專利名稱：一種用于治療糖尿病的融合蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。具體地，本發明涉及用于預防和治療I型和II型糖尿病的融合蛋白，及其制備方法和應用。
背景技術：
糖尿病是造成人類死亡的主要病因之一，嚴重危及人類健康。I型糖尿病和II型糖尿病是糖尿病的兩種主要形式。凋亡即程序性死亡是I型和II型糖尿病胰島細胞死亡的主要原因。I型和II型糖尿病人都表現有進行性的胰島B-細胞質量減少和B-細胞功能降低。
胰島素療法是治療1型糖尿病的主要手段。胰島移植也是一種有效的治療方法，但由于供體有限而受到制約，況且受體(患者)還要終生補充免疫抑制劑。治療II型糖尿病的常規方法，包括節食，身體鍛煉，以及使用磺基脲，甲福明二甲雙胍和胰島素進行治療，但通常多數患者都無法逆轉血糖控制能力的持續下降、B細胞質量的減少和功能的降低。在臨床上針對II型糖尿病所采用的階梯式的治療方法最終也無法維持血糖控制水平，不可避免地重復從減少進食、加強鍛煉、到使用單一藥物治療、至復合藥物治療并最終到必須使用胰島素治療這一病程逐漸加重的過程。這些治療既不能有效地緩解II型糖尿病的進程，又不能有效地防止并發癥，究其原因可能是傳統治療側重于緩解如高血糖等主要癥狀，而不是針對II型糖尿病的真正發病原因。
因此，采用一種有效的治療策略，以揭示疾病形成的分子機理為目標，而并非僅僅針對病狀來防止和逆轉II型糖尿病的病情發展，就顯得非常急迫了。盡管圍繞B細胞功能紊亂和胰島素抵抗作用是否就是病因還是有相當多的爭論，但目前二者都被公認在糖尿病發病過程中起了重要作用。
胰高血糖素類似肽(GLP-1，從7位到36位氨基酸的氨基化合物)是一種主要的生理性胰島素類似激素。由于天然GLP-1獨特的促胰島素樣作用和抗高血糖素樣作用，以及對胰臟B細胞的營養作用，因此在治療糖尿病方面展現了極大的藥學應用前景。這一點與臨床治療糖尿病重新制定的治療目標不謀而合。其藥學的重要意義還在于，與當今使用的磺基脲、胰島素等治療糖尿病的一線藥物相比，它并不會產生增加體重等副作用。實際上，由于GLP-1能促進漲飽的感覺，可自然減少食物的攝取，因此限制了患者體重的增加，甚至有可能造成體重的降低。
進行治療的主要困難在于一些酶類(如二肽酰二肽酶(DPPIV))可以使GLP-1快速失活，再加腎臟對GLP-1的排出作用，使得GLP-1本身的半衰期很短(t1/2＜2min)。因此采取持續性的皮下灌流可以維持機體內GLP-1的功效。盡管DPPIV抑制劑能夠延長GLP-1的半衰期并且正在臨床實驗中進行測試，但是這種方法仍然缺乏特異性，這是因為DPPIV同時還能使其他幾種多肽激素和趨化因子失活，將其抑制會產生各種不利反應。
Exendin-4(Ex-4)是一種39個殘基的蜥蜴唾液腺多肽，藥學性質與GLP-1相似。與GLP-1相反，Ex4在水溶液中能形成單體螺旋。這種螺旋由于疏水性C端的首尾相互作用，表現出罕見的熱穩定性。由于GLP-1缺乏C端首尾的相互作用、其自身的柔韌性以及16位的甘基酸殘基(是指甘氨酸還是氨基酸的殘基)被認為是降低單體螺旋狀態穩定性的因素。而Ex4螺旋內部的穩定性可減少結合受體時的正位功效，這一結合需要C末端保持螺旋狀態。
此外，白蛋白偶聯的GLP-1(Albugon)也同樣具有和較長的半衰期和治療糖尿病的功能。
盡管像Ex4一樣具有DPP-IV-抗性的GLP-1受體激動劑在治療糖尿病方面展示很大的藥用價值前景，但這些多肽需每日注射1-2次或配合口服藥物使用。由于Albugon分子較大，由腎臟排出量較少，因而也具有較長的半衰期。然而體外實驗結果顯示融合蛋白的功效不如Ex-4。而且，更重要的是多肽類藥物可以產生危險的致敏反應。這使得人們投入更多精力去開發在體內功效更持久，穩定性更高的效應分子。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種能夠預防和治療I型和II型糖尿病的融合蛋白以及編碼該融合蛋白的核苷酸序列，該類融合蛋白具有DPPIV抗性，能促進胰島B細胞增殖、再生和減少凋亡，從而增加胰島細胞質量。該類融合蛋白能促進胰臟B細胞分泌胰島素和對葡萄糖的耐受性，激活cAMP和其耦聯的第二信使途徑和促進B細胞中蛋白激酶(Aktl和MAPK)的表達以及增加其含量，降低caspase-3的活性。
所述融合蛋白可以為胰高血糖素類似肽GLP-1與IgG-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3；也可以為與GLP-1具有類似序列和生物學性質的同功因子蜥蜴唾液腺多肽extendin-4與IgG-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；所述融合蛋白還可以為突變體GPL-1-A8G-IgG-Fc，其中GPL-1的氨基酸序列的第8位的丙氨酸被甘氨酸取代或者被其它氨基酸取代，或者對GLP-1序列其它氨基酸修飾使得突變體GPL-1耐受其降解酶(如二肽酰二肽酶，DPPIV)。
本發明的再一目的是提供包括上述融合的表達載體、及其作為核酸疫苗的應用。
本發明的再一目的是提供上述融合蛋白的哺乳動物表達系統和細菌表達系統。
本發明的再一目的是提供一種制備具有生物活性的上述融合蛋白的方法。
本發明的再一目的是提供上述融合蛋白及其DNA序列和類似物用于制備預防和治療糖尿病的藥物的應用。
本發明的發明人為了實現上述目的提出并完成本發明。
