專利名稱：改善細胞對雜質粒子滲透性的方法
技術領域：
本發明涉及改善細胞對雜質離子滲透性的組合物和方法，所述雜質離子包括本發明的探針。
技術背景
細胞是活的生物體的基本單位。幾乎所有細胞的 一個 共有的特征是他們都^皮細胞質膜所環繞(或約束)。細胞膜包裹 細胞內含物并調節物質運動進出細胞。只有能夠擴散穿過細胞膜 或萍皮運輸穿過細胞膜的分子肯以移動進出細月包。有些可以穿過脂 質中心，有些必須乂人空中穿過。還有一些其它的分子，必須以一 種能量依賴的形式與載體相附著才能穿過細胞膜。同樣，細力包核 和其它細胞器官也具有膜結構來調節分子流動進入或流出細月包 器官。
固定是一種化學過程，能夠在一種位置"放置"細胞 分子，從而可以研究細胞或組織。大多數用作固定劑的試劑(例 如，醇和醛，其中醇例如乙醇，醛例如多聚曱醛)是通過與細胞 分子，尤其是蛋白質相交聯而起作用的。這些交聯過程防止胞內 結構的降解。許多固定劑非常適于通過不同的識別方法來保護不 同的胞內分子和結構物。以任意目的被選擇的這些固定劑可以通 過這些目的的特點所決定。
不幸的是，目前的固定方法經常會妨礙隨后研究員或 者醫生進4亍的細月包內成分4企測。才奐句話說，能夠預防細月包降解和 固定的方法同才羊可以妨石尋i午多依賴于大尺寸4企測分子的不同類 型的研究和診斷。據此，人們進行了很多努力來滲透細胞或在固 定后制造渠道。
目前使用的在固定之后滲透細胞膜的方法并不是對 所有樣本都是有效的，且十分嚴格(因此，破壞被研究的結構) 和/或需要昂貴的儀器。例如，Hoffman等(美國專利第6,835,393 號)7>開了聚羧酸聚合物的應用和只用在無固定的才羊品中的用 于破壞細胞膜的pH值。Connelly等人(美國專利第5,597,688和 5,422,277號)公開了帶有2,4 - 二硝基苯磺酸，2,4 - 二硝基安 息香酸或2，4- 二硝基苯的組合物在細胞膜固定和滲透方面的應 用，但是這些組合物限制研究員或醫生選擇固定劑，且因此，限 制必需的實驗靈活性。機械性方法，例如超聲波降解法、電穿孔 等等通常只對未固定的樣品起作用且需要昂貴的儀器。
另外，現有技術中對許多胞內靶分子，例如病原體來 講可利用的研究和i貪斷方法依賴于顯微4竟評1"介、細爿包形態學參 數、染色性質和確定的法分子的存在和缺失。但是，這些診斷方 法中有許多并不完全準確或不足夠靈敏。
目前最需要的是能夠改進樣品細月包"莫對雜質4立子;參 透性的組合物和方法，所述雜質4立子例如帶標記的4全測分子。另 外，還需要的是能夠改進胞內靶分子和病原體的檢測的組合物和 方法。發明內容
在一個實施方案中，本實驗通過體內雜交能夠直接將靶分子或靶分子片斷從細胞中檢測出來，其中所述細胞來自細胞培養基或來自從病人身上獲得的樣品。在一種優選i也實施方案中，所述細月包是病原體。該方法由幾個步驟組成，這些步驟4尤選^E不必須地按照所列出的順序進行。將培養基或樣本中的樣品沉淀到玻璃4反上。將樣品在JE皮璃;f反上用加熱或者用固定劑固定。所述固定劑可以是，例4口，曱醇、甲醇乙酸、丙酮、甲醛或福爾馬林。用IDF溶液處理固定樣品(參見上下文)，并對才羊品進4亍染色或用探針檢測并觀察。作為選擇，將樣本與IDF溶液相混合、培養，然后涂4未或放置在玻璃^反上，風干并固定。IDF溶液可以由以下試劑的任意混和物組成離液鹽(例如，好u^C鹽酸胍或氬氯化物)、離子型去污劑(例如十二烷基磺酸鈉)和/或非離子型去污劑(例如，IPGEL、脫氧膽酸、膽酸或膽汁鹽類)或其他具有相似性質的試劑、曱醇和乙酸。各種試劑在IDF溶液中的濃度依賴于例如被檢測的病原體的細胞壁。盡管本發明不受任何理^侖或機制的限制，但是應該相信，IDF溶液能夠在病原體的細胞壁和/或膜(細胞膜或核膜)上制造"渠道"。這些渠道允許探針滲透細胞壁和細胞膜并進入病原體原生質和/或細胞核。本發明的探4十可以包括DNA、 RNA、 PNA、肽、糖肽、脂肽或醣脂類，或上述物質的任意混和物。樣品中被固定的細胞的耙分子與探針復合物(所述探針復合物包括對靶分子有特異性的結合試劑)相4妄觸，所述探針復合物在適于雜交或結合的情況下對靶分子具有特異性(例如，如Shah和Harris在美國專利第6,165,723中描述的那樣，該專利通過引證在此全部并入本文)。