針對抑制viii因子的抗體的細胞毒性抗體的制作方法

文檔序號：1127413閱讀：451來源：國知局

專利名稱：針對抑制viii因子的抗體的細胞毒性抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及針對抑制人VIII因子的抗體的抗獨特型抗體，所述抑制
性抗體靶向人VIII因子的C2區，所述抗體的每條輕鏈的可變區的核苷酸編碼序列與鼠科動物的核苷酸序列SEQ ID NO: 1具有至少70%的一致性，所述抗體的每條重鏈的可變區的核苷酸編碼序列與鼠科動物的核苷酸序列SEQIDNO:2具有至少70%的一致性，所述抗體的輕鏈恒定區和重《連恒定區來源于非鼠科種的恒定區，本發明還涉及所述抗體在激活細胞毒免疫細胞的FcYRIII受體，以及生產藥物，特別是用于治療血友病的藥物中的應用。
背景技術：
A型血友病是與X染色體異常連鎖的遺傳性疾病，其導致受損傷之處血液不能凝集。A型血友病是最常見的影響血液凝集的缺陷癥；在法國，每5000人中就有1人罹患，其占血友病病人的80%。該病是有關凝集的蛋白，因子VIII (FVIII)的基因變異所致，其既可以由于血液中完全缺乏FVIII，也可以是FVIII的部分缺陷。
血友病病人的20%罹患血友病的另一類型，血友病B;其由另一凝血因子，IX因子的在夾陷引起。
當前的血友病治療(A型或B型)包括以靜脈途徑給藥缺陷或缺失的凝血因子。在法國，意在治療A型血友病病人的FVIII可以以來源于血液的藥物的形式獲得，所述血液由法國血液分割暨生化制品實驗室 (Laboratoire Franq;ais du Fractionnement et des Biotechnologies)(LFB)或國際藥物實驗室供應，還可以以來自于基因工程的重組藥物的形式獲得。事實上，已分離到編碼FVIII的DNA,并已在哺乳動物細胞中表達(Wood 等人，Nature (1984) 312: 330-337 )，并且已根據cDNA推斷出其氨基酸序列。
分泌出的FVin是分子量為300 Kda (2332個氨基酸)的糖蛋白，其在內源性凝血通路中扮演重要的角色。無活性的FVIII由六個結構域組成從N末端到C末端為，Al( 1-372殘基)、A2( 373-740殘基)、B( 741-1648 殘基)、A3 ( 1690-2019殘基)、CI (2020-2172殘基)和C2 (2173-2332 殘基)。分泌后，FVIII與溫韋伯氏因子(von Willebrand factor, vWF )相互作用，vWF保護FVIII不受血漿蛋白酶作用。經凝血酶切割后，FVIII 從vWF上解離。切割使B區^皮排除，并形成異源二聚體。FVIII以該形式在血漿中循環。該異源二聚體由一重鏈(A1、 A2)和一輕鏈(A3、 Cl、 C2)組成。
當將FVIII灌輸入血友病患者體內時，其與患者血液循環中的vWF 結合。激活的FVIII作為激活的IX因子的輔助因子起作用，IX因子加速 X因子到活性X因子的轉換。激活的X因子使凝血酶原轉換成凝血酶。之后凝血酶使纖維蛋白原轉換成纖維蛋白，并出現凝集。
在給藥FVIII中出現的主要問題是在患者體內出現抗FVIII的抗體，其被稱為"抑制性抗體"。這些抗體中和FVIII的促凝活性，導致當抗體一經灌注，FVIII就被滅活。因此，在能夠抑制出血之前，所應用的凝血因子就被破壞，其中出血導致了一系列的血友病并發癥，使治療失去了效力。而且，某些非遺傳性血友病患者可以產生抗內源性FVIII的抑制劑其為獲得性的血友病。
研究顯示，抗FVIII免疫應答是多克隆的，主要針對A2和C2結構域(Gilles JG等(1993) Blood; 82: 2452-2461 )。為研究FVIII抑制劑的形成，建立了動物模型；用重組人FVIII免疫的大鼠顯示出快速的多克隆型的免疫應答(Jarvis等Thromb Haemost. 1996 Feb; 75 (2):318-25 )。
抗FVIII的抑制性抗體干擾FVIII功能的機制有許多，包括干擾FVIII 的蛋白裂解，及干擾FVIII與不同伴侶如vWF、磷脂(PL)、 IX因子、活性X因子(FXa)或APC (活化蛋白C )的相互作用。
有幾種治療可以減輕這種免疫應答的后果，例如包括涉及去氨加壓素，其是刺激FVIII產生的合成激素、諸如促進血栓形成復合物
(prothrombic complex)的濃縮物或激活的促進血栓形成復合物的濃縮物的促進凝集的因子、重組Vila因子，對大量或中間量的FVin進行血漿除去并灌注的治療。但是這些方法仍然成本昂貴，不是非常有效率。
另外，就在最近，應用抗獨特型抗體中和抑制性抗體在戰略上受到青睞(Saint-Rimy JM等(l999) Vox Blood; 77 (suppl 1): 21-24 )。鼠科動物抗獨特型單克隆抗體，14C12,見于WO 2004/014955中的描述，在體內以劑量依賴模式對抑制人FVIII的抗體的抑制特性進行中和。但是，這些抗體只進行抗體的中和作用。它們對抑制性抗體的分泌上游沒有影響。
因此，非常需要新的治療工具，使得既能夠中和循環中的抑制性抗體又能夠對抑制性抗體的分泌上游進行作用以使其減少。
本申請人開發出了新的工具，其可用于治療血友病A，既作用于分泌出的抑制性抗體，又作用于分泌抑制FVin的抗體的漿細胞的前體的上游，特別是記憶性B細胞。

發明內容
本申請人開發出了新的細胞毒性抗獨特型抗體，所述抗體針對抑制 FVIII的抗體，使得既能夠通過結合這些循環抑制性抗體而中和它們，也能夠通過ADCC (抗體依賴性細胞介導的細胞毒)機制引起它們的溶解
抗獨特型抗體是指具有與其他抗體的可變區相互作用的能力的抗體。
根據本發明的抗獨特型細胞毒性抗體針對結合任何人FVIII結構域，例如Al結構域、A2結構域、B結構域、A3結構域或者還有Cl結構域的任何抑制性抗體。根據本發明的優選的抗獨特型抗體是針對結合至 FVIII的C2結構域的抑制性人抗體。
FVIII的C2結構域包括磷脂(PL)結合位點，和主要的溫韋伯氏因子(vWF)結合位點。磷脂的結合對于FVIII的生理活性，特別是與IX 因子(FIX)和X因子(FX)形成特納斯(tenase)復合物是必不可少的。 vWF作為伴侶蛋白，保護FVIII不被早期降解和清除。針對FVIII的C2
結構域的FVIII抑制性抗體是在發生抑制性抗體的病人中最常遇見的抑制劑。根據本發明的靶向針對FVIII C2結構域的抑制性抗體的優選抗獨特型抗體是特別有益的，因為它們能夠影響大多數發生有抑制性抗體的A 型血友病患者。
因此，本發明的目的之一涉及針對抑制人FVIII的抗體的抗獨特型單克隆抗體，該抑制性抗體針對人FVIII的C2區，根據本發明的該抗獨特型單克隆抗體的每條輕鏈的可變區由具有與鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO: 1至少為70%的一致性的核苷酸序列編碼，每條重鏈的可變區由具有與鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO: 2至少為70%的一致性的核苷酸序列編碼，并且其輕鏈和重鏈的恒定區為來源于非鼠科種的恒定區。
有利地，序列的一致性至少為70%,優選至少為80%,更優選至少為95%或至少99%的一致性。通過將2個待比較的序列進行比對，并計算具有一致核苷酸的位置的數量，該數量除以序列中核苷酸的總數，計算出一致性百分比。遺傳密碼的簡并性可以是由于同樣的氨基酸可以由幾個不同的核香酸三聯子密碼編碼。在任何情況下，這些序列的不同不影響單克隆抗體對靶的特異性，也不影響其通過結合目標抑制性抗體而中和它們的抑制活性。優選地，根據本發明的抗體對其靶的親和性是一致的或幾乎一致。