根據本發明的技術方案，本發明提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白為胰高血糖素類似肽GLP-1或與其具有50％以上同源性的同功因子與IgG-Fc的融合蛋白。所述IgG-Fc為鼠IgG-Fc或人IgG-Fc，其中的IgG為IgG1、IgG2或IgG3。
根據本發明的融合蛋白，所述GLP-1的同功因子可以為蜥蜴唾液腺多肽extendin-4，所得到的融合蛋白為Extendin4-IgG-Fc，其中IgG-Fc為鼠IgG-Fc或人IgG-Fc，并且其中的IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
根據本發明的技術方案，通過使用交迭PCR技術將人GLP-1(7-37，其序列與鼠GLP-1完全一致)和鼠IgG-Fc核酸序列重組從而表達融合蛋白，因此本發明提供了一種胰高血糖素類似肽GLP-1與鼠IgG-Fc的融合蛋白，即GLP-1-IgG1-Fc，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。融合蛋白的IgG-Fc區包含IgG1的恒定重鏈區(部分CH1，鉸鏈，CH2和CH3)。本發明還使用同樣方法重組了GLP-1與人IgG-Fc的融合蛋白，即GLP-1和人IgG2-Fc核酸序列重組產生人GLP-1-IgG2-Fc融合蛋白，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。融合蛋白的IgG-Fc區包含IgG2的恒定重鏈區(鉸鏈，CH2和CH3)。因此本發明提供了一種胰高血糖素類似肽GLP-1與鼠或人IgG-Fc的融合蛋白，SEQ ID No.1GLP-1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gln Ala AlaLys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg-NH2鼠IgG-FcPro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser SerThr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys ProCys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro ProLys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr LeuThr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp AspPro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val HisThr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe ASn Ser Thr PheArg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro AlaPro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys AlaPro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala LysAsp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro GluAsp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu AsnTyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr PheVal Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala GlyAsn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn HisHis Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly LysIgKMet Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly SerThr Ser AspSEQ ID No.2GLP-1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gln Ala AlaLys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg-NH2人IgG2-FcGlu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala GlyPro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser ArgThr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu ValGln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys ProArg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val ValHis Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg GluPro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln ValSer Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Gln TrpGlu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu AspSer Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg TrpGln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn HisTyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LysGHRHVal Leu Trp Val Phe Phe Phe Val Ile Leu Thr Leu Ser Asn Ser Ser His CysSer本發明所設計和構建的融合蛋白是GLP-1分子與IgG-Fc分子相結合形成的一個新的分子，其擁有雙重優勢，既增強GLP-1的功效又由于IgG-Fc分子增加了的配體的親和力和免疫耐受性。
本發明所設計和構建的融合蛋白也是具有DPPIV抗性的GLP-1分子衍生物如GLP-1A8G與IgG-Fc分子形成的一種新的分子，因此所構建的融合蛋白擁有增強的GLP-1功效和上述IgG-Fc分子優勢。
同樣地，根據本發明的另一技術方案，本發明所設計和構建融合蛋白是具有GLP-1類似氨基酸序列和生物活性的同功因子蜥蜴唾液腺多肽extendin-4與人的IgG2-Fc分子形成的一種新分子，即Ex4-IgG-Fc，其具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。該融合蛋白擁有強的類似GLP-1的功效和保持IgG-Fc分子的優勢，經其處理的樣品與GLP-1/IgG-Fc處理的樣品的效果是一致的。
SEQ ID No.3
Ex4His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu AlaVal Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala ProPro Pro Ser-NH2人IgG2-FcGlu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala GlyPro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser ArgThr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu ValGln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys ProArg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val ValHis Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys GlyLeu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg GluPro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln ValSer Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu TrpGlu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu AspSer Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg TrpGln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn HisTyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LysGHRHVal Leu Trp Val Phe Phe Phe Val Ile Leu Thr Leu Ser Asn Ser Ser His CysSer
本發明還提供了表達上述融合蛋白的表達載體，可以在哺乳動物表達系統優選COS-7細胞系和常規使用的其它細胞系以及工程菌表達系統中表達上述融合蛋白。
因此，本發明還提供了一種制備具有生物活性的上述融合蛋白的方法，該方法包括將IgK或GHRH的分泌前導肽序列與上述融合蛋白中GLP-1或Ex4融合，制作IgG-Fc融合蛋白的優點是在實驗室可以通過簡單的一步程序得到產物GLP-1-IgG-Fc融合蛋白。
根據本發明的具體實施方案的實驗結果，本發明的融合蛋白或編碼融合蛋白的DNA可以用于制備用于治療I型和II型糖尿病的藥物。