然后，乂人樣品中洗 掉未雜交的或未結合的探針。在一個實施方案中，對被洗滌的樣品用適當的復染色劑(例如，伊文思藍、DAPI、高錳酸鉀等等)染色。通過例如顯微鏡，視覺4全測雜交的活結合的#:針復合物，探針復合物的存在是細胞靶分子存在的一種信號。該方法可以在不同的雜交緩沖液中進行，Shah和Harris在美國專利第 6， 165,723號中公開了本發明的 一些非限制性實施例，該專利通過 引證在此全部并入本文。使用的雜交緩沖液由使用的纟笨針性質決 定。本發明的方法對于檢測細胞、細胞要素是有效的，且優選地 對檢測樣本的病原體也是有效的。例如，這里7>開了非限制性的 特異性探針復合物，所述復合物可有效用于;f全測分歧桿菌類病原 體。
本發明的方法在例如檢測來自多種樣本的核酸、肽、 醣肽、脂肽和醣脂是有效的。作為例子的樣本包括，例如，細胞、 細月包型、組織或重要的病原或病原體，包括，或者書f生自例如血 清、原生質、唾液、尿、腦脊骨逸液、組織和乳液。本發明的《且合 物和方法可以在來自任意生物的任何樣本中 <吏用，所述生物包括-<旦不<又限于哺乳動物、爬4亍動物、魚、鳥、才直物禾口昆蟲。
在一個實施方案中，本發明提供了一種用于增加細;l包壁、細胞膜、細胞器官膜和核力莫滲透性的組合物(IDF溶液)， 所述組合物在一個實施方案中包括GuSCN (石克氰酸胍)、Tris-HC1、乙二胺二乙酸、IGEPAL (辛基苯氧基聚(乙氧基)乙醇)、 醋酸、曱醇、膽酸鈉和脫氧膽酸鈉。本發明進一步預計硫氰酸胍 的濃度是大約2.0到3.3M;Tris-HCl的濃度大約是10到100 mM; Tris-HCl的pH值大約是7.0-9.0;乙二胺二乙酸的濃度大約是5 到50 mM; IGEPAL的濃度大約是百分之0.1到2.0;醋酸的;農度 大約是百分之0.1到10.0;曱醇的濃度大約是百分之20到50; 膽酸鈉的濃度大約是百分之0.02到2.5，脫氧膽酸鈉的濃度大約 是百分之0.02到2.5。
在其他實施方案中，石克氰酸胍》爰沖滴j皮濃度為大約 2M到6M的鹽酸胍所取代。在另一個實施方案中，IGEPAL #皮濃度為0.01% - 2.0%的十二烷基磺酸鈉所取代。在依舊另一個實施 方案中，硫氰酸胍與鹽酸胍結合使用和/或IGEPAL與十二烷基磺 酸鈉結合4吏用。
在一個實施方案中，本發明提供了一種用于給細胞中 靶分子染色的方法，該方法包括a)將細胞與包括GuSCN (硫 氰酸胍)、Tris-HC1、乙二胺二乙酸、IGEPAL (辛基苯氧基聚(乙 氧基)乙醇)、醋酸、曱醇和脫氧膽酸鈉的組合物相4妻觸從而產 生一種具有通透性的細胞；b)將步驟a)所得的具有通透性的細 胞與一種能夠與所述靶分子特異性結合的結合試劑相接觸，和c) 才全測步驟b)所述的結合試劑。
在其他方面，本申請預期上述方法的靶分子選自由， 例如核酸、肽核酸、肽、糖蛋白、脂類、脂蛋白、病毒、朊病毒 和支原體所《且成的《且中。
在其他實施方案中，本發明預期結合試劑選自由核 酸、肽核酸、肽、脂蛋白、糖蛋白、抗體或抗體片斷和脂類所組成的ia中。
本發明的結合試劑可以另外包括一種檢測基團，此枱r 測基團可以選自由例如熒光標記、放射性標記、染料、膠態金屬、 生物素/抗生素蛋白、山葵、過氧化物酶等等所組成的組中。在一 種有選的實施方案中，檢測是通過一種標記的抗體，該抗體對耙 分子抗原具有親和性。 一種包括^r測基團的結合試劑在這里^皮定 義為探針復合物。
在一個實施方案中，在試管中用IDF溶液處理臨床樣 品，隨后煮沸從而在溶液中釋放核酸。這一技術對于耙分子，例 如分歧桿菌、真菌和酵母是有效的，其中所述酵母需要利用例如機械水解(例如，通過超生作用)或與酶長時間培養的方法來消化細胞壁。重要的革巴分子可以進一步#1以下步驟純化(1 )才示準 DNA純化技術或(2 )使用特異性探針進行三明治雜交技術。然 后如果需要的話，在檢測之間可以分別通過PCR或RT-PCR才支術 擴增純化的靶分子DNA和RNA。
在一種更為優選的實施方案中，革巴分子是來自肺結核 分歧桿菌樣支生物的核酸，且結合試劑是 一 種與來自肺結核分Jt支4干 菌微生物的核酸互補的寡聚核苦酸(或PNA探針)。
