專利名稱：：作為抗腫瘤劑nod1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及Nodl和其在轉(zhuǎn)化的、惡性細(xì)胞的細(xì)胞凋亡中的功能。
背景技術(shù)：
：癌癥是折磨許多人的疾病，并且是人類和非人動(dòng)物中死亡的主要原因。癌癥一般包括少數(shù)細(xì)胞不受控制的分離，其然后產(chǎn)生許多新的細(xì)胞。因而，許多抗癌藥物是抑制或停止細(xì)胞生長的試劑。雖然這種化學(xué)治療劑改善了患有贅生性疾病的患者的存活率，與許多化學(xué)治療劑相關(guān)的嚴(yán)重副作用限制了它們的使用，并破壞了已經(jīng)被癌癥削弱的患者的健康狀態(tài)。因而需要新的試劑，其展現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的增強(qiáng)的選擇性，并且能夠控制瘤細(xì)胞的增殖。許多抗癌劑的一個(gè)主要難題是它們的特異性。抗癌藥物需要區(qū)分癌性的細(xì)胞和非癌性的細(xì)胞。然而，在這一點(diǎn)上大量的抗癌藥物是不加選擇的。一般地，抗癌試劑具有陰性的血液學(xué)效果(例如，停止骨髓和淋巴組織中成形的元件的有絲分裂和離解)和免疫抑制作用(例如，降低細(xì)胞計(jì)數(shù))，也可以對(duì)上皮組織(例如，腸粘膜)、生殖組織(例如，精子發(fā)生的損傷)以及神經(jīng)系統(tǒng)有嚴(yán)重的影響。參見，例如，P.CalabresiandB.A.Chabner,In:GoodmanandGilman,ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(PergamonPress,8thEdition)(pp.1209-1216)。需要的是抗癌試劑，其可以有益地治療選定的腫瘤類型，或優(yōu)選的各種腫瘤類型，并且特別適合于侵入性肺瘤。此外，雖然這種抗癌試劑應(yīng)當(dāng)是有效的，它們也應(yīng)當(dāng)很少展現(xiàn)或不展現(xiàn)毒性。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于促進(jìn)在中的細(xì)胞凋亡的組合物和方法，其涉及提高Nodl表達(dá)或NODI活性。因而，本發(fā)明的一個(gè)方面是促進(jìn)哺乳動(dòng)物中腫瘤退化的方法，其涉及向所述哺乳動(dòng)物施用提高Nodl表達(dá)或NOD1活性的試劑。可以用本發(fā)明的方法治療的腫瘤的實(shí)例包括腦、膀胱、宮頸、結(jié)腸、膽嚢、腎臟、肝臟、肺、胰腺、卯巢、前列腺、皮膚、胃或曱狀腺腫瘤。在某些實(shí)施方式中，所述肺瘤是雌激素敏感性腫瘤或乳腺腫瘤。提高NOD1活性的試劑的實(shí)例包括具有以下序列的肽D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(/TriDAP)、y-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(氾-DAP)、Y-D-Gln-DAP(iQ-DAP)、D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(Y丁riDAP),和其組合。這些肽可以活化NOD1蛋白，由此Nodl依賴性途徑引起細(xì)胞凋亡。可以提高NOD1活性的試劑的另一個(gè)實(shí)例是NOD1多肽。在某些實(shí)施方式中，所述NODl多肽可以是人類NODl多肽，例如，具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的人類NODI多肽。可以提高Nodl表達(dá)的試劑的一個(gè)實(shí)例是包含編碼NODI多肽的片段的核酸。NODI多肽的序列的實(shí)例包括SEQIDNO:1或SEQIDNO:3。編碼NODl多肽的核酸片段的一個(gè)實(shí)例包括SEQIDNO:2。所述核酸可以進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)元件，例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，或其組合。所述核酸可以是表達(dá)盒或表達(dá)載體或基因遞送載體的一部分。可以與提高Nodl表達(dá)或NODI活性的試劑聯(lián)合施用其他活性成分。例如，可以與這些試劑聯(lián)合施用有效量的腫瘤壞死因子。在某些實(shí)施方式中，腫瘤壞死因子oc可以增強(qiáng)Nod依賴性細(xì)胞凋亡途徑。此外，可以與所述試劑一起施用有效量的放線菌酮，以提高Nodl表達(dá)或NODI活性。此外，可以與所述試劑聯(lián)合施用一種或多種化學(xué)治療化合物。可以用于本發(fā)明的組合物和方法的化學(xué)治療化合物的實(shí)例包括六曱密胺、博來霉素、馬利蘭、亞葉酸鈣、卡培他濱、卡鉑、卡氮芥、苯丁酸氦芥、順鉑、克拉屈濱、Crisantaspase、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、放線菌素、紅比霉素、多西他賽、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體阿霉素、環(huán)己亞硝脲、苯丙氨酸氮芥、巰基。票呤、氨曱蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、噴司他丁、甲基芐肼、雷替曲塞、鏈脲霉素、優(yōu)福定、泰莫佐羅、硫替派、巰基鳥噪呤/硫鳥噤呤、拓樸替康、蘇消安、長春花堿、長春新堿、去乙酰長春酰胺、長春烯堿和其組合。所述試劑可以局部地施用到肺瘤的位點(diǎn)，和/或被配制用于持續(xù)釋放。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種組合物，其包括載體、包含編碼N0D1多肽的片段的核酸，以及有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(Y丁riDAP)、y-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、y-D-Gln曙DAP(iQ-DAP)或D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(丫TriDAP)，其中所述組合物;故配制用于向肺瘤的局部施用。所述N0D1多肽可以，例如，包括SEQIDNO:1或SEQIDNO:3。編碼NODI多肽的核酸片段的實(shí)例是SEQIDNO:2。在所述組合物中采用的核酸可以進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)元件，例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，或其組合。所述核酸可以是表達(dá)盒或表達(dá)載體。所述核酸包含基因遞送載體。本發(fā)明的組合物也可以包括其他活性成分，例如，有效量的肺瘤壞死因子oc或化學(xué)治療化合物。所述組合物可以被配制用于局部地施用到肺瘤的位點(diǎn)，和/或被配制用于持續(xù)釋放。本發(fā)明的另一個(gè)方面是促進(jìn)乳腺肺瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的方法，包括用有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(/TriDAP)接觸乳腺腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是促進(jìn)雌激素敏感性腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的方法，包括用有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(/TriDAP)接觸乳腺胂瘤細(xì)胞。附圖lA-C說明了在TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中涉及的Nodl。附圖1A提供了突變基因的示意圖，其產(chǎn)生了TNFa抗性表型，后來被鑒定為帶有blasticidine(blast)基因插入的Nodl突變。帶有這種Nodi突變的細(xì)胞系是MCF7-C20細(xì)胞系。來自pDisrup逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的插入被繪制到Nodl基因上。與Nodl基因融合的blasticidine的接點(diǎn)出現(xiàn)在富亮氨酸區(qū)域8(LRR8)和富亮氨酸區(qū)域9(LRR9)之間Nodl基因的3'末端。因此LRR9和LRR10區(qū)域是blasticidine插入的3'。附圖IB顯示了在MCF-7C20細(xì)胞中NODI蛋白不以可檢測數(shù)量存在。制備來自MCF-7親本(稱為"wt")和MCF-7C20細(xì)胞的細(xì)胞提取物，用單克隆抗NODI抗體免疫沉淀(上畫面)或直接加載到SDS-PAGE凝膠上(下畫面)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用相同的單克隆抗膜抗體通過免疫印跡來分析印跡。附圖IC顯示了與MCF-7C20細(xì)胞相比，MCF-7細(xì)胞對(duì)于TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更有抗性。用升高濃度的TNF(0-40ng/ml)處理MCF-7和MCF-7C20細(xì)胞20h。通過碘化丙錠(PI)排出分析和流式細(xì)胞計(jì)來測定細(xì)胞生存力。圖表顯示，MCF-7C20細(xì)胞顯著更可能經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。附圖2A-D顯示了在yTnDAP處理時(shí)MCF-7細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。附圖2A說明了NODI是丫TriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡所需的。在存在(陰影柱)或缺少(空心柱)放線菌酮(CHX)(3yg/ml)的情況下，用/TriDAP或aTriDAP(各50ng/ml)處理表達(dá)正常水平的NODI的MCF-7Blasto細(xì)胞、表達(dá)很少或不表達(dá)NODI的MCF-7C20細(xì)胞、或過量表達(dá)NODI的MCF-7Nodl細(xì)胞48h。對(duì)照分析接受培養(yǎng)基(Med)代替yTriDAP或cxTriDAP。在48h孵育之后，收獲細(xì)胞，并與碘化丙錠(PI)孵育(4yg/ml)。通過流式細(xì)胞計(jì)分析來測定細(xì)胞生存力。數(shù)據(jù)顯示的是至少四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性實(shí)驗(yàn)。附圖2B顯示了在用單獨(dú)的載體轉(zhuǎn)染的MCF-7Blasto細(xì)胞中、具有內(nèi)源Nodl基因石皮壞的MCF-7C20細(xì)胞中、或被工程化以過量表達(dá)NODl的MCF-7Nodl細(xì)胞中的NODI表達(dá)水平。在MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7Nodl細(xì)胞中NODI的表達(dá)通過使用單克隆抗Nodl抗體的western印跡來分析。附圖2C說明了在丫TriDAP處理的MCF-7Nodl細(xì)胞中的形態(tài)變化。將細(xì)胞播種到4孔室載玻片上，并用/TriDAP/放線菌酮(CHX)(畫面b、d、f)或單獨(dú)的CHX(畫面a、c、e)處理。細(xì)胞用DAPI(畫面c、d)或TUNEL(畫面e、f)染色，固定并在相差(畫面a、b)或熒光(畫面c-f)顯微鏡下觀察。附圖2D顯示了，通過兩種廣譜的caspase抑制劑，z-VAD-FMK和Boc-D-FMK,在MCF-7Nodl細(xì)胞中的yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少或消除。用z-VAD或Boc-D-FMKcaspase抑制劑(各50juM)預(yù)處理MCF-7Nodl細(xì)胞30分鐘，之后添力口Y丁riDAP/CHX48h。用硤化丙錠(PI)孵育細(xì)胞，通過流式細(xì)胞計(jì)測量凋亡'I"生細(xì)胞死亡。附圖3通過western分析說明了，向MCF-7細(xì)胞添力口Y丁riDAP，而不是無效的對(duì)照物三肽ocTriDAP，引起了聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白水解裂解和capases6、7、8和9的蛋白水解裂解。在存在或缺少CHX(0.5yg/ml)的情況下用yTriDAP、aTriDAP或培養(yǎng)基(對(duì)照)刺激之后，通過MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7Nodl細(xì)胞的Western印跡分析所檢測的PARP和各種caspases的裂解。收獲細(xì)胞，經(jīng)歷western印跡，使用與其反應(yīng)的抗體檢測PARP、caspases、p20、p41/43和p35。附圖4A-C顯示了N0D1突變體V41Q對(duì)/TriDAP起反應(yīng)，并且保持了細(xì)胞凋亡途徑中的功能，而N0D1突變體K208R對(duì)于Y丁riDAP不敏感，并且在細(xì)胞凋亡途徑中是沒有活性的。附圖4A圖示說明了在用培養(yǎng)基(Med.,對(duì)照)或yTriDAP處理后不同的細(xì)胞系中細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比。NODIV41Q和K208R突變體通過定點(diǎn)誘變來構(gòu)建。V41Q突變處于NOD1的CARD結(jié)構(gòu)域中，而K208R突變被認(rèn)為阻斷由Nod/NBD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的寡聚反應(yīng)所需的構(gòu)象變化。編碼這些NODIV41Q和K208R突變多肽的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到MCF-7C20細(xì)胞中，進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。如所示，V41Q突變體保持了N0D1活性，但K208R突變體沒有。附圖4B顯示了，N0D1突變體和野生型多肽的表達(dá)水平基本上是相同的。附圖4C通過western分析說明了，在MCF-7細(xì)胞中的N0D1表達(dá)是PARP的蛋白水解裂解和capases6、7、8和9的蛋白水解裂解所需的。PARP和各種caspases的裂解通過不表達(dá)NOD1的MCF-7C20細(xì)胞、以及已經(jīng)將Nodl構(gòu)建體重組導(dǎo)入MCF-7C20細(xì)胞中的MCF-7C20Nodl細(xì)胞的Western印跡分析來檢測。在存在或缺少放線菌酮(chx)(0.5mg/ml)的情況下用/TriDAP或培養(yǎng)基(對(duì)照)刺激細(xì)胞24h。然后收獲細(xì)胞，進(jìn)行western印跡。使用與之反應(yīng)的抗體檢測PARP、caspases、p20、p41/43和p35。附圖5A-C說明了在MCF-7細(xì)胞中Nod2不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在附圖5A中，在存在或缺少CHX的情況下用NOD1配體Y丁riDAP或Nod2配體胞壁酰二肽(MDP)(各20jug/ml)處理MCF-7Blasto、MCF隱7Nodl和MCF-7Nod248h。然后用PI孵育細(xì)胞，通過流式細(xì)胞計(jì)測量細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。如所示，yTriDAP刺激細(xì)胞凋亡，但Nod2配體不。在附圖5B中，NOD1和NOD2的表達(dá)通過Western印跡分析來確認(rèn)，使用用于重組蛋白的檢測的抗Myc抗體。附圖5C顯示了MCF-7Nod2細(xì)胞響應(yīng)MDP，如通過白細(xì)胞介素-8(IL-8)分泌所檢測的。在存在或缺少CHX(0.5jug/ml)的情況下用/TriDAP或MDP刺激MCF-7Blasto、MCF-7Nodl和MCF-7Nod2細(xì)胞24h。然后收獲細(xì)胞上清液，分析IL-8分泌。附圖6A-Di兌明了，caspase8和caspase9是丫TriDAP誘導(dǎo)的細(xì)月包凋亡所需的。附圖6A顯示了不同caspase抑制劑對(duì)yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。在用/TnDAP/CHX刺激48h之前，用沿著附圖6A的x軸列出的caspase的抑制劑預(yù)處理MCF-7Nodl細(xì)胞30分鐘。然后用碘化丙錠孵育細(xì)胞，通過流式細(xì)胞計(jì)測量細(xì)胞生存力。所有抑制劑在100iuM的濃度使用。附圖6B顯示了，當(dāng)Nodl與caspase9共表達(dá)時(shí)，檢測到NOD1的高分子量形式，表明NOD1與caspase9相互作用。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在存在空載體、Myc-Nodl或Myc-NOD2的情況下，293細(xì)胞用編碼FLAG-caspase9的載體共轉(zhuǎn)染。用抗-FLAG抗體免疫沉淀(IP)細(xì)胞提取物，使用多克隆抗-Myc抗體通過免疫印跡(WB)來揭示共沉淀的蛋白質(zhì)。附圖6C顯示了，CLARP完全地阻止yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而Bcl2僅僅部分地抑制yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在存在或缺少CHX(3ng/ml)的情況下用丫TriDAP不處理或處理MCF-7CLARP、MCF-7CLARP/Nodl、MCF-7Bc12和MCF國7Bcl2/Nodl細(xì)胞。然后用碘化丙錠孵育細(xì)胞，通過流式細(xì)胞計(jì)測量細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。附圖6D顯示了Western印跡，說明了在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)CLARP、Bcl2和NODl，表明在附圖6C中觀察到的結(jié)果是由于CLARP和Bcl2之間的功能差異，而不是這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平中的差異。附圖7A-C說明了，野生型RIP2和RIP2的激酶缺陷的(KD)突變?cè)贜ODl細(xì)胞凋亡途徑中是功能性的。然而，缺少CARD結(jié)構(gòu)域的RIP2作為NODI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的顯性陰性抑制劑起作用。附圖7A圖形地說明了在野生型RIP2、RIP2KD和RIP2ACARD細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的百分比。用野生型Myc-RIP2、Myc-RIP2KD和Myc-RIP2△CARD穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，在存在或缺少CHX(3yg/ml)的情況下，用yTriDAP不處理或處理48h。用PI將育細(xì)胞，通過流式細(xì)胞計(jì)測量細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。附圖7B顯示了RIP2多肽被表達(dá)，如通過用多克隆抗Myc抗體對(duì)細(xì)胞提取物的免疫沉淀以及使用單克隆抗Myc9E10抗體的免疫印跡所確認(rèn)的。附圖7C說明了在RIP2野生型、MCF-7RIP2KD和RIP2ACARD細(xì)胞中JNK的磷酸化的丫TriDAP誘導(dǎo)。如所示，在存在放線菌酮的情況下，表達(dá)野生型RIP2或RIP2KD的MCF-7細(xì)胞對(duì)fTriDAP的暴露2h誘導(dǎo)JNK的磷酸化。然而，在同樣方式處理的RIP2ACARD細(xì)胞中沒有觀察到JNK的這種磷酸化。附圖8A-D說明了，在NODl和TNFoc之間存在協(xié)同的相互關(guān)系。附圖8A圖形地說明了，當(dāng)NOD1的濃度從0.0提高到100yg/ml以及TNFoc的濃度從0.5ng/ml提高到1ng/ml時(shí)，細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比以劑量特異性方式提高。附圖8B圖形地說明了，當(dāng)放線菌酮的濃度從0.0提高到3mg/ml以及tnfcc的濃度從0.5ng/ml提高到1ng/ml時(shí)，細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比以劑量特異性方式提高。