出于本發明的目的，等價的表述"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物" 是指具有一致而獨特的特異性的抗體分子制劑。
根據本發明的抗獨特型單克隆抗體，其輕鏈和重鏈的可變區屬于的種不同于其輕鏈和重鏈的恒定區屬于的種，這種抗體被定義為"嵌合"抗體。
可以使用本領域技術人員已知標準的重組DNA技術構建根據本發明的抗獨特型嵌合抗體，更具體地，使用例如Morrison等人在Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A, 81， 6851-55 (1984)中所描述的嵌合抗體構建技術，其中使用重組DNA技術用相對應的人免疫球蛋白區域替換來源于非人哺乳動物的抗體的輕鏈的恒定區和/或重鏈的恒定區。這種抗體以及它們的制備方法也可見于例如專利 ^開出版物EP 173 494， Neuberger, M. S等
人Nature 312 (5995): 604-8 (1985)的文獻，以及專利文獻EP 125 023中的描述。
鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2分別編碼由鼠科動物雜交瘤細胞14C12產生的抗體的每條輕鏈的可變區和每條重鏈的可變區，自2002年6月30日從比利時微生物協作保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)(BCCM) ， LMBP (plasmid collection, Laboratorium voor Moleculaire Biologie, Universiteit， K,L. Ledeganckstraat 35, 9000 Gent， Belgium)可獲得該雜交瘤，保藏號為LMBP 5878CB。克隆14C12已在文獻WO 2004/014955中描述。選擇鼠科動物抗體14C12的序列以編碼根據本發明的抗體的可變區，或編碼具有與這些序列至少70%,有利地至少80%,更有利地至少90%或至少99%的一致性的衍生序列，這是由于鼠科動物抗體14C12的可變區具有大量的優點，見于文獻WO 2004/014955的描述。鼠科動物抗體14C12的第一個優點是其結合針對FVIII的C2結構域的抑制性抗體，抗體B02C11的能力，抗體B02C11是對FVIII具有特異性的人單克隆抗體，其來源于發生抑制因子的患者的天然庫(Jacquemin et al. (1998), 5/oo<i ": 496-506 ),以及以劑量依賴形式抑制循環抑制性抗體與其靶目標，FVIII的C2結構域的結合的能力。在文獻WO 01/04269中描述了 B02C11抗體的輕鏈和重鏈可變區的核苷酸和肽序列。而且，鼠科動物抗體14C12具有以劑量依賴形式中和B02C11抗體的抑制特性的能力。而且還顯示出，用抑制多克隆FVIII的抗體觀察，抗體抑制鼠科動物抗體14C12在體外中和FVIII 抑制活性的60%。用來源于不同于產生B02C11克隆的患者的其他患者的多克隆抗體觀察，鼠科動物抗體14C12在體外還顯著地中和FVIII抑制活性，這顯示鼠科動物抗體14C12識別通常表達于針對FVIII的C2結構域的人抗體之上的抗原決定簇。關于鼠科動物抗體14C12的體內特性，在注射了重組人FVIII和抑制性抗體B02C11的FVIII -/- C57B1/6小鼠中顯示，鼠科動物抗體14C12以劑量依賴形式中和B02C11抗體的抑制特性，因此一驗證了鼠科動物抗體14C12在治療發生了針對FVIII C2結構域的抑制因子的A型血友病患者中的用途。而且，鼠科動物抗體14C12與
B02C11抗體以高親和力結合，其k。n(開)和k。ff(關)值分別為105 M" s"和 l(T5 s人而且顯示出，鼠科動物抗體14C12的重鏈可變部分既包括由13 個一致或同源的氨基酸構成的C2結構域的內部圖象，還包括幾個對于 B02C11可變區的接觸殘基。最后，顯示出鼠科動物抗體14C12不抑制 FVIII與vWF或PL的結合。因此，將鼠科動物抗體14C12給藥于發生有針對FVIII的C2結構域的抑制性抗體的A型血友病患者不引起對FVIII 功能特性的不良抑制。有利地，根據本發明的抗獨特型單克隆抗體具有與14C12抗體可變區有關的所有優點。
根據本發明的抗體還具有屬于非鼠科動物種的輕鏈和重鏈的恒定區。基于該點考慮，可以使用非鼠科哺乳動物的所有科和種，特別是，例如，人、猴、鼠科動物(muridae)(小鼠除外)、豬科、牛科、馬科、貓科、犬科，還有鳥類，該列舉是非窮盡性的。
優選地，本發明抗獨特型抗體每一輕鏈的可變區由鼠科動物核苷酸 SEQ ID NO: 1編碼，其每一重鏈可變區由鼠科動物核苷酸SEQ ID NO: 2 編碼，其輕鏈和重鏈的恒定區是來源于非鼠科動物種的恒定區。
有利地，通過細胞以抗體組合物的形式生產根據本發明的抗獨特型單克隆抗體，出現在抗體的Fc區糖基化位點上的聚糖結構的海藻糖水平 /半乳糖水平比率小于或等于0.6。 "Fc區糖基化位點"是指天冬酰胺297 (Asn 297, Kabat編碼)，其帶有N-糖基化位點。事實上，抗體Fc恒定區由2個命名為CH2和CH3的球形結構域組成。2個重鏈在CH3結構域的水平面上緊密作用，而在CH2結構域的水平面上，在2條鏈中的每條鏈上與Asn 297結合的雙角型N-聚糖(biante皿a-type N-glycan)的存在使2個結構域分離。因此，在本發明的實踐中，由抗體組合物上存在的所有糖基化位點攜帶的聚糖結構具有小于或等于0.6的海藻糖水平/半乳糖水平比率，在專利申請FR03 12229中顯示，這對于抗體獲得強力的 ADCC活性(抗體依賴性細胞介導的細胞毒)是最佳的。根據本發明的抗獨特型抗體對于通過其Fc區激活細胞毒效應細胞的Fc受體，特別是 FcyRIIIA受體(也稱為CD16),其為激活細胞毒效應細胞的受體具有升高的激活能力的特點和優勢。能夠被根據本發明的抗獨特型單克隆抗體
激活的效應細胞是，例如NK (天然殺傷)細胞、巨p盆細胞、嗜中性粒細胞、CD8淋巴細胞、Ty5淋巴細胞、NKT細胞、嗜酸性細胞、嗜石咸細胞或肥大細胞。優選地，根據本發明的抗獨特型抗體能夠召集NK細胞。已顯示根據本發明的抗獨特型單克隆抗體為細胞毒性的。其可以經其Fc 區召集效應細胞，效應細胞消滅在表面攜帶有根據本發明的抗獨特型抗體耙目標的細胞。
細胞，該細胞是分泌FVIII抑制抗體的淋巴細胞的前體，特別是記憶性B 細胞。
優選地，耙細胞是記憶性B細月包。
因此，根據本發明的抗獨特型單克隆抗體在一方面通過與FVIII抑制性抗體的獨特位(idiotope)結合將抑制所述FVIII抑制性抗體的結合，在另一方面，引起在表面表達有靶抑制性抗體的記憶性B細胞和分泌所述抑制性抗體的淋巴細胞的前體細胞的裂解，這兩個效應參與了降低由血友病患者產生的FVIII抑制性抗體的抑制效應。