在另一個方面，該方法還包括背景染色/人而更高的加 亮或顯現檢測基團。背景染色和染色技術對于本領域普通4支術人 員來講是已知的。
具體實施方式
本發明基于一種發現，此發現是一種改進的方法，此 方法通過體內雜交的方式能夠使探針滲透進細胞(例如一種病原 體)的細胞壁和/或細胞膜，從而4企測來自培養基或個體(例如， 血涂片、活組織檢查切片、石蠟包裹的組織和)樣本的細胞中輩巴 分子核酸、蛋白質、肽、脂肽、醣肽、脂質體等等的存在。本發原體可以在例如，唾液、全血、中樞脊髓液(CSF)、其他體液或 受感染的組織中發現。更具體的，這里描述了對于傳統的固定/ 預處理方法的新型改進，這種改進允許探針(例如，寡居核苷探 4十)滲透進入細月包(例》0，病原菌，比3口，細菌、病毒、真菌、 酵母和原生動物)，這些可以^立于^皮感染的宿主細月包的內側或外 側。另外，在與熒光標記的探針進行雜交之后進行一種具有復染 劑(例如，DAPI、伊文斯藍、高錳酸鉀)的過程，從而允許帶 有雜交探針的生物體在培養基或臨床樣品中更加容易觀察到。
這里描述的新穎獨特的體內雜交預處理過禾呈、4全測技 術和本發明組合物允許在細胞、孩i生物或組織部分中4吏用重組 DNA、 RNA、 PNA、肽、醣蛋白、月旨類和醣脂作為4罙4十，且與細 菌學、寄生蟲學、組織學和病理學實—驗中常用的顯賴U竟才企查方法 相匹配。本發明對樣品細胞(或組織)使用了經過預處理的核苷 序列的核酸探針，并通過例如顯微鏡、電子顯微鏡、流式細J包計 數或放射成像(例如，X-射線成像、磷成像)的方法檢測樣品， 從而確定哪些細萬包(或組織)含有重要的特異性革巴分子(例3口才亥 酸序列)。因此，在感染的全血涂片或組織切片中，病原-微生物 例力口細菌、病毒、原生動物或真菌可以在凈皮感染的細月包之內斥企測 出來。這種方法提供了游泳的診斷和科學信息，因為特異性核酸 的存在或缺失與 一 種或 一 種以上的可觀察到的結構和形態學有 關，且在這種情況下，提供了臨床診斷和預后。
用于乂人標本中直4妻發現輩巴分子核酸片卓殳的方法有以下 步驟組成，優選的，這些步驟4姿照所列順序進4于。首先將乂人個體 處獲得的樣品;故置在載玻片上。用固定劑(例如，曱醇、曱醇-乙酸固定劑或者福爾馬林醋酸固定液)將樣品固定在載玻片上。 一旦樣品被固定，用本發明的組合物和方法滲透樣品細胞。估支為 選擇，在試管中將樣品與IDF溶液混合，培養然后放置在載^:片 上，風干并固定。然后，在適于雜交的條件下用對靶分子有特異 性的探針接觸細胞。
在雜交足夠時間之后，從樣本中洗去所有未雜交的探 針。在一種優選的實施方案中，隨后將樣品與一種復染色劑(例 如，伊文思藍、高錳酸鉀等等)相接觸。無論樣品是否被復染色 了，則與樣品靶分子雜交探針可以通過例如顯微鏡檢查法進行視覺才企測。在樣本中#:針的存在是靶分子片#殳存在的一種表現。與本發明原位雜交試同時或者順序進行的復染色樣品能夠清除的確定樣品中靶分子的位置，乂人而^是高本發明方法。這種4言息有 助于更清楚的確定基質雜交作用。
本方法適用于從個體獲得的任何樣品。這包括zf旦不4又 限于，全血、血清、血漿、痰液、尿、母乳、大腦脊髓液和組織。 本方法還適合于纟果測昆蟲質粒、昆蟲細胞、才直物細月包、真菌和細 菌細胞內的病原體或者其他靶分子。
固定細胞或者組織的目的是將細月包固定并^f呆持細i包或 者組織的形態學，使細胞成分，例如，RNA在原位雜交期間凈皮 維持在細胞基質之內，并同時交聯和/或沉淀在細胞基質中的蛋白質，因此細胞或者組織對探:針:;參入和隨后的雜化作用^f呆持基本上開》文的結構。
在一種優選的實施方案中，本發明的揮:針包括，例如 合成的或者生物學上生產的核酸(DNA、 RNA和等^f介物)；；肽 核酸(PNA;和等《介物)；包含特異性核酸的肽(和等價物)或 者在精確條件下與特異性細胞靶分子雜交的肽序列。在另 一實施 方案中，本發明的探針包括合成的或者生物學上生產的糖肽、脂 肽和朊病毒或者在精確的條件下與細胞內特定的靶分子結合的 朊病毒-樣分子(或者其等價物)。