附圖8C圖形地說明了，雖然yTriDAP在存在TNFoc的情況下提高細(xì)胞凋亡，無效對(duì)照三肽ocTnDAP實(shí)際上可以抑制細(xì)胞凋亡，甚至在更高的TNFi劑量下。附圖8D說明了在MCF-7細(xì)胞對(duì)TNFoc的暴露之后在各個(gè)時(shí)點(diǎn)的N0D1表達(dá)。附圖9A-C說明了在另一個(gè)人類乳腺癌細(xì)胞系、SKBR3癌細(xì)胞系中的N0D1表達(dá)。附圖9A(上部)圖形地說明了作為TNFot濃度的函數(shù)的、細(xì)胞凋亡的SKBR3野生型和SKBR3Nodl細(xì)胞的百分比。附圖9A(底部)底部說明了作為丫TriDAP濃度的函數(shù)的細(xì)胞凋亡的SKBR3野生型和SKBR3Nodl細(xì)胞的百分比。附圖9B(頂部)圖形地說明了通過硤化丙錠(PI)或Dioc6在不同條件下觀察到的細(xì)胞凋亡的SKBR3細(xì)^^的百分比。采用的條件在以下的Western印跡中指示。使用的縮寫如下CHX(放線菌酮)、TNF(TNFoc)、yTri(丫TriDAP)、ccTri(ccTriDAP)。附圖9B2提供了western分析，說明了聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白水解裂解和caspase3、7和8的蛋白水解裂解。在以下的Western印跡指定的條件下刺激之后，通過MCF-7細(xì)胞的Western印跡細(xì)胞分析來檢測PARP和各種caspases的裂解。收獲細(xì)J包，經(jīng)歷western印跡，^f吏用其反應(yīng)性抗體才企測PARP、caspases、p20、p41/43和p35。附圖9C圖形地說明了在以下柱形圖指定的條件下觀察到的野生型、表達(dá)NODI的、和表達(dá)CLARP的SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡百分比。使用的縮寫CHX(放線菌酮)、TNF(TNFoc)、gTri(/TriDAP)、gTC(yTriDAP+CHX)、aTC(ocTriDAP+CHX)。附圖10A、B和C提供了用野生型MCF-7乳腺癌細(xì)胞、NODI敲除的MCF-7細(xì)胞和Nodl-轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞分別接種的小鼠的圖像。用3x106人類乳腺癌細(xì)胞皮下地接種小鼠。箭頭指示皮下的腫瘤，其在附圖10B的放大圖像中示出。附圖11A-D說明了在SCID小鼠中Nodi的存在阻止腫瘤生長。附圖11A圖形地說明了，在用MCF-7C20(左側(cè))和MCF-7C20/Nodl(右側(cè))細(xì)胞注射的小時(shí)中，作為時(shí)間的函數(shù)的腫瘤體積。將細(xì)胞(3乂106個(gè)細(xì)胞/小鼠)注射到雌性SCID小鼠的肋部。每周測量腫瘤大小，根據(jù)公式f『2xZ^/2來確定體積。每條線代表在一個(gè)小鼠中觀察到的肺瘤(n=4)。如所說明的，在接受表達(dá)Nodi的腫瘤細(xì)胞(C20/Nodl)的小鼠中腫瘤體積減少。相比之下，在接受不表達(dá)Nodl的腫瘤細(xì)胞(C20細(xì)胞)的小鼠中腫瘤體積增加。附圖11B圖形地說明了在注射MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20/Nodl細(xì)胞(3乂106個(gè)細(xì)胞/小鼠)之前植入雌激素彈丸到小鼠中，除了腫瘤細(xì)胞表達(dá)Nodi時(shí)(C20/Nodl細(xì)胞)，都提高腫瘤生長。陰影柱代表接受雌激素彈丸的小鼠獲得的結(jié)果，而空心柱代表從未接受雌激素彈丸的小鼠獲得的結(jié)果。如上所述測定腫瘤體積。附圖11C圖形地說明了在用MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7RIP2ACARD細(xì)胞注射的小鼠中隨著時(shí)間的腫瘤體積。如所示，在接受MCF-7RIP2ACARD細(xì)胞(*)的小鼠中的腫瘤體積大約表達(dá)一定Nodl的小鼠中的(Blasto,實(shí)心菱形)，但小于不表達(dá)Nodl的小鼠中的(C20,實(shí)心正方形)。附圖11D圖形地說明了作為雌激素濃度的函數(shù)的肺瘤細(xì)胞生長。如所示，不表達(dá)Nodl的胂瘤細(xì)胞9MCF-7C20細(xì)胞)和表達(dá)突變的RIP2的腫瘤細(xì)胞(MCF-7RIP2ACARD細(xì)胞)對(duì)于雌激素更敏感，并展現(xiàn)了提高的腫瘤生長。MCF畫7Blasto、MCF畫7C20、MCF-7C20/Nodl和MCF-7RIP2△CARD細(xì)胞暴露于提高濃度的17|3-雌二醇，用3H-胸腺嘧啶脈沖，通過液體閃爍來測定細(xì)胞生長。數(shù)據(jù)是至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。附圖12A-C說明了在各種MCF-7腫瘤細(xì)胞系中雌激素提高yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，它莫西芬抑制丫TriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。附圖12A圖形地說明了在升高數(shù)量的雌激素以及放線菌酮(CHX)或CHX加/TriDAP(yTri)中培養(yǎng)的MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7CM/Nodl細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡百分比。附圖12B圖形地說明了在升高數(shù)量的它莫西芬以及放線菌酮(CHX)或CHX力口Y丁riDAP(Y丁ri)中培養(yǎng)的MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20/Nodl細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡百分比。對(duì)于雌激素研究，在活性炭處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，并在存在升高濃度的雌激素(E2)的情況下用Y丁riDAP/CHX刺激，通過碘化丙錠(PI)排出來測量細(xì)胞生存力。對(duì)于它莫西芬研究，在添加Y丁riDAP/CHX之前用它莫西芬處理細(xì)胞，通過PI排出來測量細(xì)胞生存力。附圖12C顯示了來自體外培養(yǎng)的細(xì)胞(左側(cè))和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞(右側(cè))的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的免疫印跡，說明了雌激素受體的表達(dá)在表達(dá)Nod1的細(xì)胞中降低。來自MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20/Nodl細(xì)胞，以及來自從肺瘤分離的細(xì)胞的總蛋白提取物，使用針對(duì)雌激素受體(ERoc)的抗體的免疫印跡來分析，ERK2作為加載對(duì)照。附圖13A-D說明了RIP2是Nodl細(xì)胞凋亡途徑的重要成分。附圖13A顯示了，在腫瘤細(xì)胞系中激酶缺陷性RIP2(RIP2KD)的穩(wěn)定表達(dá)壽t化了這些細(xì)胞對(duì)Nodl或Nod2活化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。用Myc-Nodl、Myc-RIP2(野生型)、Myc國RIP2KD和Myc誦RIP2△CARD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。然后在存在或缺少CHX(3ng/ml)的情況下用Y丁riDAP、ocTriDAP和MDP(各20jug/ml)處理測試細(xì)胞，而對(duì)照細(xì)胞不用這些試劑處理。然后用碘化丙錠(PI)孵育細(xì)胞，通過流式細(xì)胞計(jì)測量細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。附圖13B說明了在附圖13A中描述的相同MCF-7細(xì)胞系中細(xì)胞凋亡時(shí)TNF的影響。用TNF(10ng/ml)處理這些細(xì)胞系18小時(shí)，如附圖13A描述的評(píng)定細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。在所有測試的細(xì)胞系中TNF提高細(xì)胞凋亡。附圖13C顯示了，與MCF-7Nodl細(xì)胞相比，MCF-7RIP2KD細(xì)胞展現(xiàn)了提高的yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在存在CHX、存在升高濃度的Y丁riDAP或MDP的情況下孵育細(xì)胞48hr,如附圖13A描述的評(píng)定細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。附圖13D說明了在存在CHX(0.5mg/ml)或TNF的情況下在yTriDAP刺激后MCF-7Blasto、MCF-7Nodl和MCF-7RIP2野生型細(xì)胞的IL-8分泌。孵育之后，收獲細(xì)胞上清液，分析IL-8分泌。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提高的Nodl表達(dá)或N0D1活性引起腫瘤退化。因而本發(fā)明涉及向受試者施用提高Nodl表達(dá)或NOD1活性的N0D1多肽、Nodl核酸和試劑作為抗腫瘤治療。在某些實(shí)施方式中，提高Nodl表達(dá)或活性的試劑包括N0D1的肽活化劑，例如y-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE畫DAP)、y-D畫Gln-DAP(iQ-DAP)、D-Ala畫L-Glu國二氨基庚二酸(Y丁riDAP)，和其組合。雖然本發(fā)明預(yù)期治療任何類型的腫瘤，本發(fā)明的組合物和方法對(duì)于治療雌激素敏感的肺瘤和/或乳腺癌腫瘤也具有特別的實(shí)用性。N0D1先天的免疫系統(tǒng)由識(shí)別微生物、病毒、異常/損傷的宿主細(xì)胞等等成分的受體家族組成，啟動(dòng)宿主反應(yīng)來消除和殺死侵入的有機(jī)體或除去不正常的宿主細(xì)胞。近來，稱為Nod/Caterpillar家族的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞胞漿蛋白家族已經(jīng)與先天免疫反應(yīng)相聯(lián)系。這個(gè)家族的所有成員具有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域；核苦酸結(jié)合寡聚反應(yīng)結(jié)構(gòu)域(NBD/NOD)和羧基末端富亮氨酸重復(fù)(LRR)區(qū)域。家族成員的氨基終端區(qū)域，稱為效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，含有可變的結(jié)構(gòu)，其包括caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)、pyrin、BIR和其他結(jié)構(gòu)域。Nod/Caterpillar家族的兩個(gè)成員已經(jīng)特別地與針對(duì)感染的天生免疫反應(yīng)相聯(lián)系。這些成員被稱為NODl(CARD4)和NOD2(CARD15)。NOD1和NOD2的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域分別由一個(gè)和兩個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域組成。NODI和NOD2最先被提示是作為細(xì)菌脂多糖受體(LPS)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。隨后，發(fā)現(xiàn)的是，NOD配體來自細(xì)菌肽聚糖(PGN)而不是來自LPS。因而NOD1和NOD2可能作為感染期間細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)感受器起作用。然而，迄今為止進(jìn)行的研究表明，NOD1或NOD2缺陷的小鼠不是與免疫缺陷或提高的感染敏感性相關(guān)的明顯的顯性表型。NODI和NOD/Caterpillar家族的其他成員的核酸和氨基酸序列可以在本領(lǐng)域中，例如在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到。參見網(wǎng)站ncbi.nlm.nih.gov。例如，人類NODI的一個(gè)氨基酸序列在以下提供以便參考，為SEQIDNO:1(NCBI登記號(hào)碼Q9Y239;gi:20137579)。1MEEQGHSEME工工PSESHPHIQIAKSNREIiVTH工RNTQCIi41VDNIiKNDYFSAEDAEIVCACPTQPDKVRKIIiD闊SKGE81EVSEFFIiYHRP脇EIGFS121vntdpvsrytQQ固HIjGRDSKFVIjCYAQKeekl:lee;iym161DTI肌VGFSNESLGS愿IiAC副HTTGILNEQGETIFI201LGDAGVGKSMTGRLDAGVKFFFHFRCRMFS241CFKESDRIiCIjQDKLFKHYCYPERDPEEVFAFLLRFPHVAIi281FTFDGLDEIiHSDLDIjSRVPDSSCPWEPAHP321窗TG工EVPRGFSPSHIjRAY361PiFCWIIFRC401,FRAAFEGSPQLPDCTMTLTDVFLLVTEV訓(xùn)RMGPSS441LVQRNTRSPVET!L腦RDTIiCS卿VA訓(xùn)MEKSLFVFTQ481eevqasg]lqe:lpe:lgpggdq521IiDDRVGTQE!LLRFFQEWMPPAGAATTSCYP561PFliPFQCLQGSGPAREDLFKNKDHFQF狐FIiCGIiLSKAK601qkllrh:lvpaAMiRRKRKAIjWAHLFSSIiRGylkslprvqv641tf層:lrciyETQSQKVGQIi681KLTYCNACSADCSALSFVLHHFPKRJLALDIi畫n:lndygv721re:lqpcfsrlTVLRLSVNQITDGGVKVIiSEE薦YKIVTY761IiGIiYNNQ工TDVGARYVTKILDECKGIjTHIjKIjGKNK工TSEG801GKY跳AVKNSKSISEVGMWGNQVGDEGAKA腦ALR,841sijTtlslasngisteggks:la亂qqnts:l881NDE菌SLAEMIiKVNQTLKHLW.L3CQNQITAKGTAQLADAIi921IiNG肌IKPEEAKVYEDEKRIICF人類Nodi的核苷酸序列也是可獲得的，NCBI登記號(hào)碼BC040339(gi:25955660),以下列出為SEQIDNO:2以便參考。1CCCGGCCCCGGCGTCCCCGGACCATGGCGCTCTCCGGGCT41CTTCTCTAGCTCTCAGCGGCTGCGAAGTCTGTAAACCTGG8工TGGCCAAGTGATTGTAAGTCAGGAGACTTTCCTTCGOTT121CTGCCTTTGATGGCAAGAGGTGGAGATTGTGGCGGCGATT161ACAGMMCGTCTGGGAAGACAAGTTGCTGTTTTTATGGG201AATCGCAGGCTTGGAAGAGACAGAAGCAATTCCAGAAATA241薦TGGAAATTG馬ATTTAAACAATGTTGTTTTAAAACA281TTCTAACTTCAAAGAATGATGCCAGAAACTTAAAAAGGGG321CTGCGCAGAGTAGCAGGGGCCCTGGAGGGCGCGGCCTGM361TCCTGATTGCCCTTCTGCTGAGAGGACACACGCAGCTGAA401GATGAATTTGGGAAAAGTAGCCGCTTGCTACTTTAACTAT441GGAAGAGCAGGGCCACAGTGAGATGGAAATAATCCCATCA481GAGTCTCACCCCCACATTCAATTACTGAAAAGCAATCGGG521AACTTCTGGTCACTCACATCCGCAATACTCAGTGTCTGGT561GGACAACTTGCTGMGMTGACTACTTCTCGGCCGMGAT601GCGGAGATTGTGTGTGCCTGCCCCACCCAGCCTGACAAGG641TCCGCAAAM1TCTGGACCTGGTACAGAGCAAGGGCGAGGA681GGTGTCCGAGTTCTTCCTCTACTTGCTCCAGCAACTCGCA721GATGCCTACGTGGACCTCAGGCCTTGGCT'GCTGGAGATCG761GCTTCTCCCCTTCCCTGCTCACTCAGAGCAAAGTCGTGGT801CAACACTGACCCAGTGAGCAGGTATACCCAGCAGCTGCGA841CACCATCTGGGCCGTGACTCCAAGTTCGTGCTGTGCTM"G881CCCAGAAGGAGGAGCTGCTGCTGGAGGAGATCTACATGGA921CACCATCA1GGAGCTGGTTGGCTTCAGCAATGAGAGCCTG961GGCAGCCTGAACAGCCTGGCCTGCCTCCTGGACCACACCA1001CCGGCATCCTCAATGAGCAGGGTGAGACCATCTTCATCCT1041GGGTGATGCTGGGGTGGGCAAGTCCATGCTGCTACAGCGG1081CTGC脇GCCTCTGGGCCACGGGCCGGCTAGACGCAGGGG1121TCAAMTCTTCTTCCACTTTCGCTGCCGCATGTTCAGCTG1161CTTCAAGGAAAGTGACAGGCTGTGTCTGCAGGACCTGCTC1201TTCAAGCACTACTGCTACCCAGAGCGGGACCCCGAGGAGG1241TGTTTGCCTTCCTGCTGCGCTTCCCCCACGTGGCCCTCTT1281CACCTTCGATGGCCTGGACGAGCTGCACTCGGACTTGGAC1321CTGAGCCGTGTGCCTGACAGCTCCTGCCCCTGGGAGCCTG1361CCCACCCCCTGGTCTTGCTGGCCAACCTGCTCAGTGGGM1401GCTGCTCAAGGGGGCTAGCAAGCTGCTCACAGCCCGCACA1441GGCATCGAGGTCCCGCGCCAGTTCCTGCGGAAGAAGGTGC1481TTCTCCGGGGCTTCTCCCCCAGCCACCTGCGCGCCTATGC1521CAGGAGGATGTTCCCCGAGCGGGCCCTGCAGGACCGCCTG1561CTGAGCCAGCTGGAGGCCAACCCCAACCTCTGCAGCCTGT1601GCTCTGTGCCCCTCTTCTGCTGGATCATCTTCCGGTGCTT1641CCAGCACTTCCGTGCTGCCTTTGMGGCTCACCACAGCTG1681CCCGACTGCACGATGACCCTGACAGATGTCTTCCTCCTGG1721TCACTGAGGTCCATCTGAACAGGATGCAGCCCAGCAGCCT1761GGTGCAGCGGAACACACACAGCCCAGTGGAGACCCTCCAC1801GCCGGCCGGGACACTCTGTGCTCGCTGGGGCAGGTGGCCC18"ACCGGGGCATGGAGAAGAGCCTCTTTGTCTTCACCCAGGA1881GGAGGTGCAGGCCTCCGGGCTGCAGGAGAGAGACATGCAG1921CTGGGCTTCCTGCGGGCTTTGCCGGAGCTGGGCCCCGGGG1961GTGACCAGCAGTCC潔GAGTTTTTCCACCTCACCCTCCA2001GGCCTTCTTTACAGCCTTCTTCCTCGTGCTGGACGACAGG2041GTGGGCACTCAGGAGCrGCTCAGGITCTTCCAGGAGTGGA2081TGCCCCCTGCGGGGGCAGCGACCACGTCCTGCTATCCTCC2121CTTCCTCCCGTTCCAGTGCCTGCAGGGCAGTGGTCCGGCG2161CGGGAAGACCTCTTCAAGAACAAGGATCACTTCCAGTTCA2201CCAACCTCTTCCTGTGCGGGCTGTTGTCCAAAGCCAAACA2241GAAACTCCTGCGGCATCTGGTGCCCGCGGCAGCCCTGAGG2281AGAAAGCGCAAGGCCCTGTGGGCACACCTGTTTTCCAGC,C2321TGCGGGGCTACCTGAAGAGCCTGCCCCGCGTTCAGGTCGA2361AAGCTTCAACCAGGTGCAGGCC腦CCCACGTTCATCTGG2401ATGCTGCGCTGCATCTACGAGACACAGAGCCAGAAGGTGG2441GGCAGCTGGCGGCCAGGGGCATCTGCGCCAACTACCTCAA2481GCTGACCTACTGCAACGCCTGCTCGGCCGACTGCAGCGCC2521CTCTCCTTCGTCCTGCATCACTTCCCCAAGCGGCTGGCCC2561TAGACCTAGACAACAACAATCTCAACGACTACGGCGTGCG2601GGAGCTGCAGCCCTGCTTCAGCCGCCTCACTGTTCTCAGA2641CTCAGCGTAAACCAGATCACTGACGGTGGGGTAAAGGTGC2681TAAGCGAAGAGCTGACCAAATACAAAATTGTGACCTATTT2721GGGTT窗ACAACAACCAGATCACCGATGTCGGAGCCAGG2761TACGTCACCAAAATCCTGGATGMTGCAAAGGCCTCACGC2801ATCTTAAACTGGGAAAAAACAAAATAACAAGTGAAGGAGG2841GAAGTATCTCGCCCTGGCTGTGAAGAACAGCAAATCAATC2881TCTGAGGTTGGGATGTGGGGCAATCAAGTTGGGGATGAAG2921GAGCAAAAGCCTTCGC織GGCTCTGCGGAACCACCCCAG2961CTTGACCACCCTGAGTCTTGCGTCCAACGGCATCTCCACA3001GAAGGAGGAAAGAGCCTTGCGAGGGCCCTGCAGCAGAACA3041CGTCTCTAGAAATACTGTGGCTGACCCAAAATGAACTCAA3081CGATGAAGTGGCAGAGAGTTTGGCAGAAATGTTGAAAGTC3121AACCAGACGTTAAAGCATTTATGGCTTATCCAGAATCAGA3161TCACAGCTAAGGGGACTGCCCAGCTGGCAGATGCGTTACA3201GAGCAACACTGGCATAACAGAGATTTGCCTAAATGGAAAC3241CTGATAAAACCAGAGGAGGCCAAAGTCTATGMGATGAGA3281AGCGGMTATCTGTTTCTGAGAGGATGCTTTCCTGTTCAT3321GGGGTTTTTGCCCTGGAGCCTCAGCAGCAAATGCCACTCr3361GGGCAGTCTTTTGTGTCAGTGTCTTAAAGGGGCCTGCGCA3401GGCGGGACTATCAGGAGTCCACTGCCTCCATGATGCAAGC3441CAGCTTCCTGTGCAGAAGGTCTGGTCGGCAAACTCCCTM3術(shù)GTACCCGCTACAATTCTGCAGAAAAAGAATGTGTCTTGCG3521AGCTGTTGTAGTTACAGTAAATACACTGTGAAGAGACTTT3561ATTGCCTATTATAATTMTTTTATCTGAAGCTAGAGGMT3601AAAGCTGTGAGCAAACAGAGGAGGCCAGCC3641CCAACACCTGCCATAGGGACCAACGGGAGCGAGTTGGTCA3681CCGCTCTTTTCATTGAAGAGTTGAGGATGTGGCACAAAGT3721TGGTGCCAAGCTTCTTGAATAAAACGTGTTTGATGGATTA3761GTATTATACCTGAAATATTTTCTTCCTTCTCAGCACTTTC3801CCATGTATTGATACTGGTCCCACTTCACAGCTGGAGACAC3841CGGAGTATGTGCAGTGTGGGATTTGACTCCTCCAAGGTTT3881TGTGGAAAGrrAATGTCAAGGAAAGGATGCACCACGGGCT3921TTTAATTTTAATCCTGGAGTCTCACTGTCTGCTGGCAAAG3961ATAGAG層GCCCTCAGCTCTTAGCTGGTCTAAGAATGAC4001GATGCCTTCAAMTGCTGCTTCCACTCAGGGCTTCTCCTC4041TGCTAGGCTACCCTCCTCTAGAAGGCTGAGTACCATGGGC■1TACAGTGTCTGGCCTTGGGAAGAAGTGATTCTGTCCCTCC4121纖GAAATAGGGCATGGCTTGCCCCTGTGGCCCTGGCATC4161CAAATGGCTGCTTTTGTCTCCCTTACCTCG4201AAGTCTCTTCCTGCCTCCCAAGCAGCTGAAGGGTGACTAA4241ACGGGCGCCAAGACTCAGGGGATCGGCTGGGAACTGGGCC4281AGCAGAGCATGTTGGACACCCCCCACCATGGTGGGCTTGT4321GGTGGCTGCTCCATGAGGGTGGGGGTGATACTACTAGATC4361ACTTGTCCTCTTGCCAGCTCATTTGTTAATAAAATACTGA4401AAACACTAAAAAAAAAAAAAAANODI蛋白看起來在細(xì)菌識(shí)別中具有重要作用，可以作為細(xì)胞區(qū)室內(nèi)的特異性宿主模式識(shí)別受體起作用。近來的研究顯示，NODI是在含有二氨基庚二酸的細(xì)菌肽聚糖的宿主識(shí)別中所必需的(Chamaillard等人.，淑匿/畫畫/ogy，DOI:10.1038/ni945，June8，2003)。NODI識(shí)別的核心組織是二肽，y-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(也稱為iE-DAP)。這種二肽已知僅存在于有限數(shù)量的細(xì)菌中(￡^c/en'c/zz'<2co//矛口幾種革蘭氏P日'1"生纟田菌，j列^口Sac"/wssi/6n7^和發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，NODI使細(xì)胞對(duì)TNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感化，并且在缺少任何其他已知的細(xì)胞凋亡觸發(fā)的情況下，NODI特異性配體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。炎^^參,^W傳力^f《說效和強(qiáng)源:rM9Z)/4,*遂化哞^^的#^7。特別地，如此處所示，置入SCID小鼠的MCF-7乳腺腫瘤細(xì)胞的異種移植物一般形成肺瘤。然而，稍后，這些肺瘤一般會(huì)退化，即使沒有抗肺瘤治療。但是，當(dāng)NODrAMCF-7腫瘤細(xì)胞移植到小鼠中時(shí)，腫瘤不會(huì)退化，反而繼續(xù)生長(參見附圖10)。當(dāng)將NOD1功能添加回NodrAMCF-7胂瘤細(xì)胞時(shí)(通過適合的遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染)，通過移植這些NODI表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤現(xiàn)在將會(huì)退化。因此，NODI表達(dá)可以幫助控制腫瘤細(xì)胞生長，并且可以引起腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。本發(fā)明還提供了保持了細(xì)胞凋亡活性的NODI突變(V41Q)多肽。這種V41Q突變NODI多肽的序列以下作為SEQIDNO:3提供，V41Q突變是粗體和下劃線的。1MEEQGHSEMEI工PSESHPHIQKLKSNRELIiVTHIRNTQCL41gDNLLKNDYFSAEDAEIVCACPTQPDKVRKILDLVQSKGE81EVSEFFLYMiQQIADAYVDLRPWIiE工GFSPSIiTQSKVV121VNTDPVSRYTQQ適腦RDSK昆CYAQKEEliLEElYM161DTIME跳FSNESliGSLNSLac:l:ld證gi函QGETIF工201IjGDAGVGKSM則RLQS腿TGRLDAGVKFFFHFRCRMFS241CFKESDRLCL卿:lfkhycyP:ERDPEEVFAFKLRFTHVAIi281FTFDGIiDELHSD區(qū)srvpdSSCPWEPAHPlv:l;lan:llsg321KliLKGASKIiTARTGIEVPRQFLRKKVIiliRGFSPSHL證361ARRMFPERALQDRLIiSQLEAnpn:lcs:lcsvPLFCWII潔術(shù)FGHFRAAFEGSPGLPDC雷IjTDVFLLVTEvh:lnrmqpss441環(huán)麗RSPVETLHAGRDTIiCSLGQVAHRGMEKSLFVFTQ481eevqasglqe畫q:lgf:lraIiPELGPGGDGqsyeff歸:l521QAFFTAFFIjVLDDRVGTQEIi;lrftqewmppAGAATTSCYP561pf:lpfqclqgsgparedlfknkdhfqft肌flcgllskak601aalrrkrkalwah:lfss:lrgYIiKS!lprvgv641esfnqvqamptfiwmlrciyetqsqkvgq:laarg工ca肌681kltycnacsadcsalsfvlhhfpkrla區(qū)d麵lndygv721REIiQPCFSRIjtvlrlsvnqitdggv跳see:ltkykivty761vg廳vtkildeckglthlkLGKNiaTSEG801gky:l磁vknsksisevgmwgnqvgdegakafaea確hp841SliTTLSlASNGISTEGGKSIjARAIiQQNTSIjEILWIjTQNEIi881NDEVAESLAEMLKVNQT躍IiW;LIQNQ工TAKGTAQLADAL921qsntg工te工cl訓(xùn)likpeeakvyedekriicf突變VWQ存在于Nodi的CARD結(jié)構(gòu)域中，早先被報(bào)道破壞Caspase9與Nodi的結(jié)合。然而，與表明V41Q突變抑制Nodi依賴性細(xì)胞凋亡的早先的結(jié)果相反，發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示V41Q突變多肽在細(xì)胞凋亡途徑中是活性的(附圖4)。腫瘤本發(fā)明的組合物和方法在各種癌癥和腫瘤的治療中是有用的，包括但不限于雌激素敏感性腫瘤，以及乳腺、膀胱、宮頸、結(jié)腸、膽嚢、腎臟、肝臟、肺、胰腺、卵巢、前列腺、皮膚、胃、曱狀腺等等的胂瘤。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物可以用于治療或預(yù)防癌癥，例如膀胱、乳腺、結(jié)腸、腎臟、肝臟、肺，包括小細(xì)胞肺癌、食道、膽嚢、卵巢、胰腺、胃、宮頸、曱狀腺、前列腺和皮膚，包括鱗狀細(xì)胞癌的癌癥；淋巴系統(tǒng)的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、Hodgkin's淋巴瘤、非Hodgkin's淋巴瘤、毛纟田胞淋巴瘤和Burkett's淋巴瘤；骨髓系統(tǒng)的造血腫瘤，包括急性和慢性粒性白血病、脊髓發(fā)育不良綜合征和早幼粒細(xì)胞性白血病；間質(zhì)起源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；中央和外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤和許旺氏細(xì)胞瘤；其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、著色性干皮病、keratoxanthoma、曱狀腺濾泡癌癥和Kaposi's肉瘤。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明可以用于治療或預(yù)防乳腺癌癥和肺瘤。例如，N0D1多肽、Nodl核酸、可以提高NOD1表達(dá)或活性試劑，或其組合，可以單獨(dú)地、與其他因子例如TNF組合地至少到腫瘤內(nèi)或鄰近腫瘤，來引起胂瘤細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。因而，本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療癌癥。調(diào)節(jié)NOD1表達(dá)和活性根據(jù)本發(fā)明的，提高的N0D1表達(dá)和/或N0D1活性促進(jìn)了腫瘤的退化。因此，本發(fā)明提供了治療和防止哺乳動(dòng)物中腫瘤生長的方法，通過向所述哺乳動(dòng)物施用N0D1多肽、Nodl核酸、提高N0D1表達(dá)和/或活性的試劑、或其組合。提高N0D1表達(dá)或活性的試劑包括可以提高N0D1的轉(zhuǎn)錄、翻譯或活性的任何試劑。因而，通過施用NOD1多肽(例如，SEQIDNO:1)、編碼N0D1多肽的核酸(例如，包含SEQIDNO:2的核酸)，腫瘤退化的發(fā)生率可以被提高或促進(jìn)。編碼N0D1的核酸可以置于表達(dá)盒中，和/或在載體中維持，以便操作、表達(dá)和復(fù)制。以下更詳細(xì)地說明了產(chǎn)生編碼N0D1并且可以表達(dá)NODl多肽的核酸的方法。提高N0D1表達(dá)或活性的試劑包括增強(qiáng)N0D1活性的小的肽基配體。例如，y-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、"D-Gln-DAP(iQ-DAP)、D誦Ala-L畫Glu-二氨基庚二酸(fTriDAP)和其組合，可以提高N0D1表達(dá)或活性。在某些實(shí)施方式中，僅Y-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)或僅Y-D-Gln-DAP(iQ-DAP)，或僅D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(Y丁riDAP)被使用或施用。在其他實(shí)施方式中，y-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、Y-D-Gln-DAP(iQ-DAP)和/或D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(fTriDAP)的組合被使用或施用。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在受試者中調(diào)節(jié)NODI活性的方法，包括提供能夠改變受試者的NODI活性的試劑；在一定條件下向受試者施用所述試劑，從而改變受試者的NODI活性。在某些實(shí)施方式中，向受試者施用所述試劑引起受試者內(nèi)腫瘤的退化。本發(fā)明不局限于特定的化合物。實(shí)際上，各種化合物是期待的，包括但不限于，包含D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(yTriDAP)的肽、谷氨酰胺-二氨基庚二酸二肽和包含谷氨酸-二氨基庚二酸二肽(例如，iE-DAP、iQ-DAP、iE-DAP或iQ-DAP的類似物、正-DAP或iQ-DAP的小分子模擬物)的肽。聯(lián)合治療本發(fā)明預(yù)期采用NOD1促進(jìn)劑和其他可用的抗腫瘤治療劑的組合的組合物和方法。常規(guī)的抗腫瘤劑的劑量通常保持盡可能低，因?yàn)樵谳^高的劑量可能觀察到副作用。根據(jù)本發(fā)明，NOD1和/或提高NOD1表達(dá)或活性的試劑與可用的抗腫瘤劑的組合，可以改善所述抗腫瘤劑有效的癌癥的范圍(spectrum),并且降低所需的所述抗腫瘤劑的劑量。因而，本發(fā)明預(yù)期當(dāng)前的NOD1相關(guān)試劑與一種或多種抗腫瘤或制癌試劑的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何抗腫瘤和制癌試劑可以與當(dāng)前的NOD1相關(guān)試劑一起使用。然而，在某些實(shí)施方式中，選擇的抗肺瘤或抗癌試劑具有不同的作用機(jī)制，或針對(duì)多少不同類型的癌癥或腫瘤起作用。例如，本發(fā)明的NODl相關(guān)試劑可以與制癌試劑或免疫活化劑組合，來組合NOD1的前細(xì)胞凋亡效果以及所述制癌試劑的抗贅生效果，和/或由所述免疫活化劑誘導(dǎo)的前免疫反應(yīng)。進(jìn)一步的，在某些情況下，除了這些方法之外進(jìn)行放療或外科治療來改善治療的效果。可以與本發(fā)明的NOD1相關(guān)試劑一同使用的其他化學(xué)治療劑的實(shí)例包括六曱密胺、博來霉素、馬利蘭、亞葉酸鈣、卡培他濱、卡鉑、卡氮芥、苯丁酸氦芥、順鉑、克拉屈濱、Crisantaspase、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、放線菌素、紅比霉素、多西他賽、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體阿霉素、環(huán)己亞硝脲、苯丙氨酸氮芥、巰基嘌呤、氨曱蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、噴司他丁、曱基千肼、雷替曲塞、鏈脲霉素、優(yōu)福定、泰莫佐羅、硫替派、巰基鳥噪呤/硫鳥嘌呤、拓樸替康、蘇消安、長春花堿、長春新石成、去乙酰長春酰胺、長春烯石咸和其組合。在某些實(shí)施方式中，與一種或多種激素聯(lián)合施用NOD1相關(guān)試劑。例如，可以與一種或多種雄激素、黃體酮、雌激素或抗雌激素聯(lián)合施用NOD1相關(guān)試劑。通過向?qū)Υ萍に仄鸱磻?yīng)的細(xì)胞或組織發(fā)揮對(duì)抗效應(yīng)，或通過與雌激素竟?fàn)幬挥诩?xì)胞表面的受體位點(diǎn)，抗雌激素起作用。例如，藥物它莫西芬(商品名Nolvadex)或Arimidex(Anastrozole)是可以使用的抗雌激素。它莫西芬已經(jīng)用于乳腺癌的治療，并用以降低高風(fēng)險(xiǎn)婦女中的乳腺癌發(fā)病率。如在此所示的，添加它莫西芬部分地阻斷了丫TriDAP-Nodl誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此，在某些情況下，它莫西芬可以不用于本發(fā)明的NOD1組合物中。然而，在其他例子中，當(dāng)被包括在包含了NOD1試劑施用的治療方案中時(shí)，它莫西芬可能是有用的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的NOD1相關(guān)試劑與腫瘤壞死因子cc(TNFa)聯(lián)合施用。TNFcc是商業(yè)上可獲得的，例如，來自Pro-SpecTanyTechnoGeneLtd.(Israel)。腫瘤壞死因子的序列可以在ncbi.nlm.mh.gov的NCBI數(shù)據(jù)庫中找到。人類TNFoc的序列的一個(gè)實(shí)例以下在SEQIDNO:4中提供。1MSTESMIRDVEL應(yīng)ALPKKTGGPQGS訓(xùn)LFLSLFSFU41VAGATTLFCIiLHFGVIGPQREESPRDLSUSPLAQAVRSS81S證SDKPVAHWANPQAEGQLQWLNRRANAIAANGVEiLR121DNQIjWPSEGLYIilYSQVLFKGQGCPSTHVIi!L窗ISR工a161VSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVF201OLEKGDRLSAE皿PDYLDFAESGQVYFGIIAL細(xì)胞凋亡如在此描述的，NODI可以促進(jìn)肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。為了治療或防止腫瘤生長，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇采用抗腫瘤劑與在此描述的NODI相關(guān)試劑的組合。含有各種抗腫瘤劑以及本發(fā)明的NODI相關(guān)試劑的組合物，可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的各種方法中測試，來確定這些組合物是否最佳地促進(jìn)腫瘤退化和/或肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。例如，通過檢測細(xì)胞凋亡期間產(chǎn)生的DNA片段的3'-OH游離末端的TUNEL(TdT介導(dǎo)的dUTP斷口-末端標(biāo)記)標(biāo)記，可以分析細(xì)胞凋亡(Gavneli等人.(1992)J.CellBiol.119:493)。TUNEL分析一般包括向180-bp(堿基對(duì))的寡聚DNA片段添加催化地添加核苷酸以檢測所述片段，所述核苷酸以及與發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)結(jié)合或與熒光標(biāo)簽結(jié)合。180-bp寡聚體的DNA階梯的存在是細(xì)胞凋亡的指示。根據(jù)TUNEL方法檢測細(xì)胞死亡的步驟是商業(yè)上可獲得的，例如，來自BoehringerMannheim(CellDeathi式齊寸盒)和Oncor(apoptagPlus)。當(dāng)前可獲得的另一個(gè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志物是annexin，以商標(biāo)APOPTESTTM銷售。annexin標(biāo)志物被用于"細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，，中，其也是商業(yè)上可獲得的，例如，來自R&DSystems。