優選地，本發明的抗獨特型抗體所針對的抗FVIII抑制性抗體為 B02C11抗體。該抗體為對來源于具有抑制因子的A型血友病患者天然庫的FVIII具有特異性的人IgG4K單克隆抗體(Jacquemin MG等(1998) Blood 92: 496-506 )。 B02C11抗體識別C2結構域，并抑制FVIII與vWF 以及磷脂(PL)的結合，該作用機制是在具有FVIIIC2結構域特異性的抑制性抗體的患者中最為常見的。而且，通過Fab片段和C2結構域的晶體的X光分析已鑒定了 B02C11抗體與C2結構域的精確結合位點 (Spiegel PC等(2001) Blood 98:13-19 )。在自2000年的文獻WO 01/04269 中描述了 B02C11抗體的重鏈和輕鏈可變區的氨基酸和核苷酸序列。
因此，根據本發明的抗獨特型抗體識別循環的B02C11抗體，以及位于B02C11記憶性B細胞克隆表面的膜表面抗體B02C11 (BCR)。根據本發明的抗獨特型抗體因此在一方面通過結合而中和了循環中的抗體，在另一方面結合膜表面免疫球蛋白，之后通過細胞毒細胞的Fc受體在根據本發明的抗體Fc區和這些細胞毒細胞之間進行結合。根據本發明
的抗體因此參與了在表面表達免疫球蛋白B02C11的記憶性B細胞的裂解。
優選地，根據本發明的抗獨特型抗體的每一輕鏈和每一重鏈的恒定區為人恒定區。本發明的該優選實施方案可以減少抗體在人體內的免疫原性，由此更加提高其在對人的給藥治療過程中的效率。
在本發明的一個優選實施方案中，根據本發明的抗體的每一輕鏈的恒定區為k (kappa)型。任何的同種異型都適宜于實施本發明，例如， Km(l)、 Km(1,2)、 Km(l, 2, 3)或(3)，但是優選的同種異型是Km (3)。
在另一個補充的實施方案中，根據本發明的抗體的每一輕鏈的恒定區為x(lambda)型。
在本發明的一個具體方面，特別是當根據本發明的抗體的每一輕鏈和每一重鏈的恒定區為人的恒定區時，抗體的每一重鏈的恒定區為y
(gamma)型。根據這些變異，抗體的每一重鏈的恒定區可以是yl、或丫3 型，這三個恒定區類型具有結合人補體的特點，或者還可以是y4型。具有每條y型重鏈的恒定區的抗體屬于IgG類。G型免疫球蛋白(IgG)是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的異質性二聚體，彼此以二硫鍵連接。每條
鏈由重排的V-J基因編碼，重鏈由重排的V-D-J基因編碼)組成，在C 端位置，由恒定區組成，輕鏈的恒定區由一個CL結構域組成，重鏈由3 個結構域(CH1、 CH2和CH3)組成。可變結構域和重鏈及輕^漣的和CL結構域的組合形成了 Fab區，其通過非常有彈性的鉸鏈區與Fc連接，鉸鏈區使每一Fab與耙抗原結合，而介導抗體效應特性的Fc區容易接近效應分子，例如FcyR受體和Clq。由2個球形結構域CH2和CH3 組成的Fc區在2條鏈中每條鏈上都存在與Asn 297結合的雙角型N-聚糖的情況下，在CH2結構域的水平面上被糖基化。
優選地，抗體的每一重鏈的恒定區為yl型，因為這種抗體在最大量的個體(人)中顯示出產生ADCC活性的能力。基于該點考慮，任何的同種異型都適宜于實施本發明，例如Glm(3)、 Glm(1,2,17)、 Glm(l, 17) 或Glm(1,3)。優選地，同種異型為Glm(l， 17)。
在本發明的一個具體方面，抗體的每一重鏈的恒定區為yl型，并由
與人核苷酸序列SEQ ID NO: 3具有至少70%的一致性的核苷酸序列編碼，其每一輕鏈的恒定區由與人核苷酸序列SEQIDNO:4具有至少70% 的一致性的核苷酸序列編碼。
有利地，上述序列的一致性至少為80%，特別有利地至少為90%或 99%，序列修正不改變根據本發明的抗體的功能特性。
優選地，根據本發明的抗體的每一重鏈的恒定區為yl型，并由人核苷酸序列SEQIDNO:3編碼，其每一輕鏈的恒定區由人核香酸序列SEQ ID NO:4編碼。
因此，這樣的抗體具有鼠科動物的可變區和人的恒定區，重鏈為yl 型。該抗體因此屬于人IgGl亞型。該抗體具有兩條輕鏈和兩條重鏈，其輕鏈的可變區由鼠科動物核苦酸序列SEQIDNO: 1編碼，人恒定區由核苷酸序列SEQ ID NO: 4編碼，其重鏈的可變區由鼠科動物核苷酸序列 SEQ ID NO: 2編碼，恒定區由人核香酸序列SEQ ID NO: 3編碼。
在本發明的另一方面，根據本發明的抗體的每一輕鏈由與鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO:5具有至少70%—致性的序列編碼，每一重鏈由與鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO:6具有至少70%— 致性的序列編碼。在一個特別有利的模式中，序列一致性至少為80%, 更有利地至少為90%或至少99%，序列^f正既不改變抗體的特性也不改變其功能。
優選地，根據本發明的抗體的每一輕鏈由鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQIDNO:5編碼，每一重鏈由鼠科動物-人嵌合性核香酸序列SEQ ID NO:6編碼。
通過融合編碼抗體每條輕鏈可變區的鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO:l和編碼抗體每條輕鏈恒定區的人核苷酸序列SEQ ID NO:4而獲得編碼抗體每條輕鏈的鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQIDNO:5。通過融合編碼抗體每條重鏈可變區的鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO:2和編碼抗體每條重鏈恒定區的人核苷酸序列SEQ ID NO:3而獲得編碼抗體每條重鏈的鼠科動物-人嵌合性核苦酸序列SEQ IDNO:6。有利地，根據本發明的抗體的每條輕鏈具有與肽序列SEQ ID NO: 7至少70%—致性的肽序列，根據本發明的抗體的每條重鏈具有與肽序列SEQ ID NO: 8至少70% 一致性的肽序列。在特別有利的方式中，序列之間的一致性至少為80%、 90%,或還可以是95%或99%,序列纟l"正既不改變抗體的特性也不改變其功能。
優選地，根據本發明的抗體的每條輕鏈的肽序列為肽序列SEQ ID NO: 7,根據本發明的抗體的每條重鏈的肽序列為肽序列SEQ ID NO: 8。
因此，當抗體的每條輕鏈由鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO:5編碼，每條重鏈由鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO:6編碼，根據核苷S臾序列SEQ ID NO:5推導出的每條輕鏈的肽序列為肽序列 SEQ ID NO: 7,根據核苷酸序列SEQ ID NO:6推導出的每條重鏈的肽序列為肽序列SEQ ID NO: 8 。
可以由任何細胞系生產根據本發明的抗體，更具體地，由生產對CD16 具有強親和力的抗體的細胞系生產。
在特別有利的方式中，本發明的抗體由鼠骨髓瘤細胞系生產。由于將其某些特性賦予給了抗體，生產根據本發明的抗體的細胞系是一個重要的特性。事實上，抗體表達的手段是在翻譯后修飾開始，特別是糖基化修飾，其對于一個細胞系和另一個細胞系可以有差別，因此使得盡管具有相同一級結構的抗體卻具有不同的功能特性。
在一個優選的實施方案中，由鼠骨髓瘤細胞YB2/0 (細胞 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20，保藏于美國典型培養物保藏中心，保藏號 ATCC CRL-1662 )生產抗體。由于該細胞系能夠生產較例如由CHO細胞產生的具有相同一級結構的抗體有更高ADCC活性的抗體，以及由于沒有內源性免疫球蛋白產生，而選擇該細胞系。因此，根據本發明在YB2/0 細胞系中產生的抗體，通過其Fc區，激活細胞毒細胞的Fc受體的能力，顯示出比由其他細胞系產生的具有相同一級結構的抗體更高。而且，該細胞系具有產生具有抗體組合物形式的抗體的特點和優勢，在抗體Fc區的糖基化位點存在的聚糖結構的海藻糖水平/半乳糖水平比例，小于或等于0.6。