探針復合物的定義是包括一種標記物基團的探針，所 述標記物基團適合于檢測過程。如果探針是一種核酸，標記物基 團附屬于5'末端、3'末端、內部或者在其任何一種結合物中。優 選的標記物基團是一種識別標記，例如》文射性同位素示蹤(例如， p32、 I125、 H3)、生物素標記或者熒光標記。做為選擇，所述探針 具有一種標記的聚脫氧核苦酸尾部，該聚脫氧核苷酸尾部^皮用來斗全測探針復合物。該探針復合物可能還由多種不同的核酸序列、 PNA、肽、糖肽、脂肽或者朊病毒或者包括一個或一個以上標記物基團標記的其任何一種結合物組成。如果大于一個一個纟罙4十基 團被標記，則最好用不同的標記物基團來標記每一探針基團。
寡聚核苷酸探針的核苷酸序列核苷酸序列基本上與至 少至少一部分耙分子耙分子核酸互補。靶分子核酸既是一種在固定細胞或者組織之內正常存在的核酸，又是，喉支為選擇，在與異探針復合分子優選由DNA或者RNA片段組成，DNA或者RNA 片^a的大小在大約10-50個核苷范圍內。
肽探針包括，例如，抗體及已知能夠結合少見定的耙分 子或靼分子范圍的其他分子。非抗體探針的實施例包4舌，例如， 酶和酶底物和其作用部分。另外，已知的藥物或者化學試劑可以 選擇性地結合革巴分子蛋白質(例如，抗生素可以結合細菌)。例 如，脂肽具有在細胞中檢測脂質體基團的用途，所述細胞包括細 月包中的特異性細月包器或者細月包器部分和內在4匕細菌。例如，#唐肽 妨礙血小^反凝聚并因此可以用來耙向在血小々反起作用過程中必 需的分子，由此幫助凝結異常的研究和診斷。朊病毒或者朊病毒 一部分可以-陂用作，例如，對神經學組織的揮:4十。同才羊，朊病毒 可以是固定樣品中的耙分子。
在一種優選的實施方案中，被添加給樣品的探針多于 輩巴分子(例如，10:1、 100:1或者1000:1 )。這可以4吏雜交雜交反應有效地進行并促進^:針靶分子的結合。
通常通過在纟羊品上添加一種纟果4f溶液，〗吏纟果針復合物(包括，例如，DNA、 RNA和/或PNA)與固定樣品的樣品輩巴分 子(例如，核酸)相接觸。適合于雜交作用的示范性的條件是能 夠提供適當的緩沖液環境的溶液。適用于雜交作用的溶液的一些 實施例是1 ) 一種包括大約10%到50%的曱酰胺、2X.SSC ( pH7.4)和1% NP40的4C沖液；2) —種包4舌大約1.5 M到4 M的 GuSCN緩沖液、5MGuSCN原料緩沖液的緩沖液；其中GuSCN 原料纟爰沖液由5 M GuSCN、 100 mM Tris曙HC1 ( pH 7.8)、 40 mM 乙二胺四乙酸、P/。NP40所組成。通過加入IxTE pH 7.8來3希釋 庫存緩沖液到指定的GuSCN摩爾濃度，乂人而產生上面^是到的 GuSCN -爰沖液的摩爾濃度。3) —種包括大約2到6 M GuHCl 緩沖液的緩沖液。8 M GuHCl緩沖液由8 M GuHCl、 200 mM Tris 隱HC1、 (pH7.8)、 40mM乙二胺四乙酸、P/oNP40所組成。通過 加入IxTEpH 7.8來稀釋庫存緩沖液到指定的GuHCl摩爾濃度， 從而產生上面提到的GuHCl緩沖液的摩爾濃度。4)一種包括曱酰 胺(20 - 50% )和GuSCN緩沖液的混合物的緩沖液，(例如，0.5M 到3M)。 5)—種包括GuSCN緩沖液、(例如0.5M到3M)和 GuHCL緩沖液(例如IM到5M)的混合物的纟爰沖液。
具體的組合物和雜交|￡沖液的濃度隨揮:針的種類或 使用的探針組合物的不同而變化。組合物和使用的緩沖液的濃度 還依賴探針的于Tm(熔化溫度雙鏈DNA分離形成兩個互補單鏈的溫度)、揮:針序列、揮:針長度和雜交溫度，本領域技術人員 只需進4亍常^見實-驗方法就可以確定所述組合物和4吏用的l爰沖液濃度。
本發明不局限于1壬<可一種具體的雜交溫度，然而，應 該理解，在雜交緩沖液中利用曱酰胺可以使雜交作用在比標準雜 交過程4氐得多的溫度下進4亍。例如，在水相雜交纟爰沖液，例4口氯 化鈉中，對靶分子有特異性(對宿主細胞沒有特異性)的普通探 針復合物通常需要的溫度大約是60 - 65 :攝氏度。在上述雜交液 l)中進行的相同雜交作用在大約42攝氏度下進行，且具有相等 的特異性。
同才羊，GuSCN的4吏用也能夠4吏雜交作用在比標準雜交 過程低得多的溫度下進行。例如，在普通步驟中，在水相雜交緩 沖液，例如氯化鈉中，對靶分子有特異性(對宿主細胞沒有特異 性)的普通探針復合物通常需要的溫度大約是60 - 65攝氏度。 在GuSCN或者GuHCl雜交緩沖液中進行的相同雜交作用在大約 37攝氏度下進行，且具有相等的特異性。