在細(xì)胞凋亡期間，細(xì)胞膜的磷脂不對(duì)稱性改變，從而磷脂被暴露在外膜上。Annexins是在存在鈣的情況下結(jié)合磷脂的蛋白質(zhì)的同源物組。第二試劑可以用于與檢測annexin的試劑碘化丙錠(PI)連接，其是DNA結(jié)合焚光染料。當(dāng)細(xì)胞群體暴露于兩種試劑時(shí)，細(xì)胞凋亡的細(xì)胞對(duì)于annexin陽性地染色，對(duì)于PI陰性地染色，壞死的細(xì)胞對(duì)于兩者都是染色陽性的，而活細(xì)胞對(duì)于兩者是染色陰性的。測試細(xì)胞凋亡的其他方法是本領(lǐng)域已知的，可以用于本發(fā)明的方法中。腫瘤退化可以通過使用動(dòng)物模型來評(píng)定，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何動(dòng)物模型，或在此描述和說明的異種移植模型。異種移植模型本發(fā)明還提供了異種移植模型，其包括能夠在小鼠中形成腫瘤的細(xì)胞系。當(dāng)用這些異種移植細(xì)胞接種小鼠時(shí)，腫瘤出現(xiàn)。本發(fā)明的異種移植細(xì)胞系缺少Nodi功能，在此有時(shí)稱為Nod卜細(xì)胞。令人驚訝地，具有相同遺傳背景、除了存在與零Nodl等位基因相對(duì)的野生型之外的細(xì)胞，形成很快退化的紳瘤。僅缺乏Nodi功能的Nod卜細(xì)胞形成繼續(xù)生長的腫瘤。根據(jù)本發(fā)明的，這些分離的Nodl;細(xì)胞對(duì)于研究腫瘤和胂瘤退化是有用的。本發(fā)明的Nodl^細(xì)胞因而可以用于開發(fā)化學(xué)治療劑，和用于研究肺瘤發(fā)生的機(jī)制。26本發(fā)明的分離的Nod1,細(xì)胞系的一個(gè)實(shí)例是MCF-7C20細(xì)胞系。當(dāng)C20克隆被移植到雄性小鼠中時(shí)，發(fā)明人觀察到了更健壯的腫瘤生長。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增研究確定了，在MCF-7C20細(xì)胞中，和在重組導(dǎo)入了功能性的N0D1等位基因的MCF-7C20細(xì)胞(即，C20Nodl細(xì)胞)中，沒有孕激素受體。進(jìn)一步的PCR研究揭示了，雌激素受體oc存在于所有三種MCF7細(xì)胞類型(野生型MCF-7細(xì)胞、MCF-7C20細(xì)胞和MCF-7C20Nodl細(xì)胞)的每一種中。Nodl表達(dá)盒和載體根據(jù)本發(fā)明的，NOD1多肽可以重組地產(chǎn)生，然后純化，用于作為抗胂瘤劑向受試者施用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，編碼NOD1的核酸可以置于表達(dá)盒和/或表達(dá)載體中。這些NOD1表達(dá)盒和表達(dá)載體也可以作為抗胂瘤劑向受試者施用。因此，本發(fā)明提供了Nodl表達(dá)盒和Nodl表達(dá)載體。NOD1多肽的哺乳動(dòng)物表達(dá)可以如Dijkema等人.，EMBOJ.(1985)4:761,Go謹(jǐn)n等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79:6777,Boshart等人.,Cell(1985)41:521和美國專利No.4,399,216中描述的實(shí)現(xiàn)。哺乳動(dòng)物表達(dá)的其他特征可以如HamandWallace,Meth.Enz.(1979)58:44，BarnesandSato,Anal.Biochem.(1980)102:255，美國專利Nos.4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655，WO90/103430、WO87/00195和美國專利No.RE30,985中描述的來便利化。使用這種Nodl核酸可以增加或替換內(nèi)源Nodl基因的表達(dá)。Nodl核酸可以置于線性或環(huán)形分子內(nèi)。它們可以置于自主復(fù)制的分子內(nèi)，或沒有復(fù)制序列的分子內(nèi)。它們可以通過它們自身，或通過其他調(diào)節(jié)序列來調(diào)節(jié)，這是本領(lǐng)域已知的。編碼NODI的核酸構(gòu)建體可以包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，例如，啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子或UAS元件，和轉(zhuǎn)錄終止子信號(hào)，用于控制Nodl序列在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。Nodl核酸可以用于表達(dá)盒或基因遞送載體中，以向細(xì)胞、優(yōu)選的真核細(xì)胞中遞送NodlmRNA、全長NODl蛋白、NODI融合蛋白、NODI多肽，或NODI多肽的片段。根據(jù)本發(fā)明，基因遞送載體可以是，例如，棵質(zhì)粒DNA，病毒表達(dá)載體，或連同脂質(zhì)體或凝聚劑的本發(fā)明的Nodl核酸。胞中，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白聚陽離子介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，用棵的或密封的核酸轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、DNA包被的乳液珠子細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、原生質(zhì)體融合、病毒感染、電穿孔、核酸微注射步驟的使用和磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因遞送載體包含啟動(dòng)子和NOD1編碼核酸。可以使用的啟動(dòng)子的實(shí)例包括組織特異性啟動(dòng)子和通過細(xì)胞增殖激活的啟動(dòng)子，例如胸苷激酶和胸苷酸合成酶啟動(dòng)子。其他優(yōu)選的啟動(dòng)子包括通過病毒的感染激活的啟動(dòng)子，例如oc-和(3-干擾素啟動(dòng)子，和可以被激素例如雌激素激活的啟動(dòng)子。可以使用的其他啟動(dòng)子包括Moloney病毒LTR、CMV啟動(dòng)子和小鼠白蛋白啟動(dòng)子。基因遞送載體可以包含病毒序列，例如病毒復(fù)制起點(diǎn)或包裝信號(hào)。這些病毒序列可以選自例如星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、畐ij粘病毒、纟田小病毒、孩i小RNA病毒、痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、togavirus或腺病毒的病毒。在某些實(shí)施方式中，所述基因遞送載體是重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和其各種用途以及在許多參考文獻(xiàn)中描述了，包括，例如Mann等人.，Cell33:153,1983，CaneandMulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6349，1984,Miller等人.，HumanGeneTherapy1:5-14，1990，美國專利Nos.4,405,712、4,861,719和4,980,289以及PCT申請(qǐng)Nos.WO8衡,468、WO89/05,349和WO90/02,806。可以在本發(fā)明中使用許多逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體，包括例如在EP0,415,731;WO90/07936;WO94/03622;WO93/25698;WO93/25234;美國專利No.5,219,740;WO9311230;WO9310218;VileandHart，CancerRes.53:3860-3864,1993;VileandHart，CancerRes.53:962-967,1993;Ram等人，CancerRes.53:83-88，1993;Takamiya等人.，J.Neurosd.Res.33:493-503,1992;Baba等人.，J.Neurosurg.79:729-735，1993(美國專利No.4,777,127、GB2,200,651、EP0,345,242和W091102805中描述的那些。可以利用的逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例包括禽白血病病毒(ATCCNos.VR-535和VR-247)、牛白血病毒(VR-1315)、鼠白血病毒(MLV)、貂細(xì)胞灶誘導(dǎo)病毒(KocheUl.，J.Vir.49:828,1984;和Oliff等人.，J.Vir.48:542，1983)、鼠肉瘤病毒(ATCCNos.VR-844,45010和45016)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(ATCCNos.VR-994、VR-770和45011)、勞氏肉瘤病毒、Mason-Pfizer猴病毒、狒狒內(nèi)生病毒、內(nèi)源的貓科逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，RD114)和用作逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的小鼠或大鼠gL30序列。從中可以產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的MLV毒抹包括4070A和1504A(HartleyandRowe,J.Vir.19:19,1976)、Abelson(ATCCNo.VR-999)、Friend(ATCCNo.VR-245)、Graffi(Ru等人.，J.Vir.67:4722，1993;和YantchevNeopksma26:397,1979)、Gross(ATCCNo.VR-590)、Kirsten(Albino等人.,J.Exp.Med.164:1710，1986)、Harvey肉瘤病毒(Manly等人，J.Vir.62:3540,1988;和Albino等人，J.Exp.Med.164:1710，1986)和Rauscher(ATCCNo.VR-998)以及MoloneyMLV(ATCCNo.VR-190)。可以使用的非小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒是勞氏肉瘤病毒，例如Bratislava(Manly等人.，J.Vir.62:3540,1988;和Albino等人.，J.Exp.Med.164:1710,1986)、Bryan高滴度(例如，ATCCNos.VR-334,VR-657,VR-726,VR-659和VR曙728)、Bryan標(biāo)準(zhǔn)(ATCCNo.VR國140)、Carr-Zilber(Adgighitov等人.，Neoplasma27:159,1980)、Engelbreth-Holm(Laurent等人.，BiochemBiophysActa908:241，1987)、Harris、Prague(例如，ATCCNos.VR-772,和45033)或Schmidt-Ruppin(例如ATCCNos.VR-724、VR-725、VR-354)病毒。根據(jù)在此提供的公開和標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)(例如，Sambrook等人.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，2ndEdition(1989),Sambrook等人.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition(2001)以及Kunkle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:488，1985)，可以容易地使用上述逆轉(zhuǎn)錄病毒的任一種來組合或構(gòu)建逆表達(dá)基因遞送載體。逆表達(dá)表達(dá)載體的部分可以來自不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR可以衍生自鼠肉瘤病毒，來自勞氏肉瘤病毒的tRNA結(jié)合位點(diǎn)，來自鼠白血病毒的包裝信號(hào)，以及來自禽白血病病毒的第二鏈合成起點(diǎn)。通過導(dǎo)入合適的包裝細(xì)胞系，這些重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)感受態(tài)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒(參見，1991年11月29日體積的系列No.071800,921)。可以產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，其指導(dǎo)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組向宿主細(xì)胞DNA的特定區(qū)域的位點(diǎn)特異性整合。這種位點(diǎn)特異性整合對(duì)于突變或替換內(nèi)源NODI基因是有用的。通過摻入到逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中的嵌合的整合酶，可以介導(dǎo)位點(diǎn)特異性整合(參見，1995年5月22日提交的系列No.08/445,466)。優(yōu)選的是，重組病毒基因遞送載體是復(fù)制缺陷的重組病毒。適合與上述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體使用的包裝細(xì)胞系可以容易地制備(參見WO92/05266)，并用于產(chǎn)生生產(chǎn)者細(xì)胞系(也稱為載體細(xì)胞系或"VCL")用于重組病毒顆粒的生產(chǎn)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，包裝細(xì)胞系由人類(例如HT1080細(xì)胞)或貂母細(xì)胞系制成，從而容許產(chǎn)生能夠在人類血清的鈍化中存活的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體。這種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體的構(gòu)建在WO91/02805中詳細(xì)描述了。這些重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體可以用于通過將它們導(dǎo)入合適的包裝細(xì)胞系來產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)感受態(tài)的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。類似地，根據(jù)在此提供的公開(還參見，Berkner，Biotechniques6:616-627，1988和Rosenfeld等人,Science252:431-434，1991、WO93/07283，WO93/06223和WO93/07282)，可以容易地制備和使用腺病毒基因遞送載體。基因遞送載體也可以是重組腺病毒基因遞送載體。根據(jù)在此提供的公開和本領(lǐng)域可獲得的信息(參見，例如Berkner，Biotechniques6:616,1988以及Rosenfeld等人.，Science252:431,1991,WO93/07283,WO93/06223和WO93/07282)，可以容易地制備和使用這種工具。也可以構(gòu)建和使用腺相關(guān)病毒基因遞送載體來體內(nèi)或體外地遞送本發(fā)明的蛋白質(zhì)或核酸到細(xì)胞中。在Chatteijee等人.，Science258:1485-1488(1992),Walsh等人.,Pro"Natl.Acad.Sci.89:7257-7261(1992)，Walsh等人.,J.Clin.Invest94:1440-1448(1994)，F(xiàn)lotte等人.，J.Biol.Chem.268:3781-3790(1993)，Ponnzhagan等人.，J.Exp.Med.179:733-738(1994)，Miller等人,Proc.NatlAcad.Sci.91:10183-10187(1994),Emerhand等人，GeneTher.2:336-343(1995)，Luo等人，Exp.Hematol.23:1261-1267(1995)和Zhou等人，GeneTherapy3:223-229(1996)中描述了腺相關(guān)病毒基因遞送載體的體外使用。這些工具的體內(nèi)使用在Flotte等人.，Proc.NatlAcad.Sci.90:10613-10617(1993)以及Kaplitt等人，NatureGenet.8:148-153(1994)中描述了。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，基因遞送載體來自被膜病毒。這種被膜病毒包括甲病毒，例如在1995年3月15日添加的美國系列號(hào)No.08/405,627，WO95/07994中描述的。曱病毒，包括Sindbis和ELVS病毒，可以是用于本發(fā)明的核酸的基因遞送載體。在WO94/21792、WO92/10578和WO95/07994中描述了曱病毒。可以構(gòu)建和使用幾種不同的甲病毒屬基因遞送載體來根據(jù)本發(fā)明將核酸遞送到細(xì)胞中。這種系統(tǒng)的代表性實(shí)例包括在美國專利NO.5,091,309和5,217,879中描述的那些。在某些實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的甲病毒屬基因遞送載體包括在WO95/07994中描述的那些。重組病毒載體也可以是基于Sindbis病毒的重組曱病毒屬病毒載體。可以容易地制備Sindbis構(gòu)建體，以及許多類似的構(gòu)建體。Sindbis病毒基因遞送載體一般包含能夠啟動(dòng)Sindbis病毒轉(zhuǎn)錄的5'序列、編碼Sindbis非結(jié)構(gòu)蛋白的核苦酸序列、被鈍化以防止片段轉(zhuǎn)錄的病毒連接區(qū)，以及SindbisRNA聚合酶識(shí)別序列。任選的，病毒連接區(qū)可以被修改，從而核酸轉(zhuǎn)錄被降低、提高或維持。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解的是，來自其他甲病毒的相應(yīng)區(qū)域可以在上述那些中使用。曱病毒衍生的基因遞送載體的病毒連接區(qū)可以包含第一病毒連接區(qū)，其已經(jīng)被鈍化以阻止核酸的轉(zhuǎn)錄，和第二病毒連接區(qū)，其已經(jīng)被修飾從而核酸轉(zhuǎn)錄被降低。曱病毒衍生的載體也可以包括能夠從cDNA啟動(dòng)病毒RNA的合成的5'啟動(dòng)子，以及控制轉(zhuǎn)錄終止的3'序列。可以在本發(fā)明中使用的其他重組被膜病毒基因遞送載體包括來自SemlikiForest病毒(ATCCVR國67;ATCCVR-1247)、Middleberg病毒(ATCCVR-370)、羅斯河病毒(ATCCVR-373;ATCCVR-1246)、委內(nèi)端拉馬腦炎病毒(ATCCVR923;ATCCVR-1250;ATCCVR-1249;ATCCVR-532)的那些，以及在美國專利5,091，309和5,217,879中，和在WO92/10578中描述的那些。適用于本發(fā)明的其他病毒基因遞送載體包括，例如，來自脊髓灰質(zhì)炎病毒(Evans等人.，Nature339:385,1989,和Sabin等人，J.Biol.Standardization1:115，1973)(ATCCVR-58);鼻病毒(Arnold等人.,J.Cell.Biochem.L401,1990)(ATCCVR-1110);疽病毒，例如金絲雀痘病毒或牛痘病毒(Fisher-Hoch等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.86:317,1989;Flexner等人.,Ann.N.Y.Acad.Sci.569:86，1989;Flexner等人，Vaccine8:17,1990;美國專利Nos.4，603，112和4,769,330;WO89/01973)(ATCCVR-111;ATCCVR-2010);SV40(Mulligan等人.,Nature277:108，1979)(ATCCVR-305)，(Madzak等人，J.Gen.Vir.73:1533,1992);流感病毒(Luytjes等人.，Cell59:1107,1989;McMicheal等人.，TheNewEnglandJournalofMedicine309:13,1983;和Yap等人.，Nature273:238,1978)(ATCCVR-797);細(xì)小病毒，例如腺病毒相關(guān)病毒(Samulski等人.