根據本發明的制備有生物活性的融合蛋白的方法，通過融合IgK或GHRH的分泌前導肽序列與GLP-1序列可直接將合成的多肽分泌到培養基中，融合蛋白在分泌過程中經蛋白酶切除其前導肽后，將使融合蛋白N末端活性組氨酸殘基與GLP-1(或Ex4)相融合，然后利用G蛋白葡聚糖凝膠可以一步完成融合蛋白的提純。該融合方法的優點是在實驗室可以通過簡單的一步程序得到產物GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，這種方法也可以用于工業生產。同時，這種方法能達到1)GLP-1-IgG-Fc(Ex-4-IgG-Fc)融合蛋白以均一性二聚體的形式分泌，克服了GLP-1所存在的半衰期短的缺點，并且由于其較高的配體親和性而使融合蛋白具有更高的功效；2)大量的GPCR在細胞表面以二聚體的前體形式存在，因而增強了多肽的藥效；3)簡化了純化過程。利用G蛋白葡聚糖凝膠可以一步完成提純，利于融合蛋白的分離純化。
根據本發明的技術方案，整合了GLP-1活性基因和免疫球蛋白G(IgG)重鏈非可變區基因，表達出融合蛋白GLP-1-IgG-Fc，既延長了其生理半衰期，又強化了其GLP-1效應和增強了免疫耐受性。
本發明的具體應用之一是融合蛋白DNA作為一種治療用制劑，應用于簡單而且安全的非病毒載體基因治療。迄今大部分的基因治療采用病毒載體，這種方法雖然轉移效率很高，但局限性是容易產生致病性病毒過敏反應。通過肌肉組織注射裸露的DNA質粒不僅較通過其它大多數組織更為便捷，而且轉基因的表達通常更為長久。根據本發明的具體實施方案，采用連續6-8次施加低電場強度(100-200V/cm)、相對較長(20-50mS)方波電脈沖的方式通過肌肉途徑傳送包括本發明的融合蛋白的質粒載體。雖然這種低電壓電脈沖在某種程度上有可能使肌肉受損，但是它一般較溫和而且瞬時，研究結果顯示電轉移2周后，肌肉基本上恢復正常。
根據本發明的經肌肉途徑傳送質粒載體并結合體內電轉移的治療糖尿病的非病毒基因治療方法被證明是有效、安全和簡便的。這種方法靈活多樣，并適用于用細胞因子，多肽激素，可溶性受體和許多膜蛋白和細胞質蛋白進行基因療法。這一方法在全身性地提供蛋白質調節因子如GLP-1-IgG-Fc方面特別有效，并克服了迄今為止使用病毒載體進行基因治療所帶來的致敏性和致病性方面嚴重的局限性。本發明中所描述的基因療法的應用表明GLP-1-IgG-Fc、GLP-1A8G-IgG-FC和Ex4-IgG-Fc載體單一或是兩者結合進行肌肉注射1-2次，可以取得和在兩周內每日腹膜內注射長效/強力的GLP-1類似物Ex-4相同的治療效果。
因此，本發明的應用對預防與治療I型糖尿病和II型糖尿病提供了一種獨特的基因療法。這種基因療法不用任何類型的病毒作為將基因轉移入機體的載體，克服了迄今為止使用病毒載體進行基因治療所帶來的致敏性和致病性方面嚴重的局限性。
本發明同樣適合用上述融合蛋白直接注射而獲相同的治療效果。
此外，根據本發明的方法制備的二價的GLP-1-IgG-Fc融合蛋白具有以下特點1)增加了半衰期t1/2；2)高親和性和活力；3)最小化的免疫原性。


圖1構建GLP-1-IgG-Fc質粒示意圖，其中圖A和圖B表示鼠GLP-1-IgG1-Fc；圖C和圖D表示人GLP-1-IgG2-Fc。
圖2IgG-Fc融合蛋白在COS-7細胞中的表達和檢測。
圖3檢測轉染COS-7細胞分泌的GLP-1圖4(A)COS-7細胞大量表達IgG-Fc融合蛋白；(B)GLP-1在哺乳細胞和大腸桿菌中的表達。
圖5GLP-1在穩定表達融合蛋白的COS-7細胞系。
圖6GLP-1-IgG-Fc融合蛋白對INS-1細胞胰島素分泌的影響。
圖7GLP-1-IgG-FC對INS-1細胞產生cAMP與Ex-4有相似的功效。
圖8GLP-1-IgG-Fc在2型糖尿病模型db/db受試鼠中表達的效果。
圖9在經STZ誘導形成的胰島素分泌缺陷的I型糖尿病模型鼠體內表達GLP-1-IgG-Fc的效果，(A)對CD1受試鼠肌肉注射編碼GLP-1-IgG-Fc、Ex4-IgG-Fc或IgG-Fc基因的質粒各50μg，并同時原位施加電脈沖以促進轉染效果；(B)受試鼠胰臟組織切片。
圖10GLP1-IgG-Fc在大型哺乳動物豬中表達對血糖的影響具體實施方式
1、質粒的構建為構建GLP-1和鼠IgG-Fc cDNAs序列，以GLP-1/PCR2.1和IgG質粒為模板，以下列特異性序列5’-ccgGATATCgccaccATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACca-3’和5’-TgctgaagggACctttaccagtg-3’為引物進行第一輪交迭PCR(overlapPCR)。以PCR產物為模板進行第二輪交迭PCR產生GLP-1-IgG-FccDNA序列。將擴增的產物亞克隆到質粒Vrnew的Bam HI和Eco RV位點。為構建GLP-1和人IgG-Fc cDNAs序列，以GLP-1/PCR2.1和IgG質粒為模板，以下列特異性序列構建人IgG2FC(鉸鏈-ch2-ch3)，所用引物為5’-AAGGATATCGATCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCA-3’和5’-CGTAAGCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。所用載體同上。為構建IgG-Fc對照質粒，以下列特異性序列5’-ccgGATATCgccaccATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACcccagcgagaccgtcacc-3’和5’-cgcggatccctaTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’為引物進行PCR，擴增產物克隆到質粒Vrnew的Bam HI和Eco RV位點。