在雜交作用完成之后，通常通過使用 一系列洗滌緩沖 液洗滌從樣品中洗去未雜交的探針。本領域技術人員能夠確定適 當的洗滌緩沖液和洗滌時間。在一個實施方案中，洗滌緩沖液包 括0.3M的氯化鈉、0.03M的檸檬酸鈉、和0.1o/。SDS。另 一種 適當的洗滌緩沖液包括磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
在洗清之后，可以對樣品進行復染色。在一個實施方 案中，背景的復染色能夠提高雜交探針的顯色。優選的復染色劑 是，例如，DAPI、伊文思藍和高4孟酸鉀。本領域技術人員已知 一些其他適當的復染色劑。當使用熒光標記的探針來檢測對靶分 子有特異性的核酸、蛋白質、糖蛋白和脂蛋白時，通常會用到染 色步驟。盡管有一定幫助，但是本發明的實施方案不需要進4亍復 染色。
通過使用適合特異性基團的方法來檢測探針，其中所 述特異性基團被用于標記探針復合物。檢測熒光標記探針的優選 的方法是使用例如，特殊的綠色、紅色和藍色顯微鏡過濾器(即， 熒光顯孩H竟檢查法)。通過例如自動射線照相術和磷光劑成^f象4支 術可以檢測到雜交的放射性標記探針。生物素標記的探針可以通 過酶催化檢測系統檢測，這種檢測系統是可商業購得的。
通過與4采針復合物進行反應，上面描述的方法可以在 單一臨床樣品中同時檢測到不同的病原體，所述纟采針復合物由i午多不同的核酸序列組成，每個都用不同的標記物基團標記。為了同時沖企測不同的寡聚核苷酸揮:針，它們可以祐:i殳計成所有的揮:4十 復合序列具有非常相似的Tm (熔化溫度)值，其中，所述寡聚 核苷酸探針對存在于樣品中的不同靶分子的不同核酸具有特異 性。然后用不同的可4企測基團(例如，不同的熒光基團)標i己每 一特異性寡聚核苷酸。用含有許多組分的探針復合物進行雜交。 雜交的樣品按照上邊的表述進行處理，并通過適合于檢測4果針復 合物不同標記的寡聚核苷酸的方法^L察才羊品(例如，如果〗吏用不 同的熒光基團的話，則使用適當的過濾器觀察)，從而檢測在樣 品中存在哪些靶分子。
本領域普通技術人員和醫師可以識別與這里描述的原位雜交過程共同 <吏用的新型預處理過程與所有過去已知的監測 方法和這里描述的方法兼容，且并不祐 使用的4企測方法所限制。 原位雜交過程已經被革新，因此需要更少的操作，且因此能夠在 很短的時間內進行。本發明的實施方案還包括試劑盒，所述試劑 盒包括本發明的組合物。以試劑盒形式存在的組合物能夠允許這 里所描述的過程以多種不同的實施方案實施，這里描述的過禾呈包 括已經與多種檢測方法進行簡明性和兼容性優化的方法。可以預 料，這里制備的包含特別制備的試劑和探針的試劑盒更適合于在 臨床/診斷實驗室中應用，在臨床/診斷實驗室中，檢測特異性 核酸存在或者缺少的能力可以用來陽性地或者陰性地識別以具 體耙分子的存在為特征的病理狀態。
現有^支術中對于多種細月包病變可用的i貪斷方法耳又決于 微觀評價、細胞形態學參數、表面抗點蝕特性、和某些靶分子的 存在或者缺失。然而，許多診斷方法并不完全準確或者不充分壽文 感。在原位雜交過程忠使用上面描述的規程和病原體特異性探針，能夠比較容易且更加準確的識別樣品中的靶分子(包括但不ff曰.工4広乂Jr 、|> j > 7PV/;r、Y十、乂0
本發明提供了一種用于原位雜交過程的簡單的預處理 方法，這些方法提高了探針對細胞的滲入性，且因此，與過去所 描述的過程相比改進了雜交和才企測特性。這種改進包^舌通過增加 特異性"信號"的雜交和探測效率來最大化試驗的敏感性。盡管本 發明不局限于任何一種具體的機制，人們普遍相信增加的靈4文度 是由于改進的雜交過程，雜交過程是通過改進^笨針對細胞的滲透 作用來實現的，同時最大化靶分子(例如核酸序列)在細胞或者 組織中的保持力且最大化細胞或者組織樣品的另 一 種生物化學 和形態特征的保存。實施例
—種上述方法優選的且非限制性使用在于從培養基或 從痰液中才全測結核分枝桿菌。本領域普通技術人員應該了解并理 解，新型的方法同樣適合于多種其他系統、細胞、組織培養和組 織，用于與重要的特異性核酸雜交(或者4企測^^細月包、組織或者 病原體其4也的細"包組分)，同時l呆持細力包完整和形態學。實施例
