專利名稱：：免疫刺激組合物和方法
技術領域：
：本發明總地涉及產生或增強免疫應答的方法，包括對抗抗原的免疫應答，涉及用于實現該方法的組合物，以及涉及用于該方法中的修^飾免疫細胞。
背景技術：
：已經描述了針對加強宿主的免疫應答來處理特征在于缺乏免疫力或通過侵略性更大的免疫應答可解決的疾病和病癥的方法。這種方法在其中有利的示例性疾病或病癥包括癌癥、流感和人免疫缺陷病毒(HIV)。通常使用涉及外科手術、化療和放療的癌癥處理，但是這些方法缺乏腫瘤特異性，導致不利的副作用和不太滿意的臨床應答。因此，通過特異性針對目標癌細胞的應答來加強對癌癥的免疫應答而對正常細胞沒有顯著有害影響的方法將呈現出超過傳統癌癥療法的明顯優勢。存在一致的意見免疫監測在腫瘤的預防和根除中起著作用，并且T細胞介導的獲得性免疫在該過程中也起著作用。參見，例如，Pardoll,Nat.Rev.Immunol.2002,2:227-38;Rosenberg,Nature2001,411:380-84;Finn,OJ.NatRev.Immunol.2003,3:630-41。T細月包介導的免疫也在各種免疫治療方法中起作用，已經在臨床前和有限的臨床情況中顯示出功效。參見，例如，Pardoll,上文；Finn,上文；Antonia等，Curr.Opin.Immunol2004，16:130-6。通過免疫系統來耙向肺瘤，因為它們表達腫瘤相關抗原(TAA),其是突變的或超/異常表達的自體蛋白，或源自致癌病毒的蛋白質。參見，例如，Finn,上文；Antonio,上文。在生理條件下，通過樹突細胞(DC)來挑選腫瘤抗原，攜帶至外周淋巴器官，并在免疫條件下遞呈至天然T細胞，使其激活并分化成效應細胞(Teff)。然后這些細胞運輸至肺瘤位點并產生用于胂瘤根除的抗胂瘤應答。參見，例如，Spiotto等，Immunity.2002;17:737-47;Ochsenbein等，Nature2001;411:1058-64;Yu等，Nat.Immunol.2004;5:141-9)。生產性T細胞應答需要三個不同的信號信號l、2和3。通過T細胞受體(TCR)與專門的抗原遞呈細胞(APC)表面上的主要組織兼容性復合物(MHC)分子相互作用產生了信號1。通過一系列共刺激分子介導了信號2，并且對于持續的免疫應答是關鍵。通過激活的淋巴細胞和APC(如巨噬細胞和DC)精心制成的細胞因子轉導了信號3,并且對于效應免疫應答的維持是重要的。肺瘤已經產生了各種機理來規避免疫監視。這些機理包括(i)缺乏信號1,由胂瘤細胞上的MHC/肺瘤抗原生物分子復合物的無效展示，該信號轉導的缺乏或MHC類似物MIC的表達引起，抑制了表達NKG2抑制受體的自然殺傷(NK細胞)；(ii)缺乏信號2,由腫瘤細胞上缺乏共刺激分子或共抑制分子的表達引起；(iii)通過抗炎分子的分泌，腫瘤反應性T細胞中無反應力的誘導，通過凋亡的Teff細胞的物理消除或天然產生的CD4+CD25+FoxP3+T調控(Treg)細胞的誘導的腫瘤介導的免疫應答的抑制，和(iv)通過腫瘤基質的免疫力調節。積累的證據表明了這些機理中的許多可以在帶有大肺瘤負荷的患者體內同時運行。由于可以防止癌癥復發的免疫系統的特異性、安全性、功效和長期記憶的前景，包括來自目標癌癥的抗原的癌癥疫苗引起了特別的關注。一旦確定了免疫系統在保護個體對抗癌癥中起著重要作用并可以調節來根除動物模型中已有的胂瘤，投入了相當大的努力來研發治療疫苗。參見，例如，Berzofsky等，J.Clin.Invest2004,113:1515-25;Platsoucas等，AntivcancerRes.2003;23,1969-96;Finn,上文。目前的疫苗策略包括使用結合非特異性或特異性佐劑的特異性TAA,完整的腫瘤細胞裂解物，遺傳修飾來表達共刺激分子、細胞因子和/或趨化因子的腫瘤細胞，用腫瘤抗原脈沖或角腫瘤RNA或DNA轉染的DC，以及腫瘤內注射各種編碼各種免疫刺激分子的載體。這些方法有效的功效源于使用一個或幾個免疫逃避策略推進胂瘤來控制免疫應答的能力，或由于是免疫抑制機理、TAA的無效遞呈或缺乏有效的DC、Teff細月包和NK細胞的激活。發明概述本發明提供了免疫刺激組合物和方法。根據一個實施方案，本發明提供了包括(a)第一綴合物和(b)第二綴合物的組合，第一綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；第二綴合物包括(i)包括第一抗原的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員。在一個實施方案中，結合對的第一個成員可以包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，而結合對的第二個成員可以包括生物素。在另一個實施方案中，第一綴合物可以包括含有第一免疫共刺激多肽和結合對的第一個成員的融合多肽。在一個特定的實施方案中，第一免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7醫H3、B7國H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。