載體Vrnew含有CMV增強子和啟動子，單一真核生物轉錄單元，兔最小貝它球蛋白多聚腺嘌呤尾和轉錄終止序列，是由VR1255載體刪除熒光素酶報告基因的衍生載體，并添加了限制性內切酶位點。為使GLP-1或Exendin-4序列分泌，通過PCR于5‘端引入鼠Igκ鏈信號肽序列或人GHRH信號肽序列。為在細菌中表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，通過PCR擴增Vrnew載體的融合cDNA序列，并亞克隆至pET-28a質粒(Novagen，EMD Bioscience，San Diego，CA)。
2、哺乳動物細胞系表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白
1)融合蛋白的表達在哺乳動物細胞中的表達，是將GLP-1-IgG-Fc或作為對照的IgG-Fc的cDNA通過脂質體Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)轉染到COS-7細胞系。其過程是先將密度為每孔2.5×105個的COS-7細胞生長在6孔細胞培養板。添加含有4μgGLP-1-IgG-Fc cDNAs和10μL轉染脂質體的無血清無抗菌素的DMEM培養液(Invitrogen)在37℃的CO2培養箱進行培養。6h后，轉換為DMEM全培養基。轉染后48h分別收集培養液和細胞。為了大規模地表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，將COS-7細胞培養在150mm培養皿，分別用150mM NaCl將陽離子轉染試劑Poly(ethyleneimine)(PEI，25kDa)和80μg相關cDNA稀釋，混合后放置20min.然后將DNA/PEI復合物加到盛有無血清無抗菌素DMEM培養液的細胞培養皿在37℃的CO2培養箱放置6h后，以加有10％FBS和1％P/S的DMEM培養液取代。該方法的轉染率可高達85％。
為建立穩定表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的COS-7細胞系，細胞以每孔2.5×105的密度在6孔細胞培養板培養，并按照上述步驟轉染4μg線性化的GLP-1-IgG-Fc質粒或作為對照的IgG-Fc質粒。轉染以后24h，細胞在含有G418(500μg/mL)的DMEM培養液培養，以篩選已經穩定整合重組外源cDNA的細胞。培養過程中，每3d換培養液一次直至穩定表達外源基因的細胞克隆形成。分離單克隆細胞培養成穩定表達細胞系。培養在24孔培養板的細胞以及細胞培養液分別用鼠GLP-1RIA試劑盒檢測融合蛋白。選出能分泌融合蛋白的細胞并用作以后的特性分析。
2)融合蛋白表達特性的分析為了估價質粒在表達與分泌GLP-1-Fc融合蛋白的能力，構建的融合蛋白質粒轉染至COS-7細胞中瞬時表達。轉染后48h，自轉染細胞中提取總RNA并用RT-PCR評估表達效果。應用基因特異性引物，檢測到GLP-1-Fc融合蛋白基因在轉錄水平上的表達和IgG-Fc對照基因的表達(圖2a)。在未轉染對照樣品中沒有檢測到轉錄水平的表達。
用Western免疫印記法檢測了轉染的COS-7細胞裂解物和細胞培養基以確定融合蛋白在翻譯水平上的表達。結果見圖2b。同時在培養液和細胞裂解物中檢測到融合蛋白。融合蛋白的電泳遷移位置大約在37kDa，是SDS-PAGE條件下融合蛋白單體的分子量。在培養液和細胞裂解物中同時檢測到融合蛋白表明融合蛋白已經在哺乳動物細胞中合成并分泌。GLP-1融合蛋白還進一步用放射免疫法(RIA)加以鑒定，該法可以檢測以所有形式存在的GLP-1。COS-7細胞系還分別轉染了不同濃度的GLP-1-Fc/Vmew質粒或轉染了作為對照的Fconly/Vrnew質粒。轉染后48h收集細胞培養液用于GLP-1RIAs分析以便確定順勢表達的總的GLP-1分泌量。而在轉染作為對照的Fc-only/Vrnew載體質粒的COS-7細胞中沒有檢測到GLP-1的存在。從轉染GLP-1-Fc/Vrnew載體質粒的細胞中還檢測到GLP-1的含量與DNA轉染量呈正相關。結果見圖3。使用了0.8μg的DNA對1.25×105個細胞/mL進行轉染。而后從50mL的COS-7細胞分泌培養基中檢測到總量為100μmol的GLP-1。
3、從哺乳動物細胞培養物中純化GLP-1-Fc融合蛋白為了大量獲得融合蛋白，應用G蛋白葡聚糖凝膠柱可以進行中規模的蛋白純化。50ml的柱體積可以純化15cm培養皿中生長的轉染融合蛋白質粒的COS-7細胞的培養液。將純化的蛋白洗脫后、中和、除鹽后總體積為1mL，結果見(圖4A)，表明在天然條件下存在二聚體的GLP-1-Fc融合蛋白。