將培養物或者病人的痰液涂在玻璃平板上，并風干。 洗滌被培養的細胞并通過離心作用濃縮。將洗滌的細胞懸浮在帶 有BSA的磷酸鹽緩沖液中。為了4吏細胞失活，在100纟聶氏度下 煮沸懸浮的細"包15分鐘。才羊品制備方法1
用1 ) NALC/NaOH或2 ) NALC/NaOH處理痰液隨 后在100 l聶氏度下煮沸經過處理的痰液15分鐘，4吏樣品失活， 或3)用離液序列高的溶液，例如，鹽酸胍或石充^碌u酸鹽(簡單 的i兌，才目對于疫液2隱3個體積、的5 M GuSCN或8 M的GuHCl才目 混合)處理痰液。在37才聶氏度下培養樣品20分鐘。離心才羊品4吏 細胞成J求狀。用^粦酸鹽緩沖溶液洗滌細胞。將洗滌后的細力包懸浮 在帶有1。/。 BSA或4) 一種離液序列高的溶液，例如，鹽酸胍或 硫代硫酸鹽的磷酸鹽緩沖溶液中，隨后煮沸(如上面步驟3所述)， 此外，在100攝氏度下煮沸懸浮在帶有1。/。BSA磷酸緩沖液中的 細月包15分鐘，從而殺死分纟支4干菌。隨后將所-彈的培養物或痰液 才羊品涂布到^皮璃纟反上，然后風干。
用甲醇或乙酸甲酯或乙醇固定樣品。用IDF溶液處理 固定的涂片(如Supra所公開的)10分鐘。IO分鐘之后，用磷 酸》爰沖液洗滌涂片3次，并風干。才羊品制備方法2(Supra)在試管中混合并在室溫(20-25攝氏度)下混合15分 鐘。隨后將痰液-IDF混合物涂布到玻璃4反上，風干并用曱醇固定。 省去雜交之前對固定涂片進行的IDF處理過程。在雜交之前用磷 酸緩沖液洗滌玻璃板3次。才羊品制備方法3
在20-25攝氏度下(室溫條件下)用含有2 %的戊二 醛的磷酸緩沖液處理玻璃^反上甲醇固定的痰液-IDF混合物5分 鐘，然后用磷酸緩沖液洗滌三次，并風干。省去雜交之前對固定 涂片進行的IDF處理過程。才羊品制備方法4
將1體積的未處理過的病人痰液與兩體積的IDF溶液 (Supra)在試管中混合并在室溫(20-25攝氏度)下混合15分 鐘。將痰液-IDF混合物煮沸15分鐘來釋;^文溶液中的核酸并同時 4吏才羊品無傳染性。通過標準才支術可以將核酸乂人煮沸的樣品中純化 出來，或者所需要的靶分子核酸可以使用特異性探針和磁珠通過 三明治雜交篩選出來，如Shah等人所述(Shah J. S.， King W， Liu J.， Smith J., Serpe G. and Popoff S.， and. (1997) . Assay improvements. 美國專利第5，629，156號。該專利通過引證在此全部并入本文)。 通過PCR (對于DNA靶分子)或RT-PCR (對于RNA靶分子) 過禾呈可以擴增純4匕的草巴分子。樣品探測
—種寡聚核苷酸揮:4十由一種DNA序列組成，所述 DNA序列能夠特異性的與肺結核分歧桿菌的23 S核糖體RNA雜 交，^口 Shah, Nietupski和Liu(美國專矛j第5,521,300號)戶斤述。聲斤 述寡聚核苷酸優選的用語4全測細月包中肺結核分歧桿菌的存在。合 適的探針復合物的例子是PI. TB探針5'_羅丹明纟錄-AGA — ACA — CGC - CAC — TAT - TCA _ CAC —GCG — CGT — ATG — C - 3 ' [SEQ ID NO: 1] 66.5cP2 -Tb-1 51-2c5'-羅丹明纟錄—TTC _ GAG — GTT — AGA — TGC — CC - 3' [SEQ ID NO: 2]P3.分歧桿菌探針5'陽熒光淬滅基團陽ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC隱3' [SEQ ID NO: 3] 68.7cP4 —分歧桿菌屬揮:4十-54.1c 5'-熒光淬滅基團—GCA — TTA — CCC — GCT — GGC畫3' [SEQ ID NO: 4]P5 -伯克霍爾德氏菌探針5' — FAM — CTT — GGC — TCT — AAT — ACA — GTC — GG - S' [SEQ BD NO: 5] tm52cPNA探針.