在一個特定的實施方案中，第一抗原與感染劑相關，如人或禽流感或人免疫缺陷病毒。在另一個特定的實施方案中，第一抗原是肺瘤相關抗原。在一個實施方案中，組合物進一步包括笫三綴合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和結合對的第一個成員的綴合物成員和(ii)包括第二抗原和結合對的第二個成員的綴合物成員。在該實施方案中，第二免疫共刺激多肽與第一免疫共刺激多肽相同或不同；第二抗原與第一抗原相同或不同；第三綴合物的第一個和第二個結合對成員與第一和第二綴合物的第一個和第二個結合對成員相同或不同。此外，第一綴合物成員可以通過第一個和第二個結合對成員之間的結合來結合第二綴合物成員。在另一個實施方案中，組合的第二綴合物包括(i)包括感染劑的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員。根據本發明的另一個方面，提供了產生或增強對抗表達第一腫瘤相關抗原的腫瘤的免疫應答的方法，所述方法包括將以下的物質給予帶有腫瘤的患者(a)包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員的第一綴合物；和包括(i)包括第一肺瘤相關抗原的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員的第二綴合物；或(b)已經在體外用第一和第二綴合物處理過的免疫細胞。在一個實施方案中，將第一和第二綴合物給予患者，分開或同時，包括作為單個組合物的一部分。在另一個實施方案中，將已經在體外用第一和第二綴合物處理過的免疫細胞給予患者。在一個特定的實施方案中，免疫細胞包括用于免疫共刺激多肽的受體，并且其中通過免疫共刺激多肽和受體之間的結合將第一綴合物綴合免疫細胞，通過第一個和第二個結合對成員之間的結合將第二綴合物綴合免疫細胞。在一個實施方案中，該方法進一步包括給予第三綴合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和結合對的第一個成員的綴合物成員和(ii)包括第二腫瘤相關抗原和結合對的第二個成員的綴合物成員。在該實施方案中，第二免疫共刺激多肽與笫一免疫共刺激多肽相同或不同；第二抗原與第一抗原相同或不同；第三綴合物的第一個和第二個結合對成員與第一和第二綴合物的第一個和第二個結合對成員相同或不同。此外，第一綴合物成員可以通過第一個和第二個結合對成員之間的結合來結合第二綴合物成員。根據本發明的另一個方面，提供了修飾免疫細胞來產生或增強對表達腫瘤相關抗原的腫瘤或感染劑的免疫應答的方法，包括將表達第一免疫共刺激多肽受體的免疫細胞接觸(a)第一綴合物和(b)第二綴合物，第一綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；第二綴合物包括(i)包括與腫瘤或感染劑相關的抗原或感染劑的綴合物成員，和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員。可以通過免疫共刺激多肽和受體之間的結合將笫一綴合物綴合免疫細胞，并可以通過第一個和第二個結合對成員之間的結合將第二綴合物綴合免疫細胞。在一個實施方案中，免疫細胞是T細胞，如CD4+細胞或CD8+細胞，或嗜中性粒細胞，自然殺傷細胞，單核細胞或樹突細胞。在另一個實施方案中，免疫細胞包括第一免疫共刺激多肽的受體，并且該方法進一步包括將免疫細胞接觸第三綴合物，該第三綴合物包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和結合對的第一個成員的綴合物成員和(li)包括與腫瘤或感染劑相關的第二抗原或感染劑和結合對的笫二個成員的綴合物成員。在該實施方案中，第二免疫共刺激多肽與第一免疫共刺激多肽相同或不同；第二抗原，如果存在，與第一抗原(如果存在)相同或不同；第三綴合物的第一個和第二個結合對成員與第一和第二綴合物的第一個和第二個結合對成員相同或不同。此外，第一綴合物成員可以通過第一個和第二個結合對成員之間的結合來結合笫二綴合物成員。根據本發明的另一個方面，提供了表達第一免疫共刺激多肽受體的修飾免疫細胞，其中用(a)第一綴合物和(b)笫二綴合物來修飾修飾的免疫細胞，第一綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員，第二綴合物包括(i)包括第一抗原或感染劑的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員，其中第一綴合物通過免疫共刺激多肽和受體之間的結合來綴合免疫細胞，并且第二綴合物通過第一個和第二個結合對成員之間的結合來綴合免疫細胞。在一個實施方案中，免疫細胞是T細胞，如CD4+細胞或CD8+細胞，或嗜中性粒細胞，自然殺傷細胞，單核細胞或樹突細胞。根據本發明的另一個方面，提供了誘導或增強對抗感染劑的免疫應答的方法，所述方法包括將以下物質給予患有感染劑感染或處于感染劑感染風險中的患者(a)第一綴合物和(b)第二綴合物，笫一綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員，第二綴合物包括(i)包括與感染劑相關的第一抗原或包括感染劑的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員。