有利地，可由在2005年10月25日保藏于法國微生物保藏中心 (Collection Nationale de Culture des Microorganismes)(CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15),保藏號為1-3510的克隆R565產生根據本發明的抗體。
有利地，根據本發明的抗體為抗體EMAB565,其由克隆R565產生。抗體EMAB565的每一輕鏈由鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO:5編碼，其每一重鏈由鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO:6 編碼。嵌合性抗體與鼠科動物抗體14C12竟爭結合FVIII，并且具有遠高于鼠科動物14C12的增高的細胞毒活性，這可部分歸因于這些抗體重鏈的N-聚糖的特定糖基化。事實上，克隆R565具有產生海藻糖水平/半乳糖水平比例小于0.6的EMAB565抗體組合物的特點，這在專利申請FR 03 12229中已進行了描述，其對于賦予抗體高ADCC活性是最佳的。該抗體因此特別有助于作為治療工具治療所要靶向的表達FVin抑制性抗體的病理細月包。
本發明還包括具有與EMAB565抗體基本相同的特性的任何單克隆抗體。
本發明的另一主題涉及到根據本發明的抗體輕鏈的表達載體。該載體為能夠使根據本發明的抗體表達的載體，該抗體輕鏈由核苷酸序列 SEQIDNO:5編碼，由核苷酸序列推導出的肽序列為序列SEQ ID NO: 7。該載體為核苷酸分子，其中插入有編碼抗體每一輕鏈可變結構域的鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO: 1和編碼抗體每一輕鏈恒定區的核苷酸序列 SEQ ID NO: 4,以將它們轉導入并保持在宿主細胞中。這使得這些外源核苷酸片段能在具有選擇和表達所不可缺少的序列(啟動子、多聚腺普酸序列、選擇基因)時得以在宿主中表達。這樣的載體對于本領域技術人員是已知的，其可以為腺病毒、逆轉錄病毒、質粒或噬菌體，這些列舉是非限制性的。此外，任何哺乳動物細胞都可以用作宿主細胞，即作為表達根據本發明的抗體的細胞，例如YB2/0、 CHO、 CHO dhfr ( 二氫葉酸還原酶缺陷型)-(例如CHODXBll、 CHODG44)、 CHOLecl3、 SP2/0、 NSO、 293、 BHK或COS。
本發明的另一目的涉及根據本發明抗體重鏈的表達載體。該載體為
允許根據本發明的抗體表達的載體，該抗體重鏈由核苷酸序列SEQ ID NO:6編碼，由核苷酸序列推導出的肽序列為序列SEQIDNO: 8。該載體為核香酸分子，其中插入有編碼抗體每一重鏈可變結構域的鼠科動物核苷酸序列SEQ IDNO: 2和編碼抗體每一重鏈恒定區的人核苷酸序列SEQ ID NO: 3,以將它們轉導入并保持在宿主細胞中。這使得這些外源核苷酸片段能在具有表達所不可缺少的序列(啟動子、多聚腺苷酸序列、選擇基因)時得以在宿主中表達。正如前所述，這樣的載體例如可以為質粒、腺病毒、逆轉錄病毒、噬菌體，宿主細胞可以是任何哺乳動物細胞，例如YB2/0、 CHO、 CHOdhfr-(CHODXBll、 CHO DG44 )、 CHOLecl3、 SP2/0、 NSO、 293、 BHK或COS。
通過克隆R565 (保藏于CNCM,保藏號為1-3510 )產生的EMAB565 抗體對在細胞YB2/0中由重鏈和輕鏈的表達載體共表達而產生的抗體進行說明。在存在有人NK細胞時，該抗體介導的細胞毒性遠高于鼠科動物抗體14C12介導的細胞毒性。而且EMAB565抗體比鼠科動物抗體 14C12介導Jurkat-CD16細胞分泌更多的IL-2 (白細胞介素-2)。因此， EMAB565抗體，其可以在允許載體表達的前述條件下由克隆R565在培養介質中的培養產生，是能夠促進涉及B02C11的疾病，更具體地為A 型血友病的治療和診斷，以及該領域研究的最有用工具之一。
本發明另一具體主題是表達根據本發明的抗體的穩定細胞系。有利地，表達根據本發明的抗體的穩定細胞系選自由下列細胞組成的組SP2/0、 YB2/0、 IR983F、諸如那馬瓦(Namalwa)細胞的人骨髓瘤細胞，或者人源的其他細胞，例如PER.C6、 CHO細胞系，特別是 CHO-K-l、 CHO-Lec10、 CHO-Lecl、 CHO-Lecl3、 CHOPro-5、 CHOdhfr-(CHO DX Bll、 CHO DG44)，或者選自Wil-2、 Jurkat、 Vero、 Molt-4、 COS-7、 293國HEK、 BHK、 K6H6、 NSO、 SP2/0畫Ag 14和P3X63Ag8.653 的其他細胞系。優選地，使用的細胞系為鼠骨髓瘤細胞YB2/0。選擇該細胞系是因為其能夠產生比具有相同一級結構的由例如CHO產生的抗體有更高ADCC活性的抗體。
在本發明的一個具體方面，表達根據本發明的抗體的穩定細胞系，更具體地選自上述組的細;^包系，如前所述，將重《連和輕鏈的兩種表達栽體整合在一起。
本發明的一個具體方面涉及保藏號為1-3510,保藏在法國微生物保藏中心(CNCM)的克隆R565。
本發明還涉及產生具有與由前述R565細胞系產生的EMAB565抗體反應性實質相似的反應性的單克隆抗體。
本發明的另一具體主題涉及與針對人FVin的C2結構域的抗體相結合，并由克隆R565所產生的抗獨特型單克隆抗體。
本發明的另一目的涉及編碼根據本發明的抗體的重鏈的序列SEQID NO: 6的DNA片革殳。鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO:6編碼抗體的每一重鏈。它通過將編碼抗體每一重鏈可變區的鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO:2與編碼抗體每一重鏈恒定區的人核香酸序列SEQ ID NO:3融合在一起而獲得。
本發明的另一目的涉及編碼根據本發明的抗體的輕鏈的序列SEQ ID NO: 5的DNA片段。鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO:5編碼抗體的每一輕鏈。它通過將編碼抗體每一輕鏈可變區的鼠科動物核香酸序列SEQ ID NO:l與編碼抗體每一輕鏈恒定區的人核苷酸序列SEQ ID NO:4融合在一起而獲得。
本發明的另一目的是一種有利地為單克隆、抗獨特型的、針對人 FVIII抑制性抗體的抗體，在通過所述抗獨特型抗體的Fc區在體內或體外召集細胞毒免疫細胞中的應用。所述應用可以通過使用針對FVIII任意結構域的任意細胞毒性抗獨特型抗體實施。這些細胞毒性抗獨特型抗體將激活FcyRIII受體，特別是細胞毒免疫細胞的FcyRIIIA受體。有利地，所使用的抗體是如前所述的根據本發明的抗體，在一個特別有利的方式中，所述抗體為EMAB565抗體。