而兩步洗脫方法可以將大部分融合蛋白由葡聚糖凝膠柱上洗脫下來。樣品的組分經SDS-PAGE分離并經考馬斯亮蘭染色以估價產率和純化率。結果顯示每ml培養液接種1.25×105細胞培養2d后，可以得到大約每毫升6μg的融合蛋白。
具體地，小規模提取純化的具體做法是從培養哺乳動物轉染細胞的6孔培養板中每孔取2.5mL培養基，轉移至以含100mM Tris pH8.0和150mM NaCl的緩沖液平衡過的裝有70μL滿體積事先結合G蛋白的葡聚糖凝膠4快速洗脫樹脂(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)。經過4℃過夜后，以Tris緩沖液沖洗，然后以30μL含SDS的樣品緩沖液將融合蛋白洗脫。
中規模提取純化是用來獲得較大量的融合蛋白。其具體步驟是從轉染后48h的哺乳動物細胞，或是從穩定表達的細胞中，收集50mL的DMEM培養液。裝入1mL滿體積事先結合G蛋白的葡聚糖凝膠柱(Amersham-Pharmacia).并在1％Triton X-100下4℃過夜。而后反復用含0.1％Triton X-100的PBS沖洗，最后一步用150mM NaCl沖洗。用1mL 0.1M glycine(pH2.7)洗脫融合蛋白。洗脫液用Tris緩沖液(pH9.0)中和，融合蛋白用PD-10柱(Amersham-Pharmacia)脫鹽并用PBS洗脫。經凝膠柱純化的蛋白經以上洗脫、中和、除鹽后的最終體積為1mL。
4、細菌表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白在細菌細胞系中表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，是將GLP-1-IgG-Fc/pET28a質粒或將作為對照的IgG-Fc/pET28a質粒轉化大腸桿菌Rosettagami 2細胞系(Novagen，EMD biosciences，San Diego，CA)。方法可以是傳統的氯化鈣法或是應用電穿孔儀進行電轉化。其具體參數可以從任何分子生物學實驗手冊中查到。轉化后的細菌涂布于培養皿過夜培養，挑揀并篩選最佳表達融合蛋白的細菌菌斑。挑揀單個菌斑在50mL加有卡那霉素的2X YT培養液于37℃以225rpm過夜培養。而后將培養液以1∶50稀釋到新培養液，直至細胞密度達到O.D600讀數值0.6后，再在培養液中添加1mM的IPTG(EMD)以誘導融合蛋白表達。添加后3hr離心收集細菌細胞并在-80度保存。
由哺乳動物細胞和細菌中純化的融合蛋白進一步通過總GLP-1RIA，確定GLP-1的表達。在兩種表達細胞中所得到的融合蛋白數量都與轉化的DNA載體數量成正相關，但在細菌中表達的GLP-1融合蛋白的量低于在哺乳動物細胞中得到的表達量，結果見圖4(B)。
5、從細菌培養物中純化GLP-1-IgG-Fc融合蛋白使用與上述從哺乳動物細胞培養物中純化融合蛋白相同的方法也可以從細菌中純化融合蛋白。將轉化有融合蛋白基因質粒的細菌過夜培養，次日離心后的沉淀重新溶于含有多種蛋白酶抑制劑的冷PBS緩沖液并通過超聲波裂解細胞。緩沖液中加入1％Triton X-100保持30min后離心(12,000g，10min)，得到含有融合蛋白的上清液。其經凝膠柱純化的過程以及洗脫、中和、除鹽的過程與上述相似。
6、穩定表達的COS-7細胞分泌GLP-1-IgG-Fc融合蛋白經過G148篩選和用RIA驗證細胞系分泌GLP-1，建立起穩定表達GLP-1-Fc融合蛋白的COS-7細胞系。以生長穩定細胞系培養液中總GLP-1水平作為評估細胞分泌GLP-1-Fc融合蛋白水平的基線，結果見圖5。所有只表達Fc蛋白的對照組分泌的GLP-1水平都低于培養液GLP-1基準線。分離了分泌GLP-1-Fc融合蛋白量高于基線的幾株穩定表達細胞并建立了穩定表達細胞系，結果見圖5。盡管如此，分泌水平僅高于基線2倍。
7、GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的體外特征實驗天然的GLP-1能依賴葡萄糖水平刺激哺乳動物B細胞分泌胰島素。為評估由哺乳動物細胞系分泌純化的GLP-1-Fc融合蛋白是否具有生物學功能，對克隆培養的具胰島素分泌功能的INS-1細胞系的分泌功能的影響進行了評估。經無血清培養和葡萄糖饑餓的INS-1細胞施加不同劑量的純化后GLP-1-Fc融合蛋白，同時添加0.5或20mM的葡萄糖。圖6所示，沒有葡萄糖存在的情況下，GLP-1-Fc融合蛋白并不能促進β-細胞的胰島素分泌，然而，在5mM或20mM葡萄糖存在的情況下，GLP-1-Fc融合蛋白依劑量的高低促進B細胞胰島素的分泌。這一結果表明，GLP-1-Fc融合蛋白具有生物學活性，依劑量的高低促進INS-1細胞分泌胰島素。
8、GLP-1-Fc融合蛋白誘導cAMP將INS-1細胞以每孔62,500個細胞的密度在24孔細胞培養板培養。在次日的實驗前，細胞在加有100μM IBMX的450μmL的無血清SF-RPMI培養基內培養5h。而后細胞在加有提純的Fc融合多肽(120nM)或Exendin-4(100nM)的SF-RPMI培養液培養10min后，加入1mL冰凍乙醇結束反應。提取物保持在-20℃條件下3h或過夜。然后將每200μL分裝并凍干。凍干的樣品重新溶于50μL醋酸鈉緩沖液并用cAMP RIAs試劑盒檢測(Biomedical Technologies，Stoughton，MA)。