在一個實施方案中，通過直接注射至感染部位來給予第一和第二綴合物中的至少一個。在一個特定的實施方案中，感染是人或禽流感，并且第一抗原選自H、N、Ml、M2e、NS1、NS2(NEP)、NP、PA、PB1和PB2。在另一個特定的實施方案中，感染是HIV,并且第一抗原選自由Gag蛋9白、Pol、Vif、Vpr、Rev、Vpu、包膜抗原決定部位、Tat和Nef構成的HIV抗原。在一個實施方案中，該方法進一步包括給予第三綴合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和結合對的第一個成員的綴合物成員和(ii)包括第二個與感染劑相關的抗原或感染劑和結合對的第二個成員的綴合物成員，其中第二免疫共刺激多肽與第一免疫共刺激多肽相同或不同；第二抗原，如果存在，與第一抗原(如果存在)相同或不同；第三綴合物的第一個和第二個結合對成員與第一和第二綴合物的第一個和第二個結合對成員相同或不同，并且第一綴合物成員通過第一個和第二個結合對成員之間的結合來結合第二綴合物成員。根據本發明的另一個方面，提供了包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的綴合物。根據本發明的另一個方面，提供了誘導動物免疫刺激應答的方法，包括將包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的綴合物給予動物。在一些實施方案中，該方法進一步包括將抗原給予動物。附圖簡述圖1A和1B各自列出了包括核心鏈霉抗生物素蛋白和鼠LIGHT蛋白胞外結構域的融合蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO:1)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖IB中下劃線的是核心鏈霉抗生物素蛋白序列。圖2A和2B各自列出了包括人CD80胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO:3)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)。圖2B中下劃線的是核心鏈霉抗生物素蛋白序列。圖3A和3B各自列出了包括鼠4-1BBL胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO:5)和氨基酸序列(SEQIDNO:6)。圖3B中下劃線的是核心鏈霉抗生物素蛋白序列。圖4A和4B各自列出了包括核心鏈霉抗生物素蛋白和人4-1BBL胞外結構域的融合蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO:7)和氨基酸序列(SEQIDNO:8)。圖4B中下劃線的是核心鏈霉抗生物素蛋白序列。圖5A和5B各自列出了包括核心鏈霉抗生物素蛋白和人CD86胞10外結構域的融合蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO:9)和氨基酸序列(SEQIDNO:10)。圖5B中下劃線的是核心鏈霉抗生物素蛋白序列。圖6A、6B和6C列出了HPV16E6(SEQIDNO:11)、HPV16E6變體(SEQIDNO:12)和HV16E7(SEQIDNO:13)的氨基酸序列。圖7A&7B列出了實施例中所用的CSA-人CD40L的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:14&15)。圖8顯示了異源混合的淋巴細胞反應的結果，使用天然BLAB/c淋巴細胞作為應答物，而異源C57BL/6照射過的脾細胞作為刺激物。給所示培養物補充l^g/mlCSA-41BBL融合蛋白。圖9顯示了exvivoT細胞增殖的結果，其中用可溶性抗-CD3單克隆抗體(0.5jig/ml)和照射過的脾細胞刺激從C57B/6小鼠4兆選的CD8+T細胞，在CSA國4舊BL融合蛋白(0.5ng/ml)、對照CSA蛋白(0.19pg/ml)或抗4-lBB單克隆抗體克隆3H3(5pg/ml)的存在或不存在下。圖10顯示了用CFSE標記一百萬OT-ICD8+T細胞并轉移至用生物素化的OVA(10pg/注射)和與生物素化的OVA混合的CSA-4-1BBL融合蛋白(lpg/注射)(41BBL+OVA)或包括生物素化的OVA和CSA-4-1BBL的綴合物免疫的B6.SJL小鼠中時，抗原特異性CD8+T細胞的增殖性應答。最后一組(*)顯示了使用和4-1BBL等摩爾水平的5pg綴合10貼生物素化的OVA的CSA-4-1BBL的應答。圖IIA是直方圖，顯示了PE+未處理DC的細胞(填充灰色的區域)、用生物素化PE處理的DC(虛線)和用生物素化的PE〃CSA-4-1BBL綴合物處理的DC(實線)。圖11B顯示了接受每個處理的DC的PE的平均熒光強度(MFI)。