，J.Vir.63:3822，1989,和Mendelson等人，Virology166:154，1988)(ATCCVR-645);單純性皰滲病毒(Kit等人.，Adv.Exp.Med.Biol.215:219，1989)(ATCCVR-977;ATCCVR-260);Nature277:108，1979);人類免疫缺陷性病毒(EPO386,882，Buchschacher等人.,J.Vir.66:2731，1992);麻滲病毒(EPO440,219)(ATCCVR-24);A(ATCCVR-67;ATCCVR-1247),Aura(ATCCVR-368)，Bebaru病毒(ATCCVR-600;ATCCVR-1240),Cabassou(ATCCVR-922),Chikimgunya病毒(ATCCVR-64;ATCCVR-1241)，F(xiàn)ortMorgan(ATCCVR-924),Getah病毒(ATCCVR-369;ATCCVR-1243)，Kyzylagach(ATCCVR-927)，Mayaro(ATCCVR-66)，Mucambo病毒(ATCCVR-580;ATCCVR-1244)，Ndumu(ATCCVR-371),Pixuna病毒(ATCCVR-372;ATCCVR-1245),Tonate(ATCCVR-925),Triniti(ATCCVR-469),Una(ATCCVR-374),Whataroa(ATCCVR-926),Y-62誦33(ATCCVR陽375)，O'Nyong病毒，東方腦炎病(ATCCVR-65;ATCCVR-1242),西方腦炎病毒(ATCCVR-70;ATCCVR-1251;ATCCVR-622;ATCCVR-1252),和冠狀病毒(Hamre等人.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.121:190,1966)(ATCCVR-740)。本發(fā)明的核酸也可以與凝聚劑組合來形成基因遞送載體。在某些實(shí)施方式中，所述凝聚劑是聚陽離子，例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸、魚精蛋白、精胺、亞精胺和腐肉胺。在凝聚劑和核酸之間產(chǎn)生連接的許多適合的方法是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，1994年12月30日提交的系列號(hào)No.08/366,787)。在選擇性的實(shí)施方式中，Nodi核酸或Nodi多肽與脂質(zhì)體締合來形成基因遞送載體。脂質(zhì)體是小的、脂質(zhì)泡嚢，由被脂雙分子層封閉的含水區(qū)室組成，一般是球形或稍微長形的結(jié)構(gòu)，直徑數(shù)百埃。在適合的條件下，脂質(zhì)體可以與細(xì)胞的質(zhì)膜融合，或與內(nèi)在化了脂質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)吞泡嚢的膜融合，從而釋放它的內(nèi)容物到細(xì)胞質(zhì)中。然而，在與細(xì)胞的表明相互作用之前，脂質(zhì)體膜作為相對(duì)不可滲透的層起作用，其隔離并保護(hù)了它的內(nèi)含物，例如，遠(yuǎn)離降解性酶。此外，由于脂質(zhì)體是合成的結(jié)構(gòu)，可以產(chǎn)生包含期望的特征的特別設(shè)計(jì)的脂質(zhì)體。參見Stryer,Biochemistry,pp.236-240，1975(W.H.Freeman,SanFrancisco,Calif);Szoka等人.，Biochim.Biophys.Acta600:1，1980;Bayer等人.，Biochim.Biophys.Acta.550:464,1979;Ri窗y等人.，Meth.Enzymol.149:119，1987;Wang等人.，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.84:7851,1987,Plant等人.，Anal.Biochem.176:420,1989,以及美國專利No.4,762,915。脂質(zhì)體可以密封各種核酸和多肽分子，包括DNA、RNA、質(zhì)粒、包含在本發(fā)明中公開的那些核酸的表達(dá)構(gòu)建體，和Nodi多肽。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制品包括陽離子的(帶正電的)、陰離子的(帶負(fù)電的)和中性的制品。陽離子脂質(zhì)體已經(jīng)顯示了介導(dǎo)質(zhì)粒DNA(Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7416,1987)、mRNA(Malone等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6077-6081,1989)和純化的轉(zhuǎn)錄因子(Debs等人，J.Biol.Chem,265:10189-10192,1990)以功能形式的細(xì)胞內(nèi)遞送，陽離子脂質(zhì)體是容易獲得的。例如，N[l-2，3-dioleyIoxy)丙基]-N,N,N-三乙基胺(DOTMA)脂質(zhì)體是以商標(biāo)LipofectinTM可從GIBCOBRL,GrandIsland,N.Y獲得的。還參見Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.US491:5148-5152.87，1994。其他商業(yè)上可獲得的脂質(zhì)體包括Transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其他陽離子脂質(zhì)體可以從易于獲得的材料使用本領(lǐng)域可用的技術(shù)來制備。對(duì)于DOTAP(1,2-二(油酰基氧基)-3-(三曱基胺)丙烷)脂質(zhì)體的合成，參見，例如Szoka等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:4194-4198，1978;和WO90/11092。類似地，陰離子和中性脂質(zhì)體是容易獲得的，例如從AvantiPolarLipids(Birmingham,Ala.),或可以使用易于獲得的材料容易地制備。這些材料包括磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。這些材料也可以與DOTMA和DOTAP起始材料以適合的比例混合。使用這些材料制造脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域公知的。脂質(zhì)體可以包括多層泡嚢(MLV)、小單層泡嚢(SUV)或大單層泡嚢(LUV)。使用本領(lǐng)域已知的方法制備各種脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物。參見，例如Stmubinger等人，METHODSOFIMMUNOLOGY(1983),Vol.101，pp.512-527;Szoka等人.,Proc.Natl.Acad.Sd.USA87:3410-3414，1990;Papahadjopoulos等人，Biochim.Biophys.Acta394:483，1975;Wilson等人.，Cell17:77,1979;DeamerandBangham,Biochim.Biophys.Acta443:629，1976;Ostro等人.，Biochem.Biophys.Res.Commun.76:836，1977;Fraley等人.，Proc.Natl.AcadSci.USA76:3348，1979;EnochandStrittmatter,Proc.Natl.AcadSci.USA76:145,1979;Fraley等人.，J.Biol.Chem.255:10431，1980;SzokaandPapahadjopoulos,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:145,1979;以及Schaefer-Ridder等人.，Science215:166，1982。此外，可以包括脂蛋白與本發(fā)明的核酸一同用于向細(xì)胞遞送。這種脂蛋白的實(shí)例包括乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。也可以使用這些蛋白的突變體、片段或融合物。也可以使用天然發(fā)生的脂蛋白的修飾體，例如乙酰化的LDL。這些脂蛋白可以將核酸的遞送把向表達(dá)脂蛋白受體的細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，如果脂蛋白與核酸一同包括，在組合物不包括其他耙向配體。也可以使用Nodi核酸向特定組織的受體介導(dǎo)的靶向遞送。在例如Findeis等人.(1993)，TrendsinBiotechnol.11,202-05;Chiou等人.(1994),GeneTherapeutics:MethodsandApplicationsofDirectGeneTransfer(J.A.Wolff,ed.);Wu&Wu(1988),J.Biol.Chem.263,621-24;Wu等人.(1994)，J.Biol.Chem.269,542-46;Zenke等人.(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，3655-59;Wu等人.(1991),J.Biol.Chem.266，338-42中描述了受體介導(dǎo)的DNA遞送技術(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，棵露核酸分子被用作基因遞送載體，例如，如WO90/11092和美國專利No.5,580,859中描述的。這種基因遞送載體可以是DNA或RNA,在某些實(shí)施方式中，與滅活的腺病毒連接。Curiel等人.，Hum.Gene.Ther.3:147-154,1992。其他適合的載體包括DNA-配體(Wu等人.，J.Biol.Chem.264:16985-16987,1989)、脂質(zhì)國DNA組合物(Feigner等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:74137417,1989)、脂質(zhì)體(Wang等人，Proc.Natl.AcadSd.84:7851-7855，1987)和微注射(Williams等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.88:2726-2730，1991)。通過將核酸包被在生物可降解的乳液珠子上，可以提高棵露的核酸攝取入細(xì)胞的效力。這種方法利用了觀察結(jié)果，當(dāng)在培養(yǎng)中與細(xì)胞孵育時(shí)，乳液珠子被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)和濃縮在細(xì)胞的核周區(qū)域。當(dāng)注射到肌肉中時(shí)，然后珠子將被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。在由乳液珠子啟動(dòng)的內(nèi)吞作用之后，核酸包被的乳液珠子將被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，因而提高基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)效力。這種方法可以通過處理珠子來提高它們的疏水性，從而促進(jìn)內(nèi)涵體的破壞和核酸向細(xì)胞質(zhì)中的釋力欠來進(jìn)一步改善。編碼NODI的核酸可以按類似方式導(dǎo)入細(xì)胞中。機(jī)械方法，例如顯微注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔或磷酸4丐沉淀，可以用于將NODI核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞中，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和/或腫瘤細(xì)胞死亡。做為選擇，如果希望細(xì)胞穩(wěn)定地保持DNA構(gòu)建體，DNA構(gòu)建體可以在質(zhì)粒上提供，并作為獨(dú)立的元件維持，或整合到細(xì)胞的基因組中，這是本領(lǐng)域已知的。內(nèi)源NODI基因在細(xì)胞中的表達(dá)也可以通過同源重組與內(nèi)源NODI基因按讀碼框地導(dǎo)入DNA構(gòu)建體來改變，所述DNA構(gòu)建體包含NODI目標(biāo)序列、調(diào)節(jié)序列、外顯子和未配對(duì)的剪接供體部位，從而形成包含所述DNA構(gòu)建體的同源重組細(xì)胞。新的轉(zhuǎn)錄單位可以用于如希望的打開或關(guān)閉NODI基因。影響內(nèi)源基因表達(dá)的這種方法美國專利No.5,641,670中教導(dǎo)了。釋放的NODI核酸向細(xì)胞系或組織的基因組中的整合可以通過本領(lǐng)域已知的方法來監(jiān)視。例如，可以進(jìn)行遞送的NOD1核酸的Southern印跡。遞送的核酸的片段的大小方面的改變指示整合。遞送的核酸的復(fù)制可以特別通過檢測標(biāo)記的核苷酸的摻入、結(jié)合與NODI探針雜交來;f全測。NODI核酸的表達(dá)可以通過^r測與遞送的核酸雜交的NODImRNA的產(chǎn)生，或通過檢測NODI蛋白來監(jiān)視。NODI蛋白可以免疫檢測。RIP2調(diào)節(jié)劑根據(jù)本發(fā)明的，當(dāng)"激酶缺陷的"RIP2在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞凋亡被敏化。如在此使用的，"激酶缺陷的"RIP2是指基本上沒有激酶功能的RIP2多肽。因此，本發(fā)明提供了沒有激酶功能的RIP2多肽，RIP2激酶抑制劑以及用于表達(dá)激酶缺陷的RIP2的表達(dá)盒和表達(dá)載體。RIP2是絲氨酸/蘇氨酸激酶，其在它的羧基末端含有CARD結(jié)構(gòu)域，并且顯示了在過量表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)NF-kB活化。RIP2還顯示了在調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起到作用。Rip2缺陷的小鼠僅僅具有針對(duì)Toll樣受體激動(dòng)劑，例如脂多糖(LPS)的減弱的免疫反應(yīng)。RIP2的序列可以在例如NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得。參見網(wǎng)站ncbi.nlm.mh.gov。例如，人類RIP2的一個(gè)氨基酸序列在以下提供以便參考，為SEQIDNO:5(NCBI登記號(hào)碼AAC27722;gi:3342910)。1MNGEAICSALPT工PYHKLAD面IiSRGASGTVSSARHADW41ihtphdserkdvlreaeilHKARFSYIIjP81工lg工cnepee1lgivteympngs:lneujHrkteypdvawp;l121RFR工LHEIALGVNY函MTPP:LI)HHDIiKTGNIL副EFHV161KIADFGLSKWRMMSLS卿SSKSAPEGGTIIYMPPENYEP201gqksras而diysyavitwEVIiSRKQPFEdvtnp;lqimy241svsgghrpvinees:lpydiphrarmisuesgwaqnpder281psf:lkc;l工e;lepv;lrtfee工tfleaviq:lkktklqsvssa321ih:lcdkkkme:ls:ln:ipvnhgpqeescgssqlhensgspet361SRSLPAPQDNDETiSR,DCYFMKLHHCPGNHSWDST工SG401SQRAAFCDHKTTPCSSMINPESTAGNSERLQPG工AQQW工441QSKREDIVNQmteac,sldaklsrd;l工mkedyelvstk481P潔SKV,LDTTDIGGEEFAKVIVQKLKDNKQMGLQPY521PEIIjWSRSPSIiNKLQNKSM如上所指出的，以及在實(shí)施例中更詳細(xì)地說明的，當(dāng)RIP2的另一個(gè)結(jié)構(gòu)域和功能(例如，CARD結(jié)構(gòu)域)主要是功能性的時(shí)，表達(dá)激酶缺陷的RIP2的細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞凋亡被敏化。因此，本發(fā)明涉及通過用可以抑制RIP2激酶的試劑接觸細(xì)胞使細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡敏化的方法。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過向哺乳動(dòng)物施用治療有效量的RIP2激酶抑制劑來在動(dòng)物中治療癌癥的方法。RIP2激酶抑制劑也可以與N0D1多肽或Nodl核酸，或調(diào)節(jié)N0D1活性的試劑聯(lián)合施用。任何可用的RIP2抑制劑可以在本發(fā)明的組合物和方法中使用，在某些實(shí)施方式中，可以使用p38抑制劑來抑制RIP2激酶功能。例如，可以用于抑制RIP2的p38抑制劑包括2-(4-氯苯基)-4-(4-氟苯基)-5-嘧啶-4-基-1,2-二氫-吡唑啉酮-3、SC68376、SB203580(Iodo)、SB202190、SB203580、SB203580(砜)、PD169316、SB220025、SKF-86002、SB239063或ML3163。以下才是供了SB220025、SB203580和PD169316的結(jié)構(gòu)。這些抑制劑可以在與用丁開刷pJ6的,厭。」比牧的a在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過觀察測試試劑是否可以抑制RIP2激酶活性來鑒定RIP2抑制劑的方法。這種方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。在缺乏測試試劑的情況下進(jìn)行RIP2分析時(shí)，可以包括對(duì)照物。在存在測試試劑的情況下RIP2活性降低表明所述測試試劑是RIP2抑制劑。組合物施用N0D1多肽和NODl配體，包括它們的鹽以及N0D1核酸和/或RIP2激酶抑制劑來促進(jìn)細(xì)胞凋亡和腫瘤退化、調(diào)節(jié)NOD1活性，SB220025<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>一種癥狀。如在此描述的，可以包括其他試劑，例如，抗肺瘤劑、化學(xué)治療劑、TNF、RIP2激酶抑制劑、RIP2激酶缺陷多肽、編碼RIP2激酶缺陷多肽的核酸，等等。為了實(shí)現(xiàn)期望的效果，可以作為單獨(dú)的或分開的劑量施用N0D1多肽、配體、核酸和與其他試劑的組合。例如，N0D1多肽、配體和核酸可以以至少約0.01mg/kg到約500至750mg/kg、至少約0.01mg/kg到約300至500mg/kg、至少約0.1mg/kg到約100至300mg/kg或至少約1mg/kg到約50至100mg/kg體重的劑量施用，盡管其他劑量可以提供有益的結(jié)果。施用的數(shù)量將取決于各種因素變化，包括但不限于，選擇的多肽、配體或核酸、哺乳動(dòng)物的疾病、體重、身體狀況、健康、年齡，要實(shí)現(xiàn)預(yù)防還是治療、以及所述多肽、配體或核酸是否被化學(xué)上修飾。這些因素可以由臨床醫(yī)師采用動(dòng)物模型或本領(lǐng)域可用的其他測試系統(tǒng)容易地確定。根據(jù)本發(fā)明的治療試劑的使用可以是以單劑量、以多劑量、以連續(xù)或間歇方式，取決于，例如，接受者的身體條件、施用的目的是治療性還是預(yù)防性，以及熟練醫(yī)師已知的其他因素。本發(fā)明的多肽、配體、核酸和其他試劑的施用可以在預(yù)定的時(shí)段是基本上連續(xù)的，或可以是一系列間隔的劑量。局部和全身性施用都是預(yù)期的。為了制備組合物，合成或荻得多肽、配體、核酸和試劑，根據(jù)需要或期望來純化，然后凍干并穩(wěn)定化。然后可以調(diào)節(jié)所述多肽、配體或核酸到合適的濃度，并任選的與其他試劑組合。包括在單位劑量中的纟合定多肽、配體或核酸的絕對(duì)重量可以廣泛地變化。例如，可以施用約0.01到約2g、或約0.1到約500mg的至少一種本發(fā)明的多肽、核酸或抗體，或多種多肽、配體和核酸。做為選擇，單位劑量可以從約0.01g到約50g、從約0.01g到約35g、從約0.1g到約25g、從約0.5g到約12g、從約0.5g到約8g、約0.5g到約4g，或從約0.5g到約2g變動(dòng)。本發(fā)明的多肽、配體或核酸的日劑量也可以變化。這種日劑量可以在例如約0.1g/天到約50g/天、從約0.1g/天到約25g/天、從約0.1g/天到約12g/天、從約0.5g/天到約8g/天、從約0.5g/天到約4g/天、和從約0.5g/天到約2g/天的范圍內(nèi)。因而，包含本發(fā)明的治療性多肽、配體或核酸的一種或多種適合的單位劑型可以通過各種途徑施用，包括口服、胃腸外的(包括皮下的、靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的和腹膜內(nèi)的)、直腸、皮膚、穿表皮的、胸內(nèi)的、非營養(yǎng)膜和鼻內(nèi)的(呼吸性)途徑。