圖7顯示，當葡萄糖含量為零時，以120nM GLP-1-Fc融合蛋白處理的INS-1細胞內cAMP水平作為基線水平測量cAMP。在5mM葡萄糖的條件下，經GLP-1-Fc融合蛋白處理的INS-1細胞cAMP水平顯著增加，與經exendin-4處理的細胞cAMP水平幾乎相同。這一結果表明，GLP-1-Fc融合蛋白以依葡萄糖濃度高低的方式刺激INS-1細胞內cAMP的產生。
9、GLP-1-IgG-Fc融合蛋白預防db/db鼠糖尿病的發生用糖尿病動物模型db/db鼠進行了GLP-1/IgG融合蛋白的體內功能實驗。4周齡的db/db鼠分別肌肉注射了GLP-1-IgG-Fc融合蛋白質粒和作為對照的IgG-Fc質粒。并應用電轉移儀產生的電脈沖強化轉染效果。在第一次注射后2周，又進行了第2次注射。對受試鼠的體重和血糖水平每周進行監測。于注射前和第一次注射后2周，12周收集隱靜脈血測量體內禁食胰島素和高血糖素含量。GLP-1-IgG-FcGLP-1-IgG-Fc融合蛋白體內的表達量是用Linco公司GLP-1 Elisa試劑盒檢測細胞質活性GLP-1含量確定。對基因治療鼠體內GLP-1，胰島素和高血糖素測量結果顯示，第一次注射后2周，注射GLP-1-IgG-FcGLP-1-IgG-Fc質粒的受試鼠較注射對照IgG-Fc質粒血清GLP-1水平顯著提高。而16周后，受試鼠血清GLP-1水平雖有回落但其值仍高于基線水平，結果如圖8A所示。
在實驗過程中，兩組受試鼠的體重并沒有發生顯著的變化。在注射后第一個月里，兩組受試鼠禁食血糖水平也都沒有發生顯著的變化。然而，在注射12周后，注射過GLP-1-IgG-FcGLP-1-IgG-Fc質粒的受試鼠禁食血糖濃度顯著低于對照組(P＜0.001)，結果如圖8B顯示。而GLP-1-IgG-Fc載體的受試鼠禁食胰島素水平顯著高于注射IgG-Fc載體的對照組，如圖8C顯示。禁食高血糖素水平在GLP-1受試鼠低于對照鼠(P＜0.05)(圖8D)。這一結果表明，體內表達GLP-1-IgG-Fc蛋白，對糖尿病受試鼠確有降低血糖的功效，其原因很可能是由于促進了胰島素的分泌和減少了基礎高血糖素分泌所致。
10、GLP-1-IgG-Fc融合蛋白能預防由STZ誘導的胰島素缺乏性糖尿病的發生(I型糖尿病模型)最近的研究結果表明，腸泌素對I型糖尿病血糖的調節以及治療可能有作用。為了確定GLP-1-IgG-Fc基因治療對胰島B細胞損傷的保護作用，我們用streptozotocin(STZ)對CD1模型鼠進行了研究。分別將GLP-1-Fc，Ex4-Fc或Fc質粒(50μg/個體)肌肉注射到CD1受試鼠，用電轉移儀產生的電脈沖強化轉染效果。DNA注射7天后，連續5天注射STZ(55mg/kg，i.p.)。結果顯示，Fc對照組血糖含量顯著增加，僅僅幾天就達到了糖尿病的標準(＞17mM)，但是注射GLP-1-IgG-Fc(或Ex4-IgG-Fc)的受試鼠在STZ處理后受到保護，其血糖水平保持在糖尿病的下限(圖9)。
胰臟組織化學研究結果表明受試與對照組均表現了不同程度的胰島B細胞的損害，2組受試鼠胰島都發生了單核細胞(淋巴細胞以及巨噬細胞)的侵潤。但是在GLP-1-IgG--Fc(或Ex4-IgG-Fc)處理組損害程度較輕(圖9)。有趣的是盡管EX4-Fc對DPPIV降解有抵抗作用，但Ex4-Fc處理的結果和GLP-1-Fc處理效果幾乎一樣。這些發現表明盡管胰島發生炎癥(insulitis)，但是GLP-1-IgG-Fc(或Ex4-IgG-Fc)的表達保護了由STZ誘導的胰島細胞損害。
11、體內表達GLP1-IgG-Fc及其對大型哺乳動物豬血糖的影響將GLP-1-IgG-Fc或對照IgG-Fc質粒肌肉注射到Yorkshire公豬，每頭4mg/23kg隨后用ADViSYS電轉移儀進行電轉移。注射3天后，將能引起高血糖癥的Alloxan水化物(80mg/kg，Sigma)溶于25ml鹽水，PH調中性，在麻醉條件下靜脈注射. 因該中性溶液不能有效引起高血糖，隨后又在僅注射空白IgG-Fc質粒的對照組注射以引起中等程度高血糖。每周測量空腹血糖2次(圖10A)并用ELISA檢測Fc蛋白(圖10B)綜上所述，我們研發了一種特殊的將人GLP-1(人與鼠GLP-1氨基酸編碼是一致的)與鼠IgG1-Fc或人IgG2-Fc衍生物融合的GLP-1類似物。該類似物可以增加半衰期，改善體內活性并減少免疫原性(immunogenicity)。在自然狀態下，GLP-1-IgG-Fc融合蛋白以二價的形式存在。融合蛋白顯示可以倚葡萄糖濃度的高低程度促進Ins-1B-細胞胰島素的分泌和cAMP的產生。用動物模型體內實驗結果顯示，我們可以用一種非病毒的基因治療方法投送這種蛋白在體內長期表達，并證實對streptozotocin(STZ)誘導的糖尿病(β-細胞損傷的I型糖尿病模型)和對糖尿病和肥胖病(II型糖尿病模型)有效。
<110>王慶華，黃曉航<120>一種用于治療糖尿病的融合蛋白及其制備方法和應用<150>CN200510102897.X<151>2005-9-14<160>3<210>1<211>278<212>PRT<213>鼠<220>