圖12A顯示了流式細胞術的結果，進行流式細胞術來分析未處理(黑灰色)或在GM-CSF存在下用CSA-41BBL(實線)或LPS(虛線)處理的DC的CD86和II類MHC的水平。圖12B顯示了CD86和II類MHC的平均熒光強度。圖13顯示了來自天然的、生物素化的OVA/CSA處理的和生物素化的OVA/CSA-4-1BBL處理的動物的DC細胞上CD40、CD86和II類MHC表達的平均熒光強度。圖14A顯示了共培養實驗的結果，其中從天然BALB/c小鼠的脾臟和外周淋巴結挑選CD4+CD25-(單陽性，SP)和CD4+CD25+(雙陽性，DP)T細胞，并且單獨培養3天，或在補充照射過的脾細胞、抗CD3抗體(0.5pg/ml)和所示濃度(pg/ml)的4-1BBL或等摩爾量的對照CSA蛋白的培養物中，以1:1比例培養3天。圖14B中顯示了CFSE測試的結果，其中將用CFSE標記的SPT細胞在圖14A中所述條件下用于抑制測試中，除了使用0.5pg/ml的4-lBBL。顯示了每個直方圖的分裂細胞的百分比。圖15顯示了exvivoT細胞增殖的結果，其中從天然BALB/c小鼠的脾臟和外周淋巴結挑選CD4+CD25-(單陽性，SP)和CD4+CD25+(雙陽性，DP)T細胞，并且單獨培養，或在0.5^ig/ml抗CD3抗體和照射過的脾細胞存在下以1:1比例培養，4吏用或不用lpg/ml的4-lBBL。圖16顯示了CSA-hCD40L和CSA-mCD40L構建體的構建。剪頭表示引物(a、b、c、d)及其用于克隆目的的方向。圖17顯示了流式細胞術分析，證明了CSA-mCD40L和CSA-hCD40L與CD40受體的結合，其中用CSA-mCD40L或CSA-hCD40L孵育人THP-1和鼠A20細胞系，用FITC標記的抗-鏈霉抗生物素蛋白抗體染色，并在流式細胞術中分析。圖(a)和(b)各自顯示了CSA-mCD40L與人和鼠細胞系的結合，而圖(c)和(d)各自顯示了CSA-hCD40L與人和鼠細胞系的結合。圖18顯示了流式細胞術分析，證明了用CSA-hCD40L刺激的巨噬細胞上的II類HLA和共刺激分子的上調，其中用100ng/mlCSA-hCD40L將人THP-1細胞系刺激48小時(細實線)，并在流式細胞術中使用II類HLA(圖18A)和CD80(圖18B)的抗體來分析。將用CSA蛋白(實心直方圖)孵育的細胞和表達膜結合鼠CD40L(粗實線)的CHO細胞轉染子分別作為陰性和陽性對照。圖19顯示了流式細胞術分析，證明了用CSA-mCD40L刺激的鼠DC的表型突變，其中用各種濃度的CSA-mCD40L(空心直方圖)刺激骨髓衍生的不成熟的DC各種時間段，并使用對于CD80(圖19A)和CD86(圖19B)表達特異性的抗體來分析。留下未刺激的細胞(細實線)或用CSA蛋白刺激的細胞(實心直方圖)用作對照。顯示了每106個細胞用200ng蛋白刺激48小時的數據。圖20顯示了通過用CSA-CD40L刺激的人單核細胞分泌細胞因子，其中用lpg/mlrhsCD40L+增強劑(圖20A)和100ng/mlCSA-hCD40L(圖20B)或250ng/mlCSA-mCD40L(圖20C)或CSA刺激初步洗脫的人單核細胞18小時，并通過ELISA分析上清液的IL-ip和IL-6。圖20D顯示了用CSA或CSA-hCD40L(l|iig/ml)刺激遺傳改進來表達人CD40(CD40KO)的鼠巨噬細胞細胞系時的結果，提取RNA并通過RNAse保護測試來分析，使用RiboQuant多探針RNAse保護系統，使用才莫板mck-3b。顯示了用于IL-6、L32和GAPDH的保護探針。直方圖表示用管家基因L32標準化后的IL-6的條帶密度。圖21顯示了用CSA-hCD40L刺激的巨噬細胞中的iNOS表達的刺激，其中用IFN-y準備轉染用來表達人CD40的鼠CD40KO巨噬細胞系24小時，然后用lng/ml商業rhsCD40L和增強劑或300ng/mlCSA-hCD40L或CSA蛋白刺激細胞24小時，使用抗-iNOS抗體通過蛋白質印跡分析細胞裂解物。直方圖表示iNOS條帶的密度。圖22顯示了在12.5和25pg的劑量，與LPS相比較，CSA-4-1BBL的強烈體內佐劑影響，使用50iugOVA作為抗原。依據體內殺滅百分比報道了結果。圖23顯示了接種(i)PBS(，n=20);(ii)50pgPl+12.5pgCSA(■，n=6);("i)25pgCSA-4畫lBBL(▲,n=10);"v)50pgPl+25pgCSA國4-1BBL(△,n=13)或(v)50pgPl+10pgCpG(□,n=7)對現有的宮頸腫瘤的作用。接種Pl和CSA-4-1BBL的組合物導致了顯著提高的存活率，而接種Pl或CSA-4-lBBL提供了相當成功的免疫治療。圖24顯示了接種生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物在防止胂瘤生長中的結果。顯示了接種OVA(A)、生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物(▲)和對照小鼠()的小鼠無腫瘤存活，接種生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物的小鼠顯示出100%存活。