本發明的抗體具有通過其Fc區激活FcyRIIIA受體的能力。這帶來了非常大的益處，因為該受體表達在稱為"效應細胞"的細胞表面抗體的 Fc區與由效應細胞攜帶的Fc受體的結合引起效應細胞FcyRIIIA的激活，以及耙細胞的消滅。所述效應細胞為，例如NK (天然殺傷)細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞、CD8淋巴細胞、Ty5淋巴細胞、NKT細胞、嗜酸性細胞、嗜》咸細胞或肥大細胞。
有利地，這種應用的實施可以用于在體內或體外消滅FVIII的分泌抑制性抗體的漿細胞的前體細胞，在所述前體細胞表面表達有FVIII的抑制性抗體。優選地，這些細胞為B細胞，特別是記憶性B細胞。有利地，該抑制性抗體針對FVIII的C2結構域。
B淋巴細胞在其表面表達抗原的受體(BCR即"B細胞受體，，)，其由與其他蛋白相連的膜表面免疫球蛋白組成。每一 B淋巴細胞只合成一單一種類的膜表面免疫球蛋白，其可變區與分泌型的抗體的可變區相同。 B淋巴細胞通過其BCR直接識別抗原。通過BCR的抗原結合，如果伴有其他重要的信號，可以激發所述B淋巴細胞的增殖，通過這種淋巴細胞的增殖引起了克隆的形成。產生于有絲分裂的一些B淋巴細胞分化成分泌循環抗體的漿細胞，其余的細胞形成記憶性B淋巴細胞，其在此第一次反應末沒有活性。
罹患A型血友病(特別是嚴重的A型血友病)的患者具有非常少的內源FVIII或者沒有，即該蛋白對于其機體是外源的，并且所給藥的FVIII 在其第一次給藥或隨后的給藥期間可以激發免疫反應。在所給藥的FVIII 和在B淋巴細胞上所表達的BCR之間的結合，如果具有充分的親和性，可以激活B淋巴細胞，導致漿細胞分泌可溶性的抗FVIII抗體，以及形成在表面表達對FVIII具有特異性的BCR的記憶性B '淋巴細胞。在與 FVIII發生新的接觸的情況下，這些記憶性B淋巴細胞增殖以增加具有相同特異性的記憶性B淋巴細胞的數量，并分化成分泌具有高親和性的抗 FVIII抗體的漿細胞。
由記憶性B淋巴細胞產生的反應比原生B淋巴細胞產生的反應強烈，這些記憶細胞數量更大，并具有比其起源的淋巴細胞更高親和性的BCR。而且，其從記憶細胞分化成漿細胞比具有相同特異性的原始細胞更快速。
由于其針對特定抗原的特異性，膜免疫球蛋白成為B淋巴細胞的一個鮮明特點。具有抗FVIII BCR以及產生分泌FVIII抑制性抗體的漿細胞
的B淋巴細胞因而可以通過抗體與免疫球蛋白中與抗FVIII抗體具有特異性的部分結合而被靶向。因此，根據本發明的抗體識別膜免疫球蛋白，并且通過其Fc區召集細胞毒免疫細胞，負責裂解在表面表達BCR的細胞。
更具體地，這種應用的實施可以用于在體內或體外消滅在表面表達有BCR的記憶性B細胞，所述BCR具有B02C11抗體輕鏈的可變區(VL) 和重鏈的可變區(VH)。通過抗體依賴的細胞消除機制，特別是ADCC 使這種消滅發生。
本發明另一具體主題是根據本發明的抗體在作為藥物中的應用。有利地，這樣的藥物-欲用于治療產生FVIII抑制性抗體的疾病。
本發明的另一目的是根據本發明的抗體在制備藥物中的應用。
基于該點，本發明的另一目的是根據本發明的抗體在制備用于治療A 型血友病的藥物中的應用。出于本發明的目的，應當理解"用于治療A型血友病，，的表述等同于"欲用于A型血友病的治療，，的表述。
有利地，被治療的A型血友病是具有抑制因子的A型血友病。
根據本發明的抗獨特型抗體可以與FVIII同時給藥于病人，其既可以在同一藥劑中，也可以在兩個分開的藥劑中但是伴隨給藥。
最后，本發明的最后一個目的涉及含有根據本發明的抗體和一種或多種賦形劑和/或制藥學上可接受的載體的藥物組合物。賦形劑可以是與藥物應用相容的并且本領域技術人員已知的任何溶液，例如鹽溶液、生理溶液、等滲溶液性、緩沖溶液等，以及任何的懸浮液、凝膠、粉末等。根據本發明的組合物可以進一步包括選自分散劑、增溶劑、穩定劑、表面活性劑、防腐劑等的一種或多種藥劑或載體。在另一方面，根據本發明的組合物可以包括其他的藥劑或活性組分。
而且，可以以不同的途徑和不同的形式給藥所述組合物。可以通過用于這種類型的治療方法的任何標準途徑進行所述給藥，例如尤其是通過全身途徑，尤其是通過靜脈內、皮內、腫瘤內、皮下、腹膜內、肌肉內、動脈內注射等。例如可以是所述的肺瘤內注射，或者注射入胂瘤的鄰近部位，或沖洗肺瘤。
劑量可以作為給藥的次數、與其他活性組分的結合、病理發展階段等的函數而變化。

圖1:在存在有NK細胞時，由EMAB565抗體(在圖中標示為14C12 CH)介導的B02C11的裂解。
圖2:在存在有B02C11和EMAB565抗體(在圖中標示為14C12 CH) 時，由Jurkat CD 16細胞對IL2的分泌。
圖3:由EMAB565抗體(在圖中標示為14C12 CH)介導的B02C11 的BCR的成帽(Capping )。
圖4:由EMAB565抗體(在圖中標示為14C12CH)介導的B02C11 的調亡。
圖5:在補體存在時,由EMAB565抗體(在圖中標示為14C12 CH) 介導的B02C11的裂解。
具體實施例方式
實施例1:抗-Id FVIIIEMAB565嵌合性抗體表達載體的構建
A.確定鼠科動物抗體14C12可變區的前導序列
分離產生IgG2a， k型免疫球蛋白的鼠科動物雜交瘤14C12的總 RNA。反轉錄后，用5，RACE技術(區apid Amplification of &DNA gnds (cDNA末端的快速擴增))(GeneRacer試劑盒，Invitrogen產品號 L1500-01 )擴增抗體的輕鏈(Vk)和重鏈(VH)的可變區。
簡言之，首先用位于鼠科動物恒定區Ck或G1的5'區的引物進行第一反轉錄階段。之后，將多聚dC序列加至合成的cDNA的3'端，之后使用識別多聚dC序列的5'引物和3，引物擴增Vk和VH區，所述3，引物位于鼠科動物恒定區Ck或Gl的反轉錄引物的5'端。用于這兩個階段的引物如下所述
1.反轉錄引物
a.鼠科動物k特異性反義引物(SEQ ID NO: 19 )5' - ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC畫3 ' b.鼠科動物G2a特異性反義引物(SEQIDNO:20) 5'- CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3' 2. 5'RACEPCR引物
a. 鼠科動物k特異性反義引物(SEQ ID NO: 21 )
5 ' - TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3 '
b. 鼠科動物G2a特異性反義引物(SEQ ID NO: 22)
5'- GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG -3' 將獲得的PCR產物VH和Vk克隆入pCR4Blunt-TOPO載體(Zero blunt TOPOPCR克隆試劑盒，Invitrogen,產品編號K2875-20)并測序。
