(下劃線部分)被引入以方便亞克隆。PCR條件為94℃，50℃和68℃各45秒，共36循環。PCR產物經測序驗證其正確性，并亞克隆至AAV-2表達載體上，獲得rAAV2-kallistatin表達質粒。該表達質粒的啟動子為CMV增強子/雞β-actin啟動子。為加強表達，在插入基因后，還引入了WPRE元件。
采用磷酸鈣鈣無輔助病毒多質粒法制備重組病毒將該表達質粒，AV輔助質粒，與AAV7輔助質粒和AAV8輔助質粒共轉染293細胞，60-72小時后收獲重組病毒，層析純化后即得。
實施例2rAAV7/8-vasostatin的制備人vasostatin全長cDNA通過PCR由人肝第一鏈cDNA擴增。擴增vasostatin的專屬引物為Vas-F(5’-AACTCGAGCC CGCCATGCTG CTATCC)和Vas-R(5’-AAAAGCTTCTAGTTGTCTGG CCGCACAAT)。限制性酶切位點(下劃線部分)被引入以方便亞克隆，在引物Vas-R中引入了終止密碼子(加粗部分)。PCR條件為94℃，50℃和68℃各45秒，共36循環。PCR產物經測序驗證其正確性，并亞克隆至AAV-2表達載體上，獲得rAAV2-kallistatin表達質粒。該表達質粒的啟動子為CMV增強子/雞β-actin啟動子。為加強表達，在插入基因后，還引入了WPRE元件。
采用磷酸鈣鈣無輔助病毒多質粒法制備重組病毒將該表達質粒，AV輔助質粒，與AAV7輔助質粒和AAV8輔助質粒共轉染293細胞，60-72小時后收獲重組病毒，層析純化后即得。
實施例3重組病毒注射劑的制備取實施例1方法制得的重組病毒rAAV7/8-kallistatin 2×1015病毒滴度，加入注射用生理鹽水至1000ml，無菌過濾，分裝至2ml西林瓶中，即得。
實施例4注射用重組病毒的制備取甘露醇50克，加入注射用生理鹽水800ml溶解，加入實施例2方法制得的重組病毒rAAV7/8-vasostatin 2×1015病毒滴度，再加入注射用生理鹽水至1000ml，無菌過濾，分裝至5ml西林瓶中，每瓶1ml，凍干即得。
權利要求
1.一種用于防治結直腸癌的基因藥物，其特征在于治療基因為kallistatin或asostatin；基因載體為重組雜合腺病毒相關病毒rAAV，其中雜合腺病毒相關病毒rAAV的衣殼蛋白由兩種不同的血清型AAV衣殼蛋白組成。
2.權利要求1的基因藥物，其中兩種不同的血清型AAV衣殼蛋白的組合是AAV1和AAV7；AAV1和AAV8；或AAV7和AAV8。
3.權利要求2的基因藥物，其中兩種不同的血清型AAV衣殼蛋白的組合是AAV7和AAV8。
4.權利要求1、2或3的基因藥物的制備方法，包括無輔助病毒多質粒法，即采用磷酸鈣法將表達質粒與輔助質粒共轉染293細胞，60-72小時后收獲重組病毒，經層析純化后備用，其特征在于rAAV重組表達質粒的基因表達框中依次含有AAV2 ITR，CMV增強子/雞β-actin啟動子，kallistatin或vasostatin cDNA，WPRE，polyA，和AAV2 ITR；AAV輔助質粒為兩種，分別表達不同血清型AAV的衣殼蛋白。
5.一種藥物組合物，含有權利要求1、2或3中的基因藥物及藥學上可以接受的載體。
6.權利要求5的藥物組合物，劑型是注射液或粉針。
7.權利要求1、2或3的基因藥物用于制備防治結、直腸癌的藥物的用途。
8.權利要求1、2或3的基因藥物用于制備增強結、直腸癌化療或放療療效、降低副作用的藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及基因藥物領域，具體設計基于基因kallistatin和vasostatin的兩種治療結直腸癌的基因藥物及制備工藝，和采用該藥物進行結直腸癌的治療，以及增強結直腸癌化療或放療療效的應用。基因kallistatin和vasostatin的載體為雜合腺病毒相關病毒(AAV)，優選為AAV7/8。基因藥物的劑型為注射劑或凍干粉針，給藥途徑優選為肌肉注射。
文檔編號A61P35/00GK1966082SQ20061009738
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月3日 優先權日2006年11月3日
發明者許瑞安, 馮戩云, 朱健華 申請人:許瑞安, 馮戩云, 朱健華