圖25顯示出CFSE染色的細胞的流式細胞術，證明了與抗原單獨或抗原和LPS相比較，4-1BBL能將體內的抗原特異性CTL應答增強至較高的水平。在每個圖的角上作為肽脈沖的CFSE高峰的百分比裂解來表示結果，與標準化至天然動物的參照CFSE低峰相比較。圖26顯示了流式細胞術數據，證明了4-1BBL共刺激提高了體內的抗原遞呈。圖27顯示了流式細胞術數據，證明了4-1BBL共刺激提高了樹突細胞在體內的抗原吸收。發明詳述本發明提供了用于產生或增強免疫應答的方法和組合物，包括對抗抗原的免疫應答，抗原如TAA或與感染劑相關的抗原，感染劑如人和禽流感或HIV。本發明還提供了用于產生或增強對抗原的免疫應答的修飾免疫細胞。本發明還提供了免疫治療方法，包括癌癥免疫治療方法，如減小肺瘤大小的方法和抑制胂瘤細胞生長的方法，以及治療或預防傳染的方法。生產性獲得性免疫應答需要次要淋巴器官的組織化結構內的天然T效應("Teff，)細胞和APC之間協同且及時的相互作用。這種相互作用促進了Teff細胞和APC的相互激活，導致各種細胞表面配體和受體以及對啟動、維持和長期記憶應答重要的可溶性蛋白的表達。如上所述，至少三個信號(信號l、2和3)涉及最初的天然T細胞的激活。已經暗示了幾個免疫共刺激分子刺激了這些信號中的一個或多個。本發明涉及一個或多個免疫共刺激多肽和一個或多個與胂瘤或感有效的對抗胂i或感染劑、的免疫應答。或者:可以替代與其相:的抗原而使用感染劑。盡管不希望受到任何理論的束縛，認為本發明通過促進抗原遞呈和激活免疫應答獲得了有利的結果。在另一個可替換的實施方案中，本發明提供了包括免疫共刺激多肽的免疫刺激部分，用于刺激免疫應答。出于本申請的目的，以下的術語具有這些定義如在此所用的，"一個"或"一種"意思是一個或多個，除非特意指出只表示一個。如在此所用的"給予"包括所有給患者提供物質的合適方式。常用的途徑包括口服、舌下、經粘膜、經皮、直腸、陰道、皮下、肌內、靜脈內、動脈內、鞘內、通過導管、通過植入等。在一些實施方案中，將組合物接近或直接給予腫瘤，如通過直接注射至胂瘤中或注射至血液，如腫瘤是血液腫瘤時。如在此所用的"抗原"沒有限制。抗原包括蛋白質、脂質、糖、核酸、化學部分和其它誘導免疫應答的分子。抗原包括蛋白質，其可以是修飾或未修飾的，如通過糖基化或曱基化來修飾，例如是環化的或結合脂質。與感染劑或疾病相關的抗原包括是感染劑一部分的抗原，如包膜蛋白、衣殼蛋白、表面蛋白、毒素、細胞壁、抗原性脂質等。其它抗原可以只在宿主存在下表達。在一些實施方案中，其它合適的抗原可以包括宿主的抗原，包括誘導、修飾或作為傳染或疾病標記而另外超表達的那些。所有這樣的源自感染劑、傳染、病癥或疾病的抗原或與感染劑、傳染、病癥或疾病相關的抗原適用于本發明中。根據本發明還適于用作"抗原"的是包括全長蛋白抗原性部分的肽，如包括誘導免疫應答的蛋白質的一部分的肽，如免疫原性抗原決定部位。例如，合適的抗原可以包括合成的誘導免疫應答的肽。"結合對"指的是通過任一種分子力相互作用的兩個分子，分子力包括，例如，離子、共價、疏水、范德華和氫鍵，使得該結合對具有相互特異性結合的特性。特異性結合的意思是在沒有結合另一個分子的條件下，結合對成員呈現出相互結合。結合對的實例是生物素-抗生物素蛋白、激素-受體、受體-配體、酶-底物、IgG-蛋白A、抗原-抗體等。"免疫共刺激多肽"意思是提高個體對抗病原體(包括感染劑)或腫瘤的免疫應答的多肽。如在此所用的"免疫細胞"包括涉及獲得性或先天性免疫系統的產生、調節或作用的任何細胞。免疫細胞包括T細力包，如CD4+細胞、CD8+細胞和各種其它T細胞子集、B細胞、自然殺傷細胞、巨嗟細胞、單核細胞和樹突細胞，以及嗜中性粒細胞。如在此所用的"患者"包括任何脊推動物，包括馬、羊、公山羊、牛、豬、鳥類、狗、貓和靈長類物種。在一個實施方案中，患者是人。本領域技術人員將認識到特定的免疫共刺激分子、信號分子、細胞標記、細胞類型、感染劑等，關于一個物種討論時，在不同的物種中具有相應的類似物，并且本發明包括這樣的類似物及其在相應和相關物種中的用途。如在此所用的"腫瘤"包括實體和非實體肺瘤(如淋巴瘤)；以及從癌變前損傷和良性腫瘤發展至癌性的、惡性的和轉移性肺瘤的不同腫瘤階段。概括地，本發明提供了使用(a)第一綴合物和(b)第二綴合物產生或增強對抗笫一抗原的免疫應答的方法，第一綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員，第二綴合物包括(i)包括第一抗原的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員。抗原是TAA或與感染劑相關的抗原，或感染劑自身。可以將包括抗原或感染劑的綴合物直接給予患者，或可以用來處理免疫細胞，然后將其給予患者。本發明還提供了包括綴合物的組合物、用綴合物處理過的免疫細胞和制備處理過的免疫細月包的方法。本發明還提供了包括免疫共刺激多肽的免疫刺激部分，如包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的綴合物或融合蛋白。本發明還提供了誘導動物免疫刺激應答的方法，包括將免疫刺激部分給予動物。在一些實施方案中，還將抗原給予動物。還提供了包4舌該部分的組合物。