在一個實施方案中，在37攝氏度條件下，該探針復 合物與經過固定/預處理的樣品中的核酸相4妄觸，其中，所述經過 固定/預處理的才羊品<立于2.5 M GuSCN， 50 mM Tris (pH 7.8), 20 mM乙二胺四乙酸和1%NP40的雜交緩沖液中。在一個可選擇的 實施方案中，該揮:針復合物在42才聶氏度下與固定樣品中的核酸 相接觸，所述固定樣品位于50 %甲酰胺，2X SSC (pH 7.4), 20 mM乙二胺四乙酸，1%NP40的雜交緩沖液中。
用于檢測分歧桿菌屬的交替探針復合物中使用的合 適的寡聚核苷酸序列的例子是P2 -Tb-1 51-2c5'陽羅丹明纟錄_ TTC _ GAG — GTT — AGA _ TGC — CC — 3 ' [SEQ ID NO: 2]P3.分歧桿菌屬探針5'-熒光淬滅基團 -ATC GCC CGC ACG CTC ACAGTTAAGCCGTGAGATTTC -3'[SEQIDNO: 3] 68.7cP4 -分歧桿菌屬揮:針-54.1c 5'-熒光淬滅基團—GCA — TTA _ CCC — GCT _ GGC - 3' [SEQ ID NO: 4]SEQIDNOs:3和4及其互補序列適用于檢測分歧桿菌屬。 SEQIDNOs:l和2及其互補序列適用于4企測肺結核分歧桿菌。 SEQIDNO: 5適用于才企測伯克霍爾德氏菌。
由于在細菌細胞中存在大量的rRNA ( 1,000- 10,000 拷貝)，所以在檢測分歧桿菌病原體時選擇使用核糖體RNA序 列。優選的探針復合物的寡聚核苷酸是一種DNA,該DNA帶有 與肺結核分歧桿菌rRNA的互補序列。優選用熒光素在3，和5， 末端對寡聚核苷酸進行標記。應當理解，RNA寡聚核苷酸探針 同才羊也可以^皮z使用。
如上所述，揮:針總量是一種預計的量，該量應該超過 ^=羊品中可能具有的可利用rRNA的估計量(大約100 : 1 ), 乂人而 使雜交反應更為有效且能夠促進高速率的探針靶分子退火。在 定量術語中，這需要探針由30個核苷長度的寡聚核苷酸組成， 且使用的濃度范圍為1-10 ng/ml，從而在背景上產生可靠的信號。
應當理解，使用GuSCN還能夠使雜交過程在比普通 雜交過程低得多的溫度下進行。對靶分子有特異性(但對宿主細 胞無特異性)的特異性探針在水相雜交溶液，例如氯化鈉中進行 雜交作用，需要大約60-65攝氏度的溫度。但是在上述GuSCN 或GuHCl雜交緩沖液中進行的雜交作用在37才聶氏度下就可以確 保專一性。
原4立雜交方法的 一 個 <尤勢在于相7+少量的細"包包4舌 一種樣品，大量的一致才羊品可以在短時間內^皮處理。這里所描述 的獨特的原位雜交方法是十分簡單的。本發明的方法還可以用于 很多樣品中，包括，但不僅限于石蠟包裹的組織部分、丙酮固定 的樣品。
這些試驗的結果顯示出在被試驗的樣品中檢測到靶 分子(病原體DNA)，在對照樣品中沒有才企測到輩巴分子。在用本 發明IDF溶液處理過的樣品中檢測到的輩巴分子通常比較好。在不 進行過度試驗的情況下，本領域普通技術人員應當可以認識、理 解并明白本發明的IDF溶液可以在許多需要4罙4十(或其他小物 質)有歲丈進入細月包、病原體(例如，l立于細月包中的病原體)或細 胞器官的情況下使用。
從以上敘述可以明白，本發明^是供了用于增加細胞、 細胞壁、細胞膜、細胞器官和細胞器官膜滲透性的組合物和方法， 用于幫助，例如才企測細月包內成分和/或病原體。
權利要求
1.一種用于增加細胞壁、細胞膜和核膜滲透性的組合物，包括GuSCN(硫氰酸胍)、Tris-HCL、乙二胺四乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)、乙酸、甲醇、氯化鈉和脫氧膽酸鈉。
2. 根據4又利要求1所述的組合物:約是2.0到3.3 M。
3. 根據權利要求1所述的組合物:大約是10到100 mM。
4. 根據權利要求1所述的組合物:值大約是7.0到9.0。
5. 根據權利要求1所述的組合物, 度大約是5到50 mM。
6. 根據權利要求1所述的組合物， 約是百分之0.1到百分之2.0。
7. 根據權利要求1所述的組合物， 百分之1.0到百分之10。
8. 4艮據權利要求1所述的組合物, 百分之20到百分之50。