在某些實(shí)施方式中，N0D1多肽、配體或核酸局部地向腫瘤或癌癥位點(diǎn)施用。治療試劑也可以配制用于持續(xù)釋放(例如，使用微嚢化作用，參見WO94/07529和美國專利No.4,962,091)。當(dāng)合適時(shí)，所述制劑可以方便地以分散的單位劑型呈現(xiàn)，可以通過藥物領(lǐng)域/>知的任何方法來制備。這些方法可以包括將治療試劑與液體載體、固體基質(zhì)、半固體載體、細(xì)分散的固體載體或其組合混合，然后，如果需要，將產(chǎn)物導(dǎo)入或成形為期望的遞送系統(tǒng)。當(dāng)本發(fā)明的治療試劑準(zhǔn)備用于口服施用時(shí)，它們一般與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合來形成藥物制劑或單位劑型。對(duì)于口服施用，所述治療試劑可以呈現(xiàn)為粉未、顆粒制劑、溶液、懸浮液、乳劑，或處于天然的或合成的聚合物或樹脂中用于從咀嚼用膠攝取活性成分。治療試劑也可以作為彈丸、舔劑或糊劑存在。口服施用的本發(fā)明的治療試劑也可以被配制用于持續(xù)釋放，例如，治療試劑可以被包被、微嚢密封，或置于持續(xù)遞送裝置中。這種制劑中的總活性成分包括制劑重量的0.001到99.9%。"藥學(xué)上可接受的"是指載體、稀釋劑、賦形劑和/或鹽與制劑的其他成分相容，并且對(duì)于其接受者無害。含有本發(fā)明的治療試劑的藥物制劑可以使用公知的和易于獲得的成分通過本領(lǐng)域已知的步驟來制備。例如，可以與常見的賦形劑、稀釋劑或載體配制治療試劑，并形成片劑、膠嚢、溶液、懸浮液、粉末、氣霧劑等等。適合于這些制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的實(shí)例包括緩沖液，以及填料和膨脹劑，例如淀粉、纖維素、糖類、甘露醇和硅衍生物。也可以包括結(jié)合試劑，例如羧曱基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基曱基纖維素和其他纖維素衍生物，藻酸鹽、明膠和聚乙烯-吡咯烷酮。可以包括增濕試劑，例如甘油，崩解劑例如碳酸輛和碳酸氫鈉。也可以包括用于延緩溶解的試劑，例如石蠟。還可以包括重吸收加速劑，例如季銨化合物。可以包括表面活性劑，例如十六醇和單石更脂酸甘油酯。可以添加吸附性載體，例如高嶺土和斑脫土。還可以包括潤滑劑，例如滑石粉、鈣和硬脂酸鎂，和固體聚乙二醇。還可以添加防腐劑。本發(fā)明的組合物還可以含有增稠劑，例如纖維素和/或纖維素衍生物。它們也可以含有樹膠，例如黃原膠、瓜耳膠或碳樹膠或阿拉伯樹膠，或作為選擇，聚乙二醇、有機(jī)皂土和蒙脫土，等等。例如，含有本發(fā)明的治療試劑的片劑或錠劑可以包括緩沖試劑，例如碳酸鈣、氧化鎂和碳酸鎂。錠劑和片劑也可以包括無活性成分，例如纖維素、預(yù)膠化淀粉、二氧化硅、羥基丙基曱基纖維素、硬脂酸鎂、微晶纖維素、淀粉、滑石粉、二氧化鈦、苯曱酸、檸檬酸、玉米淀粉、礦物油、聚丙二醇、磷酸鈉、硬脂酸鋅，等等。含有至少一種本發(fā)明的治療試劑的硬或軟膠膠嚢可以含有無活性成分，例如明膠、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉、淀粉、滑石粉和二氧化鈦等等，以及液體載體例如聚乙二醇(PEG)和植物油。此外，含有本發(fā)明的一種或多種治療試劑的腸包被的錠劑或片劑被設(shè)計(jì)以在胃中抵抗離解，并溶于十二指腸的更為中性和堿性的環(huán)境。本發(fā)明的治療試劑也可以配制為酏劑或溶液，用于方便的口力良施用，或配制為適合于腸胃外施用，例如通過肌肉內(nèi)的、皮下的、腹膜內(nèi)的或靜脈途徑施用的溶液。本發(fā)明的治療試劑的藥物制劑也可以采用含水或無水溶液或分散體的形式，或作為選擇，采用乳劑或懸浮液或油膏劑的形式。因而，治療試劑可以被配制用于腸胃外施用(例如，通過注射，例如，彈丸注射或連續(xù)輸注)并可以以安瓿^f瓦中、預(yù)填充的注射器、小體積的輸注容器或在多劑量容器中的單位劑量形式呈現(xiàn)。如上所述，可以添加防腐劑來幫助維持劑型的擱置期。活性多肽、核酸或抗體和其他成分可以形成在油或水載體中的懸浮液、溶液或乳劑，可以含有配方試劑，例如懸浮、穩(wěn)定和/或分散試劑。做為選擇，活動(dòng)多肽、核酸或抗體和其他成分可以以粉未的形成，通過無菌分離無菌的固體，或通過從溶液凍干，用于在使用前與合適的載體，例如無菌無熱原的水構(gòu)造。這些制劑可以含有本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和佐劑。例如，可能的是使用一種或多種生理學(xué)觀點(diǎn)上可接受的有機(jī)溶劑來制備溶液，除了水之外，所述有機(jī)溶劑選自溶劑，例如丙酮、乙醇、異丙醇、乙二醇醚例如以名稱"Dowanol"聚二醇和聚乙二醇銷售的產(chǎn)品，短鏈酸的C廣C4烷基酯，乙基或異丙基乳酸，脂肪酸甘油三酯例如以名稱"Miglyol"銷售的產(chǎn)品，十四烷酸異丙酯，動(dòng)物、礦物和植物油以及聚硅氧烷。如果希望，有可能添加選擇抗氧化劑、表面活性劑、其他防腐劑、成膜劑、角質(zhì)層分離劑或抗阻塞(comedolytic)試劑、芳香劑、調(diào)味劑以及著色劑。可以添加抗氧化劑，例如叔丁基對(duì)苯二酚、丁基羥基苯曱醚、丁基化羥基甲苯以及oc-生育酚和其衍生物。此外，多肽、配體和核酸很好地適合于制劑為持續(xù)釋放的劑型等。所述制劑可以這樣組成，從而它們可能在一定時(shí)期內(nèi)，例如在腸道或呼吸道的特定部分釋放治療試劑。可以從聚合物，例如聚交酯-羥乙酸鹽、脂質(zhì)體、微乳劑、微粒、納粒或蠟來制成包被、包膜和保護(hù)性基質(zhì)。這些包被、包膜和保護(hù)性基質(zhì)對(duì)于包被內(nèi)在設(shè)備，例如展幅、導(dǎo)管、腹膜透析桶、泄液裝置等等是有用的。對(duì)于表面施用，治療試劑可以按本領(lǐng)域已知的配制，用于直4妻向目標(biāo)區(qū)域應(yīng)用。主要為局部施用而調(diào)節(jié)的形式采取例如乳膏劑、奶、凝膠劑、分散體或微乳劑、增稠到更大或較低程度的洗液、浸透板、軟膏劑或棒、氣霧制劑(例如，噴霧或泡沫)、肥皂、洗滌劑、洗液或肥皂塊的形式。用于這個(gè)目的的其他常規(guī)形式包括傷口敷料、包被的繃帶或其他聚合物覆蓋物、軟膏劑、乳膏劑、洗液、糊劑、膠狀物、噴霧和氣霧劑。因而，本發(fā)明的治療試劑可以經(jīng)由用于皮膚施用的貼片或繃帶來遞送。做為選擇，多肽、配體和/或核酸可以配制成粘附性聚合物，例如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/乙烯基醋酸酯共聚物的一部分。對(duì)于長期應(yīng)用，可能期望的是使用微孔的和/或可吸入的襯墊疊層，從而皮膚的水化或浸漬可以被最小化。襯墊層可以是將提供期望的保護(hù)和支持功能的任何適合的厚度。適合的厚度一般是從約10到約200微米。例如，軟膏劑和乳膏劑可以與水性或油性基質(zhì)配制，添加適合的增稠劑和/或膠凝劑。洗液可以與水性或油性基質(zhì)配制，一般也將含有一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。治療試劑也可以經(jīng)由離子電滲來遞送，例如，如美國專利NO.4,140,122;4,383,529;或4,051,842中公開的。在表面制劑中存在的本發(fā)明的治療試劑的重量百分?jǐn)?shù)將取決于各種因素，一般是制劑總重量的0.001%到95%,一般是按重量的0.01-85%。滴劑，例如滴眼劑或滴鼻劑，可以在含水或無水基質(zhì)中用一種或多種治療試劑來配制，還含有一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。方便地從密封的包裝遞送液體噴霧。滴劑可以經(jīng)由有蓋的簡單眼滴瓶、或經(jīng)由適合于滴狀遞送液體內(nèi)容物的塑料瓶、經(jīng)由特定形狀的閉合物來遞送。治療試劑可以進(jìn)一步配制用于在口腔或咽喉中表面施用。例如，活性成分可以配制為進(jìn)一步包含調(diào)味的基質(zhì)、通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠的錠劑；在惰性基質(zhì)例如明膠和甘油、或者蔗糖和阿拉伯樹膠中包含組合物的錠劑；以及在適合的液體載體中包含本發(fā)明的組合物的p軟口7K。本發(fā)明的藥物制劑可以包括，作為任選的成分，藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、增溶劑或乳化劑、以及在本領(lǐng)域中可用的鹽類型。這些物質(zhì)的實(shí)例包括生理鹽水溶液，例如生理學(xué)緩沖的鹽水溶液和水。括水和生理^可接受的緩沖鹽水溶液,例:口pH7.0-8.0的磷酸2緩沖鹽水溶液。本發(fā)明的治療試劑也可以向呼吸道施用。因而，本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的方法中的氣霧劑藥物制劑和劑型。一般地，這些劑型包含有效治療或預(yù)防特定癌癥、胂瘤、癥候或相關(guān)疾病的臨床癥狀的數(shù)量的、至少一種本發(fā)明的試劑。按照本發(fā)明的方法治療的癌癥的一種或多種癥狀的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的減弱被認(rèn)為是本發(fā)明的范圍內(nèi)的這種癌癥的治療。做為選擇，對(duì)于通過吸入或吹入的施用，組合物可以采取干粉的形式，例如治療試劑與適合的粉末基質(zhì)例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉未組合物可以以單位劑型存在于，例如膠嚢或盒，或例如明膠或泡罩包裝中，從中粉末可以借助吸入器、吹入器或計(jì)量的吸入器來施用(參見,例長口,在Newman,S.P.inAerosolsandtheLung,Clarke,S.W.andDavia，D.eds.,pp.197-224，Butterworths,London,England,1984中公開的密封的計(jì)量吸入器(MDI)和干粉吸入器)。當(dāng)以氣霧劑或吸入的形式施用時(shí)，本發(fā)明的治療試劑還可以在水溶液中施用。因而，其他氣霧劑藥物制劑可以包含，例如，生理學(xué)可接受的緩沖鹽水溶液，含有約0.1mg/ml和約100mg/ml之間的、特異于要治療的癥候或疾病的一種或多種本發(fā)明的治療試劑。不溶或懸浮在液體中的細(xì)分散的固體多肽、配體或核酸顆粒形式的干燥氣溶膠，在本發(fā)明的實(shí)踐中也是有用的。本發(fā)明的多肽、配體或核酸可以配制為樸粉，并包含具有約1和5jum之間，作為選擇2和3ium之間的平均粒子大小的細(xì)散顆粒。細(xì)散顆粒可以通過使用本領(lǐng)域的已知技術(shù)的粉碎和篩濾來制備。所述顆粒可以通過吸入預(yù)定量的細(xì)分散的材料來施用，所述材料可以是粉末的形式。要理解的是，在每種劑型的單個(gè)氣霧劑劑量中含有的活性成分的單位含量，本身不必構(gòu)成用于治療特定感染、癥候或疾病的有效量，因?yàn)楸匦璧膭┝靠梢酝ㄟ^施用多個(gè)劑量單位來達(dá)到。此外，單獨(dú)地、或在一系列施用中使用低于劑型中的劑量，可以達(dá)到有效量。對(duì)于通過吸入向上呼吸道(鼻子)或下呼吸道施用，本發(fā)明的治療試劑方便地從噴霧器、或密封的包裝、或遞送氣溶膠噴射的其他方便的裝置來釋放。密封的包裝可以包括適合的推進(jìn)劑，例如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他適合的氣體。對(duì)于加壓的氣霧劑來說，劑量單位可以通過提供閥門來遞送計(jì)量的數(shù)量來確定。噴霧器包括但不限于在美國專利NO.4,624,251;3,703,173;3,561,444和4,635,627中描述的那些。在此公開的氣霧劑遞送系統(tǒng)類型可以從許多商業(yè)的來源獲得，包括FisonsCorporation(Bedford,Mass.)、ScheringCorp.(Kenilworth,NJ)和AmericanPharmosealCo.(Valencia,CA)。對(duì)于鼻內(nèi)施用，治療試劑也可以經(jīng)由滴鼻劑、液體噴霧來施用，例如經(jīng)由塑料瓶噴霧器或計(jì)量吸入器。典型的噴霧器是Mistometer(Wintrop)禾口Medihaler(Riker)。此外，活性成分也可以與其他治療試劑組合使用，例如，止痛藥、抗炎癥試劑、抗組胺劑、抗微生物劑、支氣管擴(kuò)張劑等等，無論用于描述的條件還是某些其他條件。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于調(diào)節(jié)Nodi表達(dá)的包裝的藥物組合物，例如試劑盒或其他容器。所述試劑盒或容器容納了用于調(diào)節(jié)Nodi基因表達(dá)的治療有效量的藥物組合物，和用于使用所述藥物組合物來調(diào)節(jié)Nodi基因表達(dá)的說明書。所述藥物組合物包括至少一種本發(fā)明的Nodi核酸，為治療有效量從而Nodi基因表達(dá)被調(diào)節(jié)。所述組合物也可以含有抗腫瘤劑或化學(xué)治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)NODI活性的包裝的藥物組合物。所述試劑盒或容器容納了用于調(diào)節(jié)NODI活性的治療有效量的藥物組合物，和用于使用所述藥物組合物來調(diào)節(jié)NODI活性的說明書。所述藥物組合物包括至少一種本發(fā)明的NOD1多肽或NOD1配體，為治療有效量從而NODI活性被調(diào)節(jié)。將參考以下詳細(xì)的實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，所述實(shí)施例為了例示本發(fā)明而給出，而不意圖受限于此。實(shí)施例l:NODl誘導(dǎo)引起肺瘤退化該實(shí)施例說明了，Nodi使細(xì)胞對(duì)TNFoc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感化，并且在缺少任何其他已知的細(xì)胞凋亡觸發(fā)的情況下，NODI特異性配體誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。采用體內(nèi)動(dòng)物模型來證明NODI在腫瘤退化中的作用，其涉及用SCID小鼠進(jìn)行異種移植。這些數(shù)據(jù)表明，Nodi在控制肺瘤細(xì)胞生長中起到關(guān)鍵作用。材料和方法勿應(yīng)潛養(yǎng)人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和SKBR3維持在補(bǔ)充有10%胎兒牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和10mg/ml鏈霉素的、Dulbecco的修改的Eagle's培養(yǎng)基中。嘑#乙動(dòng)參43游建#和定^謬史.人類FLAG-Nodl、FLAG-Nod2cDNAs獲自DrGabrielNuez,并在Y.Ogura等人，J.Biol.Chem.276，4812(2001)中描述了。人類Myc-RIP2wt和Myc畫RIP2(K47A)是來自Dr.C.Vincenz(UniversityofMichiganMedicalSchool)的惠贈(zèng)。通過定點(diǎn)誘變構(gòu)建Nodl突變體(V41Q和K208R)。通過刪除羧基末端CARD結(jié)構(gòu)域并克隆到pcDNA4/Myc/His質(zhì)粒(Invitrogen，Carlsbad,CA)中來產(chǎn)生Myc-RIP2ACARD。核苷酸序列全部通過DNA測序來確認(rèn)。逆脊z夷4^脊^.這項(xiàng)研究中使用的各種基因克隆到pMSCV-Blasto、pBabe-Puro或pBabe-Neo逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。使用可獲得的步驟穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。簡要地，用編碼選定的Nodl、Nodi和其他蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染兼嗜性293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在32。C將細(xì)胞孵育過夜來產(chǎn)生病毒顆粒。第二天用含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的含病毒293細(xì)胞上清液感染目標(biāo)細(xì)胞。用10pg/ml稻瘟散-S(CalbiochemEMDBiosciencesInc.,SanDiego，CA)、500jag/ml慶大霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)或5)tig/ml噤呤霉素(Calbiochem)來選擇細(xì)胞。通過Western印跡分析確認(rèn)所有構(gòu)建體的表達(dá)。為了確定17|3-雌二醇(Calbiochem)的效果，在補(bǔ)充有5%活性炭脫去的FCS的無酚紅DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞播種到具有各種濃度的17|3-雌二醇(E2)的96孔平板中24h,并用31"1-胸腺嘧啶(1iuCi/孔，MPBiomedicals,Irvine，CA)脈沖。在玻璃纖維過濾器上收獲細(xì)胞，通過液體閃爍來測量放射性。,eW^7伊逐^^f弄i瘦沉淀.廣泛地洗滌細(xì)胞，并使用含有50mMHepes、100mMNaCl、2mMEDTA、10%甘油、1%NonidetP-40、14juM抑胃肽A、100yM亮抑酶肽、3mM苯曱脒、1mMPMSF、1mM焦石岸酸鈉、10mM原釩酸鈉、100U/ml抑蛋白酶肽和100mM氟化鈉的裂解緩沖液裂解。在水上孵育30分鐘之后，細(xì)胞溶胞產(chǎn)物進(jìn)行離心(14000rpm,10分鐘，4°C)，回收上清液。為了免疫沉淀，細(xì)胞溶胞產(chǎn)物與5pg抗體在恒定攪動(dòng)下在4。C混合3小時(shí)。容許免疫復(fù)合物結(jié)合20jal蛋白A-Sepharose珠子過夜，用裂解緩沖液洗滌珠子三次。在SDS-PAGE上分離免疫沉淀物，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。勿應(yīng)^存力》浙.碘化丙鍵撐A為Vf.'如所指出的刺激細(xì)胞2天。隨后，收獲細(xì)胞，在FACS緩沖液(含有1。/。FCS和0.1。/oNaN3的PBS)中洗滌兩次，重懸浮在含有硤化丙錠(PI)的FACS緩沖液(4pg/ml)中。使用FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)(BectonDickinson,MountainView,CA)分析細(xì)胞死亡的程度。DJ尸/染逸,MCF-7細(xì)胞置于室載玻片中，刺激2天。用PBS洗滌細(xì)胞，細(xì)胞凋亡的核用1mg/mlDAPI(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)染色。在4%多聚曱醛中固定細(xì)胞，通過熒光顯微術(shù)檢查。T/A^丄用Y丁riDAP處理細(xì)胞，根據(jù)廠家的說明書(ROCHE，Indianapolis,IN)通過TUNEL(TdT介導(dǎo)的UTP斷口-末端標(biāo)記)分析來監(jiān)視細(xì)胞凋亡的核。/丄-S￡丄/&4.轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中IL-8的濃度使用96孑L免疫平才反(DynatechLaboratories,Chantilly，VA)通過ELISA來測量。使用用于捕獲的mAbMAB208和生物素化的多克隆兔抗人IL-8Ab(R&DSystems,Minneapolis,MN)，隨后是用于4企測的鏈霉抗生物素蛋白HRP，來進(jìn)行ELISA。嫌篇哞W乂類7f神移潛.將MCF誦7Blasto、MCF陽7C20和MCF畫7C20/Nodl細(xì)胞胰蛋白酶化，用PBS洗滌一次，重懸浮到1.5xl07/ml的濃度。將200微升的每種懸浮液皮下地接種到無胸腺SCID/SCID或SCID/Nod(非肥胖性糖尿病性)雌性小鼠的肋部。每周評(píng)定肺瘤大小。計(jì)算肺瘤體積。結(jié)果Mc//^7WF"和A^//^傳謬爭的勿y敏源亡哞^^V斧^。乳腺癌上皮細(xì)胞系MCF-7已經(jīng)廣泛地用于研究由生物學(xué)信號(hào)例如TNFoc或由細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。MCF-7細(xì)胞系也被用作模型來研究雌激素陽性乳腺癌(Simstein等人，Exp.Biol.Med.228:995-1003(2003))。