<400>1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro 30Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr 45Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 60Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro 75Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 90Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 105Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 120Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser 135Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 150Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys 165Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr 180Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser 195Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 210Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr 225Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys 240Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 255Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys 270Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 278<210>2<211>257<212>PRT<213>人<220>
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1.一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為胰高血糖素類似肽GLP-1或與其具有至少50％同源性的同功因子與IgG-Fc的融合蛋白。
2.編碼權利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述IgG-Fc為鼠IgG-Fc或人IgG-Fc。
4.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為胰高血糖素類似肽GLP-1與IgG-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3；或GLP-1的同功因子蜥蜴唾液腺多肽extendin-4與IgG-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
5.如權利要求1所述的融合蛋白的突變體GPL-1-A8G-IgG-Fc，其特征在于，GPL-1的氨基酸序列的第8位的丙氨酸被甘氨酸取代，其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3。
6.包括權利要求1所述融合蛋白的表達載體。
7.權利要求6的表達載體用于制備治療糖尿病的藥物的應用。
8.權利要求1所述融合蛋白的COS-7細胞系、CHO細胞系或其它目前實驗室使用的哺乳動物細胞系表達系統或昆蟲表達系統、或細菌表達系統或酵母表達系統。
9.一種制備具有生物活性的如權利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟1)將IgK或GHRH的前導肽序列與如權利要求1所述的融合蛋白融合；2)用上述得到的融合蛋白轉化本領域常規使用的COS-7細胞系、CHO細胞系或其它目前實驗室使用的哺乳動物細胞系或工程菌株；3)通過結合G蛋白的葡聚糖凝膠柱進行純化。
10.如權利要求1所述的融合蛋白以及與其具有至少50％同源性的類似衍生物單獨地或與其它成分混合地用于制備預防和治療I型和II型糖尿病的藥物的應用。
全文摘要
本發明涉及用于預防和治療I型和II型糖尿病的融合蛋白，及其制備方法和應用。本發明提供了胰高血糖素類似肽GLP－1、GLP－1突變體與IgG－Fc的融合蛋白，和其同功因子蜥蜴唾液腺多肽extendin－4與IgG－Fc的融合蛋白，及上述融合蛋白及其DNA用于預防和治療糖尿病的應用。本發明的融合蛋白既增強GLP－1的功效又增加了配體的親和力和免疫耐受性。本發明還提供了通過制備上述融合蛋白的方法。通過該方法制備的融合蛋白以均一性二聚體的形式分泌，克服了GLP－1所存在的半衰期短的缺點，并且由于其較高的配體親和性而使融合蛋白具有更高的功效；大量的GPCR在細胞表面以二聚體的前體形式存在，因而增強了多肽的藥效；簡化了純化過程。
文檔編號A61P3/10GK1935846SQ20061012723
公開日2007年3月28日 申請日期2006年9月14日 優先權日2005年9月14日
發明者王慶華, 黃曉航 申請人:王慶華, 黃曉航