鼠科動物抗體14C12的Vk區的核苷酸序列由序列SEQ ID NO: 1表示，推導出的肽序列為序列SEQ ID NO: 9。 Vk基因屬于Vk23亞型 [Almagro JC等Immunogenetics (1998), 47: 355-363〗。鼠科動物抗體14C12 的Vk區的CDRl 、 CDR2和CDR3序列，根據Kabat編碼方式[Kabat等人,"Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242(1991)]所定義，分別由以下序列表示SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15。鼠牙牛動物抗體14C12的Vk區的CDR1-IMGT, CDR2-IMGT和CDR3-IMGT序歹'J ，根據IMGT ( international ImMunoGeneTics database)(國際免疫遺傳數據庫)分析[Lefranc, M,P.等人，Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 ( 2003 )]所定義，分別由下列序列表示SEQ ID NO: 27， SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 29。與只根據序列變異分析的Kabat定義不同，該定義考慮并結合了超變環的特點[Chothia C. 和LeskA.M. J. Mol. Biol. 196: 901-17( 1987 )]和抗體的結晶學結構分析。 14C12的VH區的核苷酸序列為序列SEQ ID NO: 2，其推導的肽序列為序列SEQIDNO: 10。VH基因屬于VH1亞型[HonjoT.和MatsudaF. "Immunoglobulin genes". Honjo T.和 Alt F.W.編輯,Academic Press, London (1996), pp 145-171]。鼠科動物抗體14C12的VH區的CDRl 、 CDR2 和CDR3序列，根據Kabat編碼方式[Kabat等人，"Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)]所定義，分別由
以下序列表示SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18。鼠科動物抗體14C12的VH區的CDR1-IMGT, CDR2-IMGT和CDR3-IMGT 序列,才艮才居IMGT (international ImMunoGeneTics database)分才斤[Lefranc, M,P.等人，Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 ( 2003 )]所定義，分別由下列序列表示SEQIDNO:30, SEQ ID NO: 31和SEQ ID NO: 32。與只根據序列變異分析的Kabat定義不同，該定義考慮并結合了超變環的特點 [Chothia C.和Lesk A.M. J. Mol. Biol. 196: 901-17 ( 1987)]和抗體的結晶學結構分析。
B.嵌合性抗體EMAB565的重鏈和輕鏈表達載體的構建
1. k輕鏈載體
使用以下的克隆引物擴增被克隆入測序載體pCR4Blunt-TOPO中的 Vk序列
(a)VK正義引物(SEQIDNO:23)
5'- GTATACTAGTGCCGCCACdGGTTTTCACACCTCAGAT -3' 被劃線的序列對應于Spel限制性酶切位點，粗體字體的序列對應于 Kozak —致序列，ATG起始子為斜體。
(b ) Vk反義引物(SEQ ID NO: 24 )
5畫TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCGZTmr7TCC^C
該引物產生鼠科動物Vk序列(斜體)和人恒定區(Ck)(粗體)的連4妄點。纟皮劃線的序列對應于DraIII限制性酶切位點。
獲得的Vk的PCR產物包括編碼鼠科動物抗體14C12的天然信號肽的序列。Vk的PCR產物之后被克隆入人Ck恒定區5'端處的輕鏈嵌合載體Spe I和Dm III位點之間，所述人Ck恒定區的核苷酸序列為SEQ ID NO: 4,推導出的肽序列為SEQ IDNO: 12。已通過沉默突變修正了該嵌合載體的人Ck序列以制造出Dra III限制性酶切位點以克隆鼠科動物Vk序列。該嵌合載體含有本領域技術人員已知的啟動子，例如CMV或RSV 和HGH (人生長激素)多聚腺苷酸序列以及dhfr ( 二氫葉酸還原酶)選擇基因。
為表達EMAB565抗體，嵌合載體的啟動子之后被人EF-la啟動子取代。
由該載體編碼的嵌合抗體EMAB565的輕鏈序列的核苷酸序列由 SEQIDNO:5表示，其對應的推導出的肽序列為SEQIDNO:7。 2.重鏈載體
使用近似的方法進行EMAB565抗體重鏈的嵌合。使用以下的克隆引物首先擴增被克隆入pCR4Blunt-TOPO載體中的VH序列
(a) VH正義引物(SEQIDNO:25)
5'畫CTATTACTAGTGCCGCCACC4rGGAATGGAGTTGGATATTT
-3，
被劃線的序列對應于Spel限制性酶切位點，粗體字體的序列對應于 Kozak —致序列，ATG起始子為斜體。
(b) VH反義引物(SEQ ID NO: 26 )
<formula>formula see original document page 23</formula>
該引物產生鼠科動物VH序列(斜體)和人G1恒定區(粗體)的連接點。
被劃線的序列對應于Apa I限制性酶切位點。
擴增出的VH片段包括編碼鼠科動物抗體14C12的天然信號肽的序列。VH的PCR產物之后被克隆入人恒定區5'端處的重鏈嵌合載體Spe I和ApaIIII位點之間，所述人y1恒定區的核普酸序列為SEQIDNO:3，推導出的肽序列為SEQIDNO: 11。該嵌合載體含有本領域技術人員已知的啟動子，例如CMV或RSV和bGH (牛生長激素)多聚腺苷酸序列以及neo (新霉素耐藥)選擇基因。
為表達EMAB565抗體，嵌合載體的啟動子之后被人EF-la啟動子取代。
由該載體編碼的嵌合抗體EMAB565的重鏈序列由SEQ ID NO: 6提供核苷酸序列，其對應的推導出的肽序列為SEQ ID NO: 8。
實施例2:建立產FVIII抗抑制性嵌合抗體EMAB565的衍生于細胞系YB2/0的細胞系
在含5%胎牛血清(FCS )( JRH Biosciences,產品編號12107 )的EMS 培養基(Invitrogen，產品編號041-95181M)中培養大鼠細胞系YB2/0 (ATCC#CRL-1662)。 5百萬細胞在Optimix培養基(Equibio,產品編號EKITE 1 )中，用25^ig的Aat II線性化輕鏈載體及27嗎的Sca-I線性化重鏈載體進行電穿孔(Biorad電穿孔儀，1652077型)轉染。所應用的電穿孔條件為每0.5 ml試管230伏和960微法拉。之后每一電穿孔小杯以5000個細胞/孔的密度分布于5塊96孔板中。
在轉染后第3天導入含5%透析過的血清(Invitrogen,產品編號 10603-017 ), 500 pg/ml的遺傳霉素G418 (Invitrogen,產品編號 10131-027)和25nM的氨曱蝶呤(Sigma,產品編號M8407)的RPMI 選捧性培養基(Invitrogen,產品編號21875-034 )中。
通過ELISA方法在抗性轉染孔的上清液中篩選對人免疫球蛋白(Ig) 序列有特異性的嵌合免疫球蛋白的存在。
將產生最多抗體的10個轉染子在24孔板中擴增，通過ELISA重新分析其上清液以評估其生產力，并選擇最好的3個生產者通過有限稀釋 (40孔/板)用于克隆。
在克隆結束時，選擇此后稱為"R565"的克隆R565用于生產嵌合抗體EMAB565,并漸進調整以適應CD雜交瘤生產培養基(Invitrogen,產品編號11279-023 )。