MCF-7細(xì)胞起初在采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的誘變的遺傳篩選中使用，來鑒定TNFcc誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡所需的基因。在MCF-7細(xì)胞暴露于逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體之后，選擇TNFoc抗性的克隆，然后在TNFoc抗性克隆中鑒定突變基因。抗性克隆之一含有破壞的Nodl基因；這個(gè)TNFcc抗性克隆的細(xì)胞系被稱為MCF7-C20。來自逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的pDisrup插入被定位到Nodl基因的3'部分，在富亮氨酸區(qū)域9和10的區(qū)域內(nèi)(LRR9-10;參見附圖1A)。這個(gè)插入位于Nodl編碼區(qū)域中的blasticidine開放閱讀框中。blasticidine-Nodl融合mRNA的示意圖在附圖1A中示意地顯示。進(jìn)行使用抗人Nodl單克隆抗體的Western印跡分析來測試NODI蛋白是否在MCF7-C20細(xì)胞中表達(dá)。在親本MCF-7細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(標(biāo)記為"wt")中檢測到內(nèi)源的NOD1蛋白，但是MCF-7C20細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的Western印跡未能揭示Nodl的可檢測表達(dá)，表明在MCF-7C20中功能性的Nodl等位基因被破壞(附圖1B)。MCF-7C20細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2006年2月23日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏所(10801UniversityBlvd.,Manassas，Va.，20110-2209USA(ATCC)),ATCC登記號(hào)No.ATCCNumber。Nodl功能的損失在細(xì)胞凋亡中具有顯著的影響。特別地，與表達(dá)Nodl的親本MCF-7細(xì)胞相比，MCF-7C20細(xì)胞(沒有Nodi表達(dá))對(duì)于TNFoc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著更有抗性(附圖1C)。這些數(shù)據(jù)表明，Nodl是MCF-7細(xì)胞內(nèi)TNFoc途徑中的敏化劑，Nodl促進(jìn)了MCF-7乳腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步研究Nodl在細(xì)胞凋亡中的作用，各種細(xì)胞類型與特異性活化Nodl的Nodl配體D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(yTriDAP)孵育。測試的細(xì)胞類型包括親本MCF-7細(xì)胞系、Nodl缺陷的MCF-7C20克隆、和工程化以含有其他人類Nodl等位基因從而Nodl被過量表達(dá)的細(xì)胞系(MCF-7Nodl)。為了確定C20細(xì)胞對(duì)/TriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抗性是否由缺少Nodl引起，在MCF-7C20細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)人類Nodl來產(chǎn)生Nodl充足的C20細(xì)胞(C20/Nodl)。作為另一個(gè)對(duì)照，用空的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染親本MCF-7細(xì)胞系來產(chǎn)生MCF-7Blasto細(xì)胞。在存在或缺少放線菌酮(CHX)的情況下用Y丁riDAP處理細(xì)胞，然后通過硤化丙染色和流式細(xì)胞計(jì)來測定細(xì)胞死亡。在存在放線菌酮的情況下，野生型MCF-7細(xì)胞對(duì)fTriDAP的暴露誘導(dǎo)了約25%的細(xì)胞死亡(附圖2A，左上畫面，陰影柱)。在用單獨(dú)的放線菌酮(空心柱)或單獨(dú)的/TriDAP處理的野生型細(xì)胞中，沒有觀察到細(xì)胞死亡。相比之下，MCF-7C20(沒有Nodl表達(dá))細(xì)胞對(duì)丫TriDAP加放線菌酮的影響有完全的抗性，在這些細(xì)胞中基本上沒有觀察到細(xì)胞凋亡提高(附圖2A，右上畫面)。Nodl向MCF-7C20細(xì)胞中的重新導(dǎo)入修復(fù)了這些細(xì)胞對(duì)丫TriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的完全每文感性(附圖2A，右下畫面)。放線菌酮和YTriDAP的組合在穩(wěn)定過量表達(dá)Nodl的MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)了擴(kuò)大的細(xì)胞死亡，48h處理后這些MCF-7Nodl細(xì)胞中細(xì)胞死亡幾乎達(dá)到60%(附圖2A,右下畫面)。Nodl配體丫TriDAP是細(xì)胞凋亡的最佳的誘導(dǎo)所需的。當(dāng)存在放線菌酮的情況下與MCF-7細(xì)胞孵育時(shí)，稱為cxTriDAP的無活性對(duì)照三肽不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(附圖2A中的ocTri),ocTriDAP中mesoDAP結(jié)合與a位置中的Glu,而不是如/TriDAP中的y位置。作為對(duì)照，使用培養(yǎng)基("Med")代替yTriDAP或ocTriDAP。添加培養(yǎng)基對(duì)于細(xì)胞凋亡基本上沒有效果。在MCF-7Blasto和MCF-7Nodl細(xì)胞中內(nèi)源Nodl的表達(dá)、Nodl的過量表達(dá)通過免疫沉淀和Western印跡分析來確認(rèn)(附圖2B)。在MCF-7C20細(xì)胞中沒有看到這種表達(dá)(附圖2B)。這些數(shù)據(jù)顯示了，在存在yTriDAP的情況下Nodl使得MCF-7乳腺癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡敏感化。反而，添加yTriDAP和放線菌酮是觀察到細(xì)胞凋亡之前必需的。前細(xì)胞凋亡試劑例如放線菌酮是觀察到細(xì)胞凋亡之前經(jīng)常需要的。然而，使用MCF-7細(xì)胞注意到的對(duì)/TriDAP或TNFoc的敏感性的改變，使用其他的細(xì)胞凋亡刺激，包括doxirubicin和喜樹堿沒有發(fā)現(xiàn)，其中親本和C20細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞死亡是相等地敏感的(數(shù)據(jù)未顯示)。用Y丁riDAP處理的MCF-7細(xì)胞的亮顯微鏡觀察揭示了細(xì)胞凋亡和非壞死的形態(tài)變化特征(附圖2C，畫面a-b)。然而，為了確認(rèn)/TriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡實(shí)際上是細(xì)胞凋亡，進(jìn)行DAPI和TUNEL染色。如附圖2C所示，在用yTriDAP處理之后MCF-7細(xì)胞核含有濃縮的染色質(zhì)，如DAPI染色所示(畫面c-d),通過TUNEL染色觀察到核碎裂(畫面e-f)。在未處理的細(xì)胞中沒有檢測到核染色。進(jìn)一步確認(rèn)了，使用兩種廣譜的caspase抑制劑，z-VAD-FMK和Boc-D-FMK,獲得了/TriDAPi秀導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。z-VAD-FMK和Boc畫D-FMK都取消/TriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(附圖2D)。最后，向MCF-7細(xì)胞添加丫TriDAP,而不是無效的對(duì)照三肽ocTriDAP,引起了聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和capases6、7、8和9的蛋白水解裂解(附圖3，9B)。MCF-7細(xì)胞已知缺乏caspase3，在親本MCF-7細(xì)胞或MCF-7C20細(xì)胞中caspase3的表達(dá)沒有改變對(duì)丫TriDAP的反應(yīng)模式(數(shù)據(jù)未顯示)。因而，多個(gè)細(xì)胞系的增加表明，在MCF-7細(xì)胞中存在由Nodl的同源配體Y丁riDAP誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞凋亡途徑，這種途徑需要Nodl蛋白的存在。為了進(jìn)一步確定MCF-7C20細(xì)胞對(duì)/TriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抗性來自Nodl的缺乏，人類Nodl在MCF-7C20細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，來產(chǎn)生表達(dá)Nodl的MCF-7C20細(xì)胞(MCF-7C20/Nodl)。Nodl向這些Nodl缺陷細(xì)胞中的重導(dǎo)入修復(fù)了這些細(xì)胞對(duì)丫TriDAP的完全敏感性(附圖2A),并引起caspase和PARP裂解(附圖3)。為了確定在其他人類細(xì)胞系中是否存在Nodl依賴性細(xì)胞凋亡，檢查了一系列上皮細(xì)胞系，其中Nodl被穩(wěn)定表達(dá)以增強(qiáng)對(duì)于Nodl途徑活化的敏感性。在存在或缺少CHX(C)的情況下用TNFoc(T)和yTriDAP(y)處理細(xì)胞，通過PI染色作為細(xì)胞凋亡的度量來監(jiān)視生存力(表l)。表l:在TNFcc和yTriDAP處理之后的細(xì)胞生存力<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>在測試的細(xì)胞系中，SK-BR3和A431細(xì)胞都揭示了Nodl依賴性細(xì)胞凋亡途徑。然而，與MCF-7系相比，這些細(xì)胞僅當(dāng)yTriDAP與TNFoc和CHX同時(shí)添加時(shí)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。CaCo2和HT29響應(yīng)于TNFoc和CHX經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，但當(dāng)同時(shí)通過/TriDAP活化Nodl途徑時(shí)沒有觀察到協(xié)同效應(yīng)。其他系例如293細(xì)胞對(duì)/TriDAPi秀導(dǎo)的細(xì)胞死亡有抗性，即使在添加TNFoc和CHX時(shí)。Nodl依賴性細(xì)胞凋亡的缺乏不是丫TriDAP不能活化NOD1的結(jié)果，因?yàn)楸磉_(dá)Nodl的293細(xì)胞不響應(yīng)于Nodl配體釋放IL-8。盡管存在No蛋白，HT29和CaCo2細(xì)胞在細(xì)胞凋亡和IL-8釋放分析中對(duì)Y丁riDAP很少起反應(yīng)，表明缺少一種或多種正調(diào)節(jié)劑，或存在強(qiáng)的負(fù)調(diào)節(jié)途徑。盡管涉及復(fù)雜的相互作用，在一些上皮細(xì)胞系，包括SK-BR3和A431細(xì)胞系中，Nodl依賴性細(xì)胞凋亡是可證明的。NOD1在SKBR3人類乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)，如上所指出，也調(diào)節(jié)那些癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。與過量表達(dá)Nodl的SKBR3相比，SKBR3野生型細(xì)胞展現(xiàn)了作為TNFoc或fTriDAP濃度的函數(shù)的較少的細(xì)胞凋亡(附圖9A)。此外，細(xì)胞凋亡的SKBR3細(xì)胞的百分比取決于培養(yǎng)條件而改變(附圖9B)。如附圖9B所示，當(dāng)細(xì)胞本領(lǐng)域/TriDAP(YTri)力口TNFoc(TNF)和i文線菌酮(CHX)時(shí)，SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡是最高的。無活性/TriDAP類似物ocTriDAP(ocTri)的替代引起降低的細(xì)胞凋亡。已經(jīng)暴露于這些試劑的SKBR3細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物的western分析顯示了，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和capases3、7和8經(jīng)歷了蛋白水解裂解。附圖9C圖形地說明了在存在不同試劑的情況下培養(yǎng)SKBR3細(xì)胞之后觀察到的野生型、表達(dá)N0D1的、和表達(dá)CLARP的SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡百分比。如所指示的，當(dāng)存在放線菌酮(CHX或C)、TNFoc(TNF或T)勿TriDAP(yTri)時(shí)(即，"gTC，，組合)，SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡是最高的。然而，在各種培養(yǎng)條件下，CLARP表達(dá)不提高細(xì)胞凋亡。人類Nodl的早先的結(jié)構(gòu)-功能研究表明，P-環(huán)殘基(K208)是短暫地過量表達(dá)的Nodl蛋白在293細(xì)胞中活化NF-kB所需的。其他研究表明，K208的突變阻斷了由核苷酸結(jié)合/寡聚反應(yīng)(NBD/NOD)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的寡聚反應(yīng)所需的構(gòu)象變化。在Nodl的CARD結(jié)構(gòu)域中的突變V41Q也顯示了石皮壞caspase9對(duì)Nodl的結(jié)合，在293細(xì)胞的短暫轉(zhuǎn)染研究期間產(chǎn)生了Nodl依賴性細(xì)胞凋亡的抑制。進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來確定那個(gè)NOD1結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞凋亡所需的。如附圖4A所示，K208R突變體取消了丫TriDAP加放線菌酮的效果，而V41Q突變體具有很少的或沒有顯著效果。這些突變的Nodl多肽被有效地表達(dá)，如通過附圖4B中描繪的Western印跡所顯示的。因而，這些多肽的不同效果不是由于表達(dá)水平中的差異。反而，這些數(shù)據(jù)表明了，介導(dǎo)寡聚反應(yīng)所需的構(gòu)象變化的核苦酸-結(jié)合/寡聚反應(yīng)(NBD/NOD)結(jié)構(gòu)域，是Nodl細(xì)胞凋亡所需的。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，雖然在MCF-7C20細(xì)胞中/TriDAP誘導(dǎo)的IL-8產(chǎn)生被抑制(數(shù)據(jù)未顯示)，當(dāng)野生型Nodl在MCF7-C20Nodl細(xì)胞中表達(dá)時(shí)(附圖5C),或當(dāng)V41QNodl突變體在MCF-7C20(即，MCF-7C20V41Q)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)，這種IL-8產(chǎn)生被恢復(fù)。然而，K208RNodl突變多肽在MCF-7C20(即，MCF-7C20K208R)細(xì)胞中的表達(dá)不修復(fù)yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。MJ2話化^MCF-7勿應(yīng)哞不資爭勿一敏^亡還進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來確定Nod2通過其特異性活化劑胞壁酰二肽(MDP)的活化是否將在親本MCF-7細(xì)胞中或在過量表達(dá)Nod2的MCF-7細(xì)胞(MCF-7Nod2)中啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。因而，將yTriDAP或MDP添加到這些細(xì)胞系的每一種，測量細(xì)胞凋亡(附圖5A)和IL-8產(chǎn)生(附圖5C)。用MDP力oCHX處理的MCF-7Nod2細(xì)胞不經(jīng)歷才是高的細(xì)胞凋亡。相比之下，正如所料，yTriDAP添加產(chǎn)生了細(xì)胞死亡。MDP處理確實(shí)在MCF-7Nod2細(xì)胞中引起IL-8分泌(附圖5C)。Nodl和Nod2在MCF-7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中的表達(dá)通過免疫印跡來確認(rèn)(附圖2B)。MCF-7C20細(xì)胞與Nod2的互補(bǔ)在添加MDP或yTriDAP之后不引起細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。/步及油c//勿f源亡的c，,現(xiàn)在要理解的是，細(xì)胞凋亡在由特異性caspase啟動(dòng)的獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)途徑的活化之后發(fā)生。為了獲得關(guān)于Nodl依賴性途徑中的起始caspase的信息，使用具有針對(duì)caspase的可變特異性的藥理學(xué)和生物學(xué)抑制劑。廣譜的抑制劑z-VAD幾乎完全地阻斷YTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(附圖6A)。相比之下，caspasel、2、6和7的特異性抑制劑僅對(duì)細(xì)胞凋亡具有很少的影響(附圖6A)。然而，caspase9抑制劑LEHD和caspase8抑制劑IETD具有顯著的抑制效果，抑制作用水平類似于z-VAD所見的(附圖6A)。這些數(shù)據(jù)表明，caspase8和9在丫TriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡啟動(dòng)方面可能的作用。已經(jīng)描述了兩種主要的細(xì)胞凋亡途徑，內(nèi)在(線粒體、壓力誘導(dǎo)的)和外在(受體介導(dǎo)的)途徑。參與細(xì)胞凋亡的caspase似乎被編組成分級(jí)的級(jí)聯(lián)，caspase9和caspase8分別是內(nèi)在和外在途徑中的上游起始物。為了區(qū)分這些途徑，使用幾種蛋白抑制劑，其通過轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞。首先，測試了CLARP(Flip)轉(zhuǎn)染子。CLARP被認(rèn)為是caspase8的特異性抑制劑，具有兩個(gè)死亡效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域(DED)并具有無活性的caspase結(jié)構(gòu)域。CLARP已知與caspase8和FADD相互作用，從而特異性地抑制由各種配體-受體對(duì)，包括Fas、TNFoc和TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為了確定CLARP對(duì)yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響，建立MCF-7細(xì)胞系，其單獨(dú)地或在存在Nodl的情況下穩(wěn)定表達(dá)CLARP(MCF-7CLARP)。當(dāng)用yTriDAP/CHX孵育MCF-7CLARP細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞死亡被完全抑制，表明Nodl誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑與由caspase8啟動(dòng)的途徑重疊(附圖6C，上部畫面)。另一種抗細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)Bcl-2已經(jīng)顯示了組織細(xì)胞色素C從線粒體釋放，從而阻斷Apaf1/caspase9復(fù)合物的活化。產(chǎn)生過量表達(dá)Bcl-2的穩(wěn)定的MCF-7細(xì)胞系，在這種表達(dá)Bcl-2的MCF-7細(xì)胞中評(píng)估Nodl活化時(shí)的細(xì)胞死亡。