根據本發明的一個方面，作為包括選擇性耙向一種或多種類型的免疫細胞的免疫共刺激多肽的綴合物的一部分將抗原或感染劑呈現給免疫細胞，如以下所述的免疫共刺激多肽的任一種。因此，根據一個實施方案，本發明提供了包括免疫共刺激多肽和腫瘤或感染劑相關的抗原或感染劑的綴合物。可以通過任何方式將抗原或感染劑與免疫共刺激多肽綴合，包括通過共價結合、直接或通過連接物、或通過結合對成員。在一個實施方案中，通過結合對的結合相互作用將抗原或感染劑與免疫共刺激多肽綴合。根據該實施方案，將每個抗原(或感染劑)和免疫共刺激多肽與結合對的成員綴合，并且結合對成員的結合相互作用將綴合物中的抗原(或感染劑)和免疫共刺激多肽連接在一起，如免疫共刺激多肽-結合對的第一個成員結合對的第二個成員-抗原(或感染劑)綴合物。根據該實施方案，本發明提供了包括(a)第一綴合物和(b)第二綴合物的組合，第一綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員，第二綴合物包括(i)包括與肺瘤或感染劑相關的第一抗原(或感染劑自身)的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員。在另一個實施方案中，組合包括第三綴合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括與腫瘤或感染劑相關的第二抗原(或感染劑自身)的綴合物成員，其中第三綴合物的免疫共刺激多肽與第一綴合物的免疫共刺激多肽相同或不同，而第二抗原與笫一抗原相同或不同。在該實施方案的特定方面中，通過結合對成員與每個免疫共刺激多肽和第二抗原之間的結合，免疫共刺激多肽和第三綴合物的第二抗原結合在一起。根據該實施方案，第三綴合物的結合對成員與第一和第二綴合物的第一個和第二個結合對成員相同或不同。可以在分開的組合物中提供第一、第二和任選第三綴合物。或者，可以在單個組合物中提供第一和第二綴合物，并在分開的組合物中提供第三綴合物。在另一個可替換的實施方案中，在單個組合物中提供第一個、第二個和笫三綴合物。在另一個可替換的實施方案中，在一個組合物中提供第一綴合物，并在另一個組合物中提供第二個和第三綴合物。每個組合物任選可以包括藥物學上可接受的載體。藥物學上可接受的載體是可以用作組合物介質的物質，因為在給藥范圍中，該物質是惰性的或另外在醫學上是可接受的，以及與活性劑是兼容的。藥物學上可接受載體可以含有本領域公知的常規藥物添加劑。免疫共刺激多肽免疫共刺激分子涉及天然T細胞和抗原遞呈細胞之間的天然相互作用，其導致相互的激活并促進各種細胞表面配體和受體的表達，和引起免疫應答的啟動、維持和長期記憶的可溶性蛋白。如上所述，至少三個信號需要天然T細胞的最初激活。通過T細胞受體(TCR)與專門的APC(如樹突細胞(DC))表面上的主要組織兼容性復合物(MHC)分子呈現的名義肽之間的相互作用產生了信號1。通過通過幾個不同的分子介導了信號2，并且對于持續的免疫應答是關鍵。通過激活的T細胞和APC精心制成的細胞因子轉導信號3,并且對于效應免疫應答的維持是重要的。已經鑒定了多種免疫共刺激分子。根據本發明有用的示例性免疫共刺激分子(多肽)包括，但不限于，LIGHT、CD80(B7-l)、CD86(B7畫2)、ICOS、ICOSL(包括B7h、B7-H2、B7RP-1、GL畫50和LICOS)、CD94(KP43)、CD40L(CD154)、ICAM-I(CD54)、ICAM-2、ICAM-3、17SLAM(CD150)、HAS(CD24)、4-lBB(CDwl37)、4-lBBL(CDwl37L)、OX40L、CD28、CD40(BP50)、CD25(IL-2Ra)、淋巴毒素(LTa或LT卩)、TNF、Fas-L、GITR(激活可誘導TNRF)、GITR配體、CDlla(otL整聯蛋白)、CD1lb(dM整聯蛋白)、L-selectin(CD62L)、CD69(非常早期激活抗原)、CD70(CD27L)、PD國L1、PD國L2、B7畫H3、B7-H4、OX40L、4國1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF和APRIL。參見，例如，Watts&DeBenedette,1999,C匿(9豐/畫畫/.,11:286-93。除非在此特指為"全長"，在此參照免疫共刺激多肽包括全長多肽及其呈現出免疫共刺激功能的片段或部分，包括但不限于，以下特意鑒定的那些片段和部分。因此，例如，參照4-1BBL多肽意味著包括呈現出免疫共刺激功能的全長4-lBBL的片段或部分的多肽，如4-lBBL的胞外結構域或全長4-lBBL蛋白。在一個實施方案中，免疫共刺激多肽不包括免疫共刺激分子的跨膜結構域。在一個實施方案中，免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的胞外結構域，或其受體結合片段。代表性的核酸序列和所編碼的免疫共刺激多肽的實例包括GenBank登錄號No.AB029155(鼠LIGHT);畫_172014(人TNFSF14mRNA轉錄物變體2);NM—003807(人TNFSF14mRNA轉錄物變體1);NM005191(人CD80mRNA);NM—009855(鼠CD80mRNA);NM—214087(豬CD80mRNA);NM—009404(鼠Tnfsf9mRNA);NM—003811(人TNFSF9mRNA);NM—181384(褐家鼠TnfsfPmRNA);BAA88559(鼠LIGHT蛋白)；Q9QYH9(鼠TNFSF14膜結合蛋白和可溶性蛋白)；AAH18058(人TNFSF14蛋白)；NP—005182(人CD80蛋白)；NP—033985(鼠CD80蛋白)；NP—037058(褐家鼠CD80蛋白)；NP—003802(人TNFSF9蛋白)；NP—033430(鼠TNFSF9蛋白)；NP—852049(褐家鼠TNFSF9蛋白)；NM_012967(褐家鼠ICAM畫1mRNA);X69711(人ICAM-1mRNA);X52264(鼠ICAM-ImRNA);X69819(人ICAM陽3mRNA);AF296283(鼠ICAM-4mRNA);NM—021181(人SLAMF7mRNA);NM—033438(人SLAMF9mRNA);NM一029612(鼠SLAMF9mRNA);畫—144539(鼠SLAMF7mRNA);L13944(鼠CD18基因)；X53586(人整聯蛋白a6mRNA);X68742(人整l關蛋白amRNA);J04145(人嗜中型粒細月包粘附受體a-M亞基mRNA);AJ246000(人白細胞粘附受體，L誦selectinmRNA);AY367061(人L陽selectinmRNA,部分cds);Y13636(鼠CD70mRNA);NM—001252(人TNFSF7mRNA);BC000725(人TNFSF7mRNA(cDNA克隆MGC:1597IMAGE:3506629)，完整cds);X69397(人CD24基因和完整CDS);NM—013230(人CD24mRNA);NM—012752(褐家鼠CD24mRNA);Y00137(鼠腫瘤壞死因子-卩(淋巴毒素)基因)；X02911(人胂瘤壞死因子-p(淋巴毒素)基因)；D00102(人淋巴毒素mRNA,完整CDS);X01393(人淋巴毒素mRNA);和A06316((人淋巴毒素mRNA)中所示的那些。可以找到編碼相同或其它免疫共刺激多肽的核酸序列和/或共刺激多肽的氨基酸序列，例如，通過搜索公眾可獲得的GenBank數據庫(例如，在環球網上的ncbi.nlm.nih.gov可獲得)。CD28和CD80/CD86之間的相互作用似乎在信號2的轉導中起著重要作用。參見，例如，Harding&Allison,J.Exp.Med.1993，177:1791-96;Ramarathinam等，J.Exp.Med.1994，179:1205-14;Townsend&Allison,Science1993,259:368-70;Gause等，J.Immunol.1997，159:1055-58。CD80通常不在靜止的B細胞上表達，而是在外周血單核細胞和DC上以低水平表達；然而，在激活后，這兩種細胞以及巨嗟細胞和其它APC上的CD80表達得到上調。參見，例如，Lenschow等，Ann.Rev.Immunol.1996,14:233-58;Freeman等，J.Immunol1989，143:2714-22。相反，CD86在外周血單核細胞和DC上得到組成型表達，并且在B細胞上得到更快速的上調。參見，例如，Lenschow等，上文，Inaba等，J.Exp.Med.1994,180:1849-60。TCR與APC上的MHC/肽復合物的相互作用使CD80/86分子與CD28同時增強并導致脂質激酶磷脂酰肌醇3-激酶的酪氨酸磷酸化，其隨后抑制一系列導致IL-2基因表達的誘導、細胞增殖和分化成效應功能的復雜胞內事件。參見，例如，Slavik等，Immunol.Res.1999,19:1-24;Azuma等，Nature1993,366:76-79;Allison&Krummel，Science1995,270:932-33。信號2可以通過調節抗凋亡基因(如Bal-xL)防止細胞死亡而進一步增大產生性免疫應答。參見，例如，Radvanyi等，J.Immunol.1996,156:1788-98;Boise等，Immunity1995,3:87-98;Boise&Thompson,Science1996,274:67-68。免疫激活的最初階^殳后，T細胞和APC表面上的多種其它受體-配體對得到上調。這些"次要的"受體/配體對，如4-1BBL/4-1BB,在最初激活后的維持、免疫體內平衡和免疫記憶的產生中起著重要作用。參見，例如，Yu等，Nat.Immunol.2004，5:141-49;Armitage等，Nature1992，357,80-82;Zhai等，J.Clin.Invest1998，102:1142-51;Bourgeois等，Science2002,297:2060-63;Kikuchi等，Nat.Med.2000,6:1154-59。/,(層A在本發明的一個特定實施方案中，免疫共刺激多肽是4-1BBL多肽。4-1BBL(也稱為4-BB-L,4-BB配體，TNFSF9、ILA配體)是在激活后兩到三天在激活的B細胞、巨噬細胞和DC上表達的II型蛋白。