通過在CD雜交瘤培養基中擴充適應的培養物進行嵌合性抗體 EMAB565的生產，其是通過在75 cn^和175 cm2的燒瓶中稀釋至3xl05 個細胞/ml,之后在滾動細胞培養瓶中稀釋至4.5xl()S個細胞/ml而獲得的。在達到最大體積時(11)，繼續進行培養細胞存活率達到20%。生產之后，通過蛋白A親和層析(經HPLC估計純度< 95 %)純化嵌合抗體EMAB565,并通過聚丙烯酰胺凝力交電泳進行;險測。
并且顯示出約7%的海藻糖含量，約52%的半乳糖含量，以及0.133的
海藻糖/半乳糖比。
實施例3:在人NK細胞存在時，由EMAB565抗體介導的B02C11
裂解
ADCC技術
使用Myltenyi的磁激活細胞分離(MACS)技術從PBMCs (外周血單核細胞)中分離NK細胞。沖洗NK細胞并重懸于IMDM (Iscove's 改進的Dubelcco's培養基)+ 5% FCS (45xl05個細胞/ml)。以15/1的比例使用效應細胞和耙細胞。將耙細胞B02C11在IMDM + 5% FCS中調整至3xl()5個細胞/ml。在IMDM + 5% FCS中將抗體稀釋(終濃度500; 50; 5; 0.5; 0.005和0.005 ng/ml )。
反應混合物在96孔微孔板中包括50 (il的抗體，50 (il的效應細胞， 50 pi的革巴細胞和50 jil的IMDM培養基。建立兩個陰性對照
無NK的裂解用IMDM + 5% FCS代替NK效應細胞。
無抗體的裂解IAc ):用IMDM + 5% FCS代替抗體。
在伴以5。/。C02的一個大氣壓下，37。C孵育16小時后，離心平4反，用特定的試劑(細胞毒性檢測試劑盒1 644 793 )評價釋放入上清液中的細月包內LDH水平。
用校正范圍評估裂解百分比，對用Tritonx100 (2%)裂解的耙細胞進行分別相當于100、 50和0%裂解的不同稀釋，以獲得所述校正范圍。
才艮據下式計算結果
%裂解=(%用抗體和NK裂解)-(%無抗體裂解)-(%無NK裂
解)
研究鼠科動物14C12和嵌合性伊曼伯林(EMABling) 14C12FVIII 抑制劑的抗獨特型抗體在NK細胞存在時裂解B02C11細胞的能力。
合抗體(EMABling Technology)介導劑量依賴性的裂解。
實施例4:在B02C11和EMAB565抗體存在時Jurkat CD16分泌 IL畫2
該實驗評估了抗體結合表達在Jurkat CD 16細胞上的CD 16受體(Fc Y RIIIa)和介導IL2分泌的能力。
根據此目的，在96孔板中混合下列物質
-50 pi的抗體溶液(在具有5% FCS的IMDM中終濃度為25、 2.5、 0.25、 0.025、 0.012嗎/ml),
國50 pl的PMA (在具有5% FCS的IMDM中稀釋成40 ng/ml )， 50 pl的在具有5% FCS的IMDM中稀釋成6 x l05/ml的B02C11細胞，以及50 (il的Jurkat CD16細胞(在具有5% FCS的IMDM中為20 xlo6/ml )。
37。C過夜孵育后，離心平板，用商業化試劑盒(來自R & D的 Quantikine)評價上清液中所含有的IL2。在450nm讀取OD值。
結果以IL-2水平表示為抗體濃度的函數。
研究FVIII抑制劑EMAB565的抗獨特型抗體在存在B02C11細胞時，介導被CD16轉染的Jurkat細胞分泌IL2的能力。圖2顯示EMAB565抗體介導了 IL-2的分泌。
實施例5:由EMAB565抗體介導的B02C11的BCR的成帽
沖洗B02C11細胞(1.2xi06個細胞/ml)，將其保存在含5。/。FCS， pH 7.4的IMDM中。與先前標記的濃度在10 ng/ml的EMAB565抗體 (ALEXA)在4。C和37。C孵育1小時、4小時和16小時。用LEICA熒光顯纟鼓鏡(x63油浸鏡頭)可見由于抗體的受體成帽。
研究不同的孵育時間，并顯示出在成帽加強出現早期(30分鐘)，并一直持續。通過示例，圖4顯示在16小時，結合B02C11的抗體呈桿狀聚集，不均勻地分布于膜表面。這顯示抗體14C12 CH與B02C11 的結合介導了膜受體的重排，并潛在地介導了轉導信號。
實施例6:由EMAB565抗體介導的B02C11凋亡
在24孔板上于1 ml的RMPI和10% FCS中在37。C孵育B02C11 細胞(2.5 x 105)與EMAB565抗體24小時，其中有交聯劑(羊F(ab2)，
抗人IgG Fey, 10嗎/ml)存在或者沒有存在。之后離心細胞，在PBS 中沖洗兩次置于試劑盒供應的緩沖液中，根據BD Biosciences的推薦，與膜聯蛋白V-異碌u氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)和硤化丙4定(PI) — 起孵育。用流式細胞儀分析細胞，凋亡細胞的百分比等于被膜聯蛋白V 標記的細胞(膜聯蛋白V和膜聯蛋白V+PI)。
圖4顯示在EMAB565抗體(EMABling技術)存在時，凋亡的誘導比沒有交聯劑存在或只有6.5%的交聯劑存在的誘導少3% (圖4)。
實施例7:在補體存在時EMAB565抗體誘導B02C11的裂解
沖洗B02C11細胞，當在IMDM培養基+ FCS 5%中被稀釋成1: IO的補體源(來自Cedarlane的幼兔補體)存在時，將細胞與不同濃度的EMAB565抗體(終濃度為0-2.5 pg/ml) —起在37。C孵育1小時。之后將細胞在1200rpm (270g)下離心兩次，每次1分鐘，棄上清。用特定試劑(細胞毒性檢測試劑盒1 644 793 )測定相當于細胞裂解的細胞內LDH釋力文入上清液中的量。
用校正范圍評估裂解百分比，對用Tritonxl00(2。/。)裂解的靶細胞進行分別相當于IOO、 50、 25和0%裂解的不同稀釋，以獲得所述校正范圍。對照包括自發釋放(只有靶細胞)。
才艮據下式計算結果
%裂解=(%用抗體和補體裂解)-(%無補體裂解) 圖5顯示了在使用最強抗體濃度時，由EMAB565抗體(EMABling 技術)介導的CDC (補體依賴細胞毒)活性最大為5%。
權利要求
1.針對抑制人VIII因子(FVIII)的抗體的抗獨特型單克隆抗體，所述抑制性抗體針對人FVIII的C2區，其特征在于，所述抑制性抗體的每一輕鏈的可變區由與鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO1具有至少70％一致性的核苷酸序列編碼，每一重鏈的可變區由與鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO2具有至少70％一致性的核苷酸序列編碼，所述抑制性抗體的輕鏈和重鏈的恒定區為來源于非鼠科動物種的恒定區。
2. 根據權利要求1所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一輕鏈的可變區由鼠科動物核苷酸序列SEQIDNO: 1編碼，每一重鏈的可變區由鼠科動物核苷S臾序列SEQIDNO:2編碼，其輕鏈和重鏈的恒定區為來源于非鼠科動物種的恒定區。
3. 根據權利要求1或2中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其由細胞以抗體組合物的形式產生，存在于Fc區的糖基化位點的聚糖結構的海藻糖/半乳糖水平的比例小于或等于0.6。
4. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型抗體，其特征在于，所述FVIII抑制性抗體為抗體B02C11。
5. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一輕鏈和每一重鏈的恒定區為人恒定區。
6. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一輕鏈的恒定區為k型。
7. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一重鏈的恒定區為y型。
8. 根據權利要求7所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一重^l的恒定區為yl型。
9. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一重《連的恒定區為y1型，并由與人核苷酸序列SEQIDNO:3 具有至少70%—致性的序列編碼，其每一輕^l的恒定區由與人核苷酸序列SEQ ID NO: 4具有至少70%—致性的序列編碼。
10. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一重鏈的恒定區為Yl型，并由人核普酸序列SEQIDNO:3 編碼，其每一輕鏈的恒定區由人核苷酸序列SEQ ID NO: 4編碼。
11. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一輕鏈由與鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO: 5 具有至少70%—致性的核香酸序列編碼，其每一重鏈由與鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO: 6具有至少70%—致性的序列編碼。
12. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一輕鏈由鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO: 5編碼，其每一重鏈由鼠科動物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO: 6編碼。
13. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一輕鏈具有與序列SEQ ID NO: 7至少70%—致性的肽序列，其每一重鏈具有與序列SEQ ID NO: 8至少70%—致性的肽序列。
14. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其每一輕鏈的肽序列為肽序列SEQ IDNO: 7，其每一重鏈的肽序列為肽序列SEQ ID NO: 8。
15. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其由鼠雜交瘤細胞產生。
16. 根據權利要求15所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其由鼠雜交瘤細胞YB2/0 (保藏于美國典型培養物保藏中心，保藏號為 ATCC CRL-1662的細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 )產生。
17. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，其能夠由保藏于法國微生物保藏中心，保藏號為1-3510的克隆 R565產生。
18. 根據前述權利要求中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體，其特征在于，所述抗體為抗體EMAB565,其由保藏于法國孩t生物保藏中心，保藏號為1-3510的克隆R565產生。
19. 表達根據權利要求1-14中任一項所述的抗體的穩定細胞系。
20. 根據權利要求19所述的穩定細胞系，所述細胞系選自由下列細胞系組成的組SP2/0、 YB2/0、 IR983F、人骨髓瘤那馬瓦、PER.C6、 CHO 細胞系、特別是CHO畫K畫l、 CHO-LeclO、 CHO-Lecl、 CHO-Lec13、 CHO Pro-5、 CHO dhfr國、Wil-2、 Jurkat、 Vero、 Molt-4、 COS-7、 293國HEK、 BHK、 K6H6、 NSO、 SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653。
21. 保藏于法國微生物保藏中心，保藏號為1-3510的克隆R565。
22. 編碼根據權利要求1-18中任一項所述的抗體的重鏈的序列SEQ ID NO: 6的DNA片段。
23. 編碼根據權利要求1-18中任一項所述的抗體的輕鏈的序列SEQ ID NO: 5的DNA片^殳。
24. 針對人FVIII抑制性抗體的抗獨特型單克隆抗體在體外通過所述抗獨特型抗體的Fc區用于召集細胞毒免疫細胞的應用。
25. 根據權利要求24所述的應用，其特征在于，所述抗體為根據權利要求1-18中任一項所述的抗體。
26. 根據權利要求24或25中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體用于在體外消滅在表面表達有FVIII抑制性抗體的B細胞，特別是記憶性B 細月包的應用。
27. 根據權利要求24-26中任一項所述的抗體用于在體外消滅在表面表達有BCR的記憶性B細胞的應用，所述BCR具有抗體B02C11的輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)。
28. 根據權利要求24-27中任一項所述的應用，其特征在于，所述消滅機制為抗體依賴性細胞裂解機制(ADCC )。
29. 根據權利要求1-18中任一項所述抗體在制備藥物中的應用。
30. 根據權利要求1-18中任一項所述抗體在制備用于治療A型血友病的藥物中的應用。
31. 根據權利要求30所述的抗體的應用，其特征在于，所述A型血友病為具有抑制劑的A型血友病。
32. 含有根據權利要求1-18中任一項所述的抗獨特型單克隆抗體和一種或多種賦形劑和/或制藥上可接受載體的藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及靶向抑制人VIII因子的抗體的抗獨特型抗體，所述抑制性抗體靶向人VIII因子的C2區，其每一輕鏈的可變區由與鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO1具有至少70％一致性的核苷酸序列編碼，其每一重鏈的可變區由與鼠科動物核苷酸序列SEQ ID NO2具有至少70％一致性的核苷酸序列編碼，其輕鏈和重鏈的恒定區為來源于非鼠科動物種的恒定區。本發明還涉及所述抗體對激活細胞毒免疫細胞的FcγRIII受體的應用，并涉及特別用于治療A型血友病的藥物的生產。
文檔編號A61P7/04GK101351226SQ200680049924
公開日2009年1月21日申請日期2006年11月2日優先權日2005年11月2日
發明者克里斯托夫·德羅莫夫, 克里斯蒂娜·戈謝, 克里斯蒂安·貝朗申請人:Lfb生物技術公司

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