9. 才艮據纟又利要求1所述的組合物, 是百分之0.02到百分之2.5。3核膜滲透性的組合物，包括 CL、乙二胺四乙f臾、IGEPAL乙醇)、乙酸、曱醇、氯4b鈉 其中所述好L氰酸胍的濃度大其中所述Tris - HCL的濃度 其中所述Tris - HCL的pH 其中所述乙二胺四乙酸的濃 其中所述IGEPAL的濃度大 其中所述乙酸的濃度大約是 其中所述曱醇的濃度大約是 其中所述^^酸鈉的濃度大約
10. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述脫氧膽酸鈉的濃度 大約是百分之0.02到百分之2.5。
11. 一種用于對細月包中草巴分子染色的方法，包4舌a) -使細月包與 一種組合物相4妄觸乂人而產生一種可滲透細月包，所述組合物包 括GuSCN (碌u氰酸胍)、Tris - HCL、乙二胺四乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)、乙酸、曱醇、氯化鈉 和脫氧膽酸鈉；b)將步驟(a)的可滲透細胞與對結合所述 靶分子有特異性的粘合劑相接觸，和；c)一全測步驟(b)所述 的粘合劑。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述靶分子選自由核酸、 肽核酸、肽、糖蛋白、脂質體、脂蛋白、病毒和朊病毒所組 成的《且中。
13. 根據權利要求11所述的方法，其中所述粘合劑選自由核酸、 肽核酸、肽、脂蛋白、糖蛋白和脂質體所組成的組中。
14. 才艮據4又利要求11所述的方法，其中所述粘合劑還包括一種 才企測基團。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中檢測基團選自由熒光標 記物、放射性標記物、染料、膠態金屬、生物素/抗生物素蛋 白和山葵過氧化物酶所組成的組中。
16. 才艮據權利要求11所述的方法，其中所述4企測作用是通過一 種對所述粘合劑有親合性的標記抗體完成的。
17. 根據權利要求11所述的組合物，其中所述GuSCN的濃度大 纟々是2.0多J 3.3 M。
18. 根據權利要求11所述的組合物，其中所述Tris-HCL的濃度 大約是10到100 mM。
19. 根據權利要求11所述的組合物，其中所述Tris - HCL的pH 值大約是7.0到9.0。
20. 根據權利要求11所述的組合物，其中所述乙二胺四乙酸的 ;農度大約是5到50 mM。
21. 根據權利要求11所述的組合物，其中所述IGEPAL的濃度大 約是百分之0.1到百分之2.0。
22. 一艮據權利要求11所述的組合物, 是百分之1.0到百分之10。
23. 根據權利要求11所述的組合物， 是百分之20到百分之50。
24. 4艮據4又利要求11所述的組合物， 約是百分之0.02到百分之2.5。其中所述乙酸的濃度大約 其中所述曱醇的濃度大約 其中所述膽酸鈉的濃度大
25. 才艮據^又利要求11所述的組合物，其中所述脫氧月旦酸鈉的濃 度大約是百分之0.02到百分之2.5。
26. 根據權利要求11所述的方法，其中所述靶分子是一種來自 孩吏生物結核分枝桿菌的核酸。
27. 根據權利要求11所述的方法，其中所述粘合劑是一種與來 自孩t生物結核分枝桿菌的核酸互補的寡聚核苷酸。
28. 根據權利要求11所述的方法，其中所述方法還包括背景染 色法。
全文摘要
本發明提供了一種方法，用于允許雜質離子非常有效的滲透細胞的細胞壁、細胞膜、細胞器官膜和/或核膜，并與細胞中的補體靶分子雜交或結合。所述細胞來自培養基或來自病人體內獲得的樣本。雜質離子可以是探針，所述探針由以下物質單獨或兩個或兩個以上的結合體組成，例如DNA、RNA、肽核酸(PNA)、糖肽、脂肽、醣脂類或朊病毒。所述靶分子是一種細胞、一種細胞成分或者優選地一種病原體或病原體成分。所述病原體可以是例如細菌、真菌、酵母或者病毒。
文檔編號A61K31/155GK101272773SQ200680035276
公開日2008年9月24日 申請日期2006年7月27日 優先權日2005年7月28日
發明者J·S·沙阿, 海倫娜·威奧特曼 申請人:Id-菲什技術公司