如附圖6C(底部畫面)所示，Bcl-2的過量表達(dá)僅部分地阻止丫TnDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。已知MCF-7細(xì)胞缺乏CaspaseIII。發(fā)明人的進(jìn)一步研究確定了，CaspaseIII在親本MCF-7或MCF-7C20細(xì)胞中的表達(dá)不改變這些細(xì)胞對(duì)Nodl配體丫TriDAP的反應(yīng)模式(數(shù)據(jù)未顯示)。這些實(shí)驗(yàn)表明，Caspase8在MCF-7細(xì)胞中啟動(dòng)yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起到重要作用。另外的支持，雖然是間接的，來自這樣的發(fā)現(xiàn)，未能影響caspase9的Nodl的V41Q突變，在支持yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(附圖4A)和IL-8產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)方面與野生型Nodl等價(jià)。C4AD潛*詢'而#邀齊;^/:^€vVoW謬^的勿應(yīng)源亡摩;T的。RIP2是含有CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶。已經(jīng)證明了RIP2在Nodl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中是重要的，其引起NF-kB活化(Kobayashi等人.Nature416:194-99(2002);Chin等人.Nature416:190-94(2002))。RIP2經(jīng)由CARD-CARD相互作用與Nodl的結(jié)合被認(rèn)為對(duì)于NF-kB活化是必需的，因?yàn)槿鄙貱ARD結(jié)構(gòu)域的RIP2作為Nodl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的顯性陰性抑制劑起作用。在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)幾種RIP2突變體來評(píng)估RIP2激酶活性在Y丁riDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。缺少CARD結(jié)構(gòu)域的RIP2的表達(dá)完全取消了Nodl誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(附圖7A)。相比之下，相對(duì)于在表達(dá)正常水平Nodl的親本MCF-7Blasto細(xì)胞中所見的細(xì)胞凋亡水平，野生型RIP2或無催化活性的RIP2(RIP2KD)的表達(dá)提高了細(xì)胞凋亡的程度(附圖7A，13A)。相比僅表達(dá)Nodl的細(xì)胞(附圖13C)或親本MCF-7Blasto細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)，表達(dá)野生型RIP2和RIP2KD構(gòu)建體的細(xì)胞對(duì)于更低濃度的/TriDAP是敏感的，并且更快死亡。此外，MDP在表達(dá)RIP2KD的細(xì)胞中誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞凋亡是有效的，但在表達(dá)野生型RIP2或RIP2ACARD的細(xì)胞中不是(附圖13A)。與表達(dá)Nodl的細(xì)胞相比，在RIP2KD細(xì)胞中MDP還誘導(dǎo)了更高水平的細(xì)胞凋亡(附圖13C)。然而，在表達(dá)野生型RIP2、RIP2KD和RIP2ACARD的細(xì)胞中，TNFa誘導(dǎo)了類似水平的細(xì)胞凋亡(附圖13B)。在表達(dá)野生型RIP2的細(xì)胞中/TriDAP誘導(dǎo)的IL-8分泌是最高的(附圖13D)。所研究的每種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表達(dá)近似相同數(shù)量的或突變RIP2(附圖7B)，表明表達(dá)水平不是細(xì)胞死亡方面的差異的原因。因而，Nodl依賴性細(xì)胞凋亡途徑需要RIP2CARD結(jié)構(gòu)域，但令人驚訝的是，不需要RIP2激酶活性。還檢查了RIP2表達(dá)對(duì)fTriDAP誘導(dǎo)的JNK磷酸化的影響(附圖7C)。在存在放線菌酮的情況下，表達(dá)野生型RIP2或RIP2KD的MCF-7細(xì)胞對(duì)yTriDAP的暴露2h誘導(dǎo)JNK的磷酸化(附圖7C)。然而，丫TriDAP和方文線菌酮對(duì)RIP2ACARD細(xì)胞沒有這種影響。因而Nodl需要RIP2(支架蛋白激酶)用于調(diào)節(jié)雌激素敏感性腫瘤生長。然而，雖然雌激素敏感性肺瘤生長的Nodl-RIP2調(diào)節(jié)需要RIP2CARD結(jié)構(gòu)域，它不需要RIP2激酶活性來為Nodl依賴性細(xì)胞凋亡和月中瘤生長的抑制提供合適的下游信號(hào)。用p38獲得了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。在RIP2ACARD細(xì)胞中MAPK活化的缺乏不是由于改變的MAPK激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因?yàn)樵谒修D(zhuǎn)染子中IL-1強(qiáng)烈誘導(dǎo)JNK磷酸化。因而，yTriDAP在MCF-7細(xì)胞中的活性需要RIP2而不是它的激酶活性。這些數(shù)據(jù)表明了，Nodl下游的蛋白激酶RIP2/RICK,可能是Nodl前細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵成分，因?yàn)镽IP2的顯性陰性形式的表達(dá)消除了yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Mt//在卞#多4。Nodl依賴性細(xì)胞凋亡途徑在許多生物進(jìn)程中可能是重要的，包括腫瘤細(xì)胞生長調(diào)節(jié)和惡性細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞死亡的衰減，引起肺瘤發(fā)生。在SCID小鼠中的腫瘤生長異種移植模型被用于檢查Nod在胂瘤生長和腫瘤排斥中起到的作用。MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20Nodl細(xì)胞的群體(各自總計(jì)約3乂106個(gè)細(xì)胞)，單獨(dú)地皮下注射到雌性小鼠的肋部來在SCID/SCID或SCID/Nodl小鼠中誘導(dǎo)腫瘤生長。在注射后一周直到8周，每周記錄動(dòng)物的腫瘤形成。在注射后前幾個(gè)星期，所有三種細(xì)胞群體相等地生長紳瘤，因而到注射后15天，在所有小鼠中存在近似計(jì)算出的腫瘤體積10mm3。因而，在導(dǎo)入小鼠后約15天，MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20Nodl細(xì)胞都可以產(chǎn)生腫瘤。然而，從MCF-7Blasto和MCF-7C20Nodl細(xì)胞形成的腫瘤在剩余的8周實(shí)驗(yàn)中幾乎消失。由MCF-7Blasto和MCF-7C20Nodl細(xì)胞產(chǎn)生的初始胂瘤很快地大小降低，并且退化(附圖10)。僅MCF-7C20細(xì)胞的注射在注射位點(diǎn)產(chǎn)生了大的圓形腫瘤，其不退化并持續(xù)生長。這些結(jié)果表明，Nodl的缺乏容許腫瘤生長，而Nodl的存在引起胂瘤退化。因?yàn)檫@些研究是在SCID小鼠中進(jìn)行的，在異種移植的腫瘤生長中免疫系統(tǒng)的作用可以忽略。此外，在4妄受MCF-7Blasto和MCF-7C20Nodl細(xì)胞的動(dòng)物中胂瘤的缺乏不是由于降低的增殖潛力，因?yàn)樵诖搜芯康拿糠NMCF-7系，包括表達(dá)MCF-7Blasto、MCF-7Nodl、MCF-7C20和MCF-7C20Nodl的細(xì)胞系，在組織培養(yǎng)條件下和在軟瓊脂菌落形成分析中具有相同的生長特性(數(shù)據(jù)未顯示)。三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的概述在表2中顯示，其中在實(shí)驗(yàn)1和2中使用SCID/SCID小時(shí)，在實(shí)驗(yàn)3中使用SCID/Nod小鼠。表2:MCF-7細(xì)胞系誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生率<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>這些結(jié)果表明，Nodl功能的喪失(當(dāng)使用MCF-7C20細(xì)胞時(shí))提高了腫瘤不退化的可能性。Nodl功能的替換(當(dāng)使用MCF-7C20Nodl細(xì)胞時(shí))，或Nodl表達(dá)的誘導(dǎo)，提高了腫瘤退化的可能性。還進(jìn)行了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中從帶有腫瘤的SCID/SCID小鼠收獲腫瘤，所述小鼠在3.5周前用MCF-7C20和MCF-7C20Nodl細(xì)胞注射。然后切碎胂瘤組織，放入組織培養(yǎng)燒瓶中。在約一周后，除去任何剩余的實(shí)體腫瘤組織，添加10yg/ml殺稻瘟菌素。然后在存在殺稻瘟菌素的情況下在標(biāo)準(zhǔn)條件下維持播種的細(xì)胞6個(gè)世代。然后使用這些細(xì)胞注射天然SCID小鼠，在60天的時(shí)間內(nèi)測量腫瘤體積改變的時(shí)間過程。含有腫瘤衍生的MCF-7C20或MCF-7C20Nodl細(xì)胞的小鼠都開始生長腫瘤。到注射后15天，兩種細(xì)胞類型產(chǎn)生了近似的計(jì)算出的腫瘤體積50mm3。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)的剩余40天期間，從MCF7-C20Nodl細(xì)胞形成的腫瘤退化到最低限度可檢測的大小(<10mm3),而由MCF-7C20細(xì)胞產(chǎn)生的胂瘤生長到200-270mm3的最大體積(附圖IIA-C)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了，腫瘤細(xì)胞中的Nodl表達(dá)可以引起腫瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡和胂瘤退化。由于MCF-7響應(yīng)于TNFoc經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，使用中和鼠TNFoc的倉鼠單克隆抗體(Bancroft等人.J.Immunol.143:127-30(1989))來進(jìn)一步檢查TNFoc在Nodl誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。這種抗體的存在不抑制細(xì)胞凋亡，因?yàn)楫?dāng)接種MCF-7Blasto或MCF-7Nodl細(xì)胞時(shí)沒有形成腫瘤。此外，如在早先的實(shí)驗(yàn)中觀察到的，當(dāng)將MCF-7C20細(xì)胞注射到小鼠中時(shí)，胂瘤生長。再一次，在至少表達(dá)Nodl的腫瘤細(xì)胞之后腫瘤的缺乏不是由于與MCF-7C20細(xì)胞相比降低的MCF-7Blasto和MCF-7C20/Nodl細(xì)胞增殖速度，因?yàn)檠芯康拿糠NMCF-7系在培養(yǎng)和軟瓊脂菌落形成分析中具有相同的生長特征。此外，通過其他因子的簡單細(xì)胞凋亡阻斷可能不是產(chǎn)生腫瘤生長的機(jī)制，因?yàn)镃LARP(c-FLIP)是caspase8的特異性抑制劑，MCF-7c-FLIP/CLARP細(xì)胞在棵鼠中不能形成腫瘤(數(shù)據(jù)未顯示)。在初步實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)將C20克隆移植到雄性小鼠中時(shí)觀察到更健壯的腫瘤生長，暗示了雌性相關(guān)的激素在腫瘤退化中的作用。通過各種遺傳學(xué)靶點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的進(jìn)一步研究，產(chǎn)生了觀察結(jié)果，在C20細(xì)胞系中缺乏孕激素受體，而它存在于野生型細(xì)胞中，和更重要地存在于C20Nodl細(xì)胞中。此外，PCR分析也揭示了雌激素受體oc存在于三種MCF7細(xì)胞類型的每一種中。在大多數(shù)研究中，在棵鼠中MCF-7細(xì)胞的腫瘤形成需要雌激素對(duì)腫瘤發(fā)生的補(bǔ)充，即使在以高濃度接種細(xì)胞時(shí)。為了進(jìn)一步檢查雌激素在腫瘤發(fā)生中的作用，將所有三種細(xì)胞系連同雌激素彈丸注射到小鼠中(附圖IIB)。正如所料，當(dāng)存在雌激素時(shí)，在注射MCF-7Blasto細(xì)胞的小鼠中腫瘤生長。用MCF-7C20細(xì)胞注射的小鼠產(chǎn)生腫瘤，當(dāng)存在雌激素彈丸時(shí)其生長得更大。有趣地，接受MCF-7C20/Nodl的小鼠在存在雌激素彈丸的情況下不生長腫瘤。這些數(shù)據(jù)表明，Nodl抑制雌激素依賴性腫瘤生長。為了進(jìn)一步證明Nodl途徑在腫瘤生長中的作用，研究了RIP2的顯性陰性等位基因(RIP2ACARD)的表達(dá)，來確定這種等位基因是否也可以干擾MCF-7細(xì)胞生長胂瘤的能力。附圖IIC顯示了，這些RIP2ACARD細(xì)胞生長腫瘤，然而肺瘤小于在MCF-7C20細(xì)胞中觀察到的。結(jié)合起來，這些數(shù)據(jù)表明了，Nodl在腫瘤生長中具有關(guān)鍵作用，Nodl的存在起到了雌激素依賴性肺瘤生長的阻礙物的作用。為了獲得對(duì)這種假說的另外的支持，當(dāng)細(xì)胞在缺乏雌激素的培養(yǎng)基中生長的條件下觀察了MCF-7細(xì)胞系對(duì)雌激素誘導(dǎo)的增殖的敏感性。在這些條件下，響應(yīng)于添加的雌激素，MCF-C20細(xì)胞以及MCF-7RIP2ACARD細(xì)胞經(jīng)歷了強(qiáng)的增殖，而親本和MCF-7C20/Nodl細(xì)胞系都沒有被刺激增值(附圖IID)。然而，對(duì)MCF-7C20細(xì)胞觀察到的雌激素誘導(dǎo)的增殖通過在培養(yǎng)基中添加它莫西芬被阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)。為了確定雌激素的存在是否調(diào)節(jié)Nodl誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，在含有活性炭處理的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在C20細(xì)胞的細(xì)胞凋亡中，雌激素具有很少的或沒有影響，所述C20細(xì)胞基本上不表達(dá)Nodl，其基本上不展現(xiàn)細(xì)胞凋亡(附圖12A,中間畫面)。當(dāng)在缺乏類固醇的情況下培養(yǎng)時(shí)，C20/Nodl和Blasto細(xì)胞對(duì)于yTriDAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更有抗性(沒有類固醇C20/Nodl細(xì)胞展現(xiàn)了10%細(xì)胞凋亡，相對(duì)有類固醇的80%,附圖12A,下部畫面)。因而，針對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性通過添加雌激素被逆轉(zhuǎn)，從而細(xì)胞凋亡以雌激素濃度的劑量依賴性方式提高(附圖12A)。相反，添加它莫西芬部分地阻斷了yTriDAP-Nodl誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(附圖12B)。最后，Nodl的過量表達(dá)顯著地降低了內(nèi)源雌激素受體oc(ERa)的表達(dá)而不影響用作加載對(duì)照的ERK2的表達(dá)(附圖12C)。類似地，在從預(yù)培養(yǎng)的腫瘤分離的細(xì)胞中觀察到ERoc表達(dá)的降低(附圖12C,右側(cè)畫面)。這些數(shù)據(jù)表明，Nodl途徑影響ERoc表達(dá)水平，并因而影響MCF-7乳腺癌細(xì)胞對(duì)于發(fā)展胂瘤的敏感性。明尸/'ww術(shù)人員技能水平的表現(xiàn)，每種作用的專利或公開物通過引用合并在此，如同單獨(dú)完整地或在此列出的完整地通過引用合并在此的程度一物理地合并到本說明書中的權(quán)利。在此描述的特定方法和組合物是優(yōu)選的實(shí)施方式的代表，是示范性的，而不意圖限制本發(fā)明的范圍。在考慮本說明書時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到其他目的、方面和實(shí)施方式，包括在由權(quán)利要求的范圍劃定的本發(fā)明的精神之內(nèi)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對(duì)在此公開的方面進(jìn)行各種替換和修改而不背離本發(fā)明的范圍和精神。在此適當(dāng)?shù)卣f明性描述的發(fā)明可以在缺少任何元素或元件、或限制或局限的情況下進(jìn)行，其沒有在此必要性地具體公開。在此適當(dāng)?shù)卣f明性描述的方法和步驟可以以不同的步驟順序來進(jìn)行，它們不必局限于在此或在權(quán)利要求中指定的順序。如在此使用的和在附隨的權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式"一種"、"一個(gè)"和"該"包括復(fù)數(shù)的內(nèi)容，除非上下文中明顯地另外指示了。因而，例如，引述"抗體"包括多種(例如抗體的溶液，一系列抗體制品)這樣的抗體，等等。在任何情式。在任何情況下二專利也不被解釋為被任何審i員2專利^^局的其他官員或雇員進(jìn)行的任何聲明所限制，除非這種聲明在申請(qǐng)人撰寫的答復(fù)中被具體地和無條件地，或明確保留地采用。已經(jīng)采用的術(shù)語和表述被用作說明書的術(shù)語，并且不是限制性的，在使用這些術(shù)語和表述時(shí)不意圖排除所顯示和描述的特征的任何等價(jià)物或其部分，但公認(rèn)的是，各種修改在要求權(quán)利的本發(fā)明范圍內(nèi)是可能的。因而，要理解的是，雖然本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選的實(shí)施方式和任選的特征具體地公開了，在此公開的概念的修改和變化可以由本定i的本發(fā)明范圍內(nèi)。'、''-',在此已經(jīng)廣泛地和一般地描述了本發(fā)明。落入一般性公開的各種更窄的類別和亞屬分類也構(gòu)成本發(fā)明的部分。這包括帶有從所述屬中除去的材料是否在此具體地?cái)⑹觥Ｆ渌麑?shí)施方式處于以下的權(quán)利要求之內(nèi)。此外，當(dāng)按馬庫什組群的方式描述本發(fā)明的特征或方面時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，對(duì)于馬庫什組群的任何獨(dú)立成員或成員的亞組而言，也由此描述了本發(fā)明。權(quán)利要求1.一種組合物，所述組合物包含載體和治療有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)、γ-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、γ-D-Gln-DAP(iQ-DAP)、D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)或其組合，其中所述治療有效量對(duì)于腫瘤的退化是有效的。1.<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage88</image>1.<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage90</image><image>imageseeoriginaldocumentpage91</image><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage93</image>全文摘要本發(fā)明提供了用于治療腫瘤的組合物和方法，其涉及提高Nod1的表達(dá)和/或NOD1的活性。文檔編號(hào)A61K48/00GK101287501SQ200680014083公開日2008年10月15日申請(qǐng)日期2006年2月27日優(yōu)先權(quán)日2005年2月25日發(fā)明者J·達(dá)西爾瓦,R·J·烏列維奇,韓家淮申請(qǐng)人:斯克里普斯研究學(xué)院