參見，例如，Alderson等，Eur.J.Immunol.1994，24:2219-27;Goodwin等，Eur.J.Immunol.1993,23:2631-41;Pollok等，Eur.J.Immunol.1994,24:367-74;DeBenedette等，J.Immunol.1997,158:551-59。其受體，4-lBB(CD137),在激活的CD4+和CD8+T細胞表面上，在自然殺傷細胞、單核細胞和靜止的DC上得到表達。參見，例如，Pollock,上文；Wilcox等，J.Immunol.2002，169:4230-36;Futagawa等，Int.Immunol.2002，14:275-86;Pollok等，J.Immunol.1993,150:771-81。4-1BB/4-1BBL相互作用還將信號2以CD28-無關性方式轉移至CD8+T細胞，并刺激它們來產生細胞因子、擴大并獲取效應物功能。參見，例如，Cannons等，J.Immunol.2001，167:1313-24;Hurtado等，J.Immunol.1995,155:3360-67。Kim&Broxmeyer,J.Hematother.StemCellRes.2001,10:441-49;Saoulli等，J.Exp.Med.1998,187:1849-62;Shuford等，J.Exp.Med.1997,186:47-55;Tan等，J.Immunol.1999，163:4859-68;Vinay&Kwon,Semin.Immunol.1998，10:481-89。4-lBB/4-lBBL相互作用對于單核細胞和DC的激活、細胞因子的合成以及與NK細胞的信息交流也是重要的。參見，例如，Futagawa等，上文；Wilcox等，J.Clin.Invest2002,109:651-9。相似地，除了通過cyclinD2和E的上調和cyclin-依賴性激酶抑制劑p27kipl的下調促進抗原特異性T細胞擴大的作用，4-lBB信號在T細胞存活中起著作用，因為其通過抗凋亡Bcl-xL和Bcl-l的上調和長期免疫記憶的建立防止了激活誘導的細胞死亡。參見，例如，Takahashi等，J.Immunol.1999,162:5037-40;Hurtado等，J.Immunol.1997,158:2600-09;Kim等，20Eur.J.Immunol.1998,28:881國卯。還顯示出4畫lBB/4-lBBL相互作用選擇性地促進1型細胞因子，如IL-2、IFN-y和TNF-a,表明4-1BB是1型效應T細胞特異性的共刺激分子，其在肺瘤根除中起著作用。最近已經表明Treg細胞組成型表達4-1BB受體并且通過4-lBB受體的信號轉導抑制了這些細胞的抑制功能。參見，例如，choi等，上文；Morris等，上文，以及以下的實施例。這是重要的，因為Twg細胞在免疫系統的腫瘤逃避中起著重要作用。幾個臨床研究證明了Treg細胞的數目和肺瘤進展之間存在直接的關聯。Curiel等，Nat.Med.2004,10:942-49。實際上，動物模型中Treg細胞的根除導致大的肺瘤根除，提供了它們在腫瘤進展中主要作用的直接證據。Yu等，J.Exp.Med.2005,201:779-91。相似地，感染劑，如HIV，可以使用Treg細胞，用于免疫逃避。盡管不希望受到理論的束縛，認為根據本發明將4-lBBL用作免疫共刺激多肽可以激活T細胞上的4-1BB同源受體，形成幾個重要的免疫刺激作用。一個作用是信號2以CD28-無關性方式轉移至CD8+T細胞，這刺激T細胞來產生細胞因子、擴大并獲取效應物功能。4-1BB/4-1BBL相互作用的另一個作用是激活單核細胞和DC,其導致細胞因子的合成和釋放。4-lBB信號的另一個作用是通過防止激活誘導的細胞死亡(AICD)促進T細胞存活和建立長期免疫記憶。4-1BB/4-1BBL相互作用的再一個作用是從T細胞、DC和巨噬細胞選擇性地產生l型細胞因子，如IL-2、IFN-y和TNF-a,其作用于對腫瘤根除重要的1型效應T細胞。此外，如以上所解釋的，4-1BB/4-1BBL相互作用可以抑制Treg細胞的抑制劑功能。因此，例如，4-lBBL抗原綴合物可以特異性地結合表達4-lBB受體的DC，促進抗原遞呈，激活DC,用于產生初級T細胞應答，直接作用于激活的T細胞(包括Treg細胞)和NK細胞來加強對抗抗原的應答Treg細胞。4-lBBL含有254個氨基酸(26624Da)。參見Alderson等，EurJImmunol.1994年9月；24(9):2219-27。可以在Swiss畫Prot數據庫中依據登錄號no.P41273找到人4-lBBL的全部氨基酸序列。4-lBBL是II型糖蛋白，由殘基1-28形成潛在的細胞質結構域，殘基29-49形成單個預測的跨膜結構域，殘基50-254形成潛在的胞外結構域，而殘基35-41表示聚-Leu鏈。可以在GenBank登錄號no.NM—003811中找到編碼人4-lBBL的核苷酸序列。如上所述，激活后2-3天，通過激活的抗原遞呈細胞，包括激活的B細胞、巨噬細胞和DC來表達4-lBBL。4-1BB,是4-lBBL的受體，在激活的CD4+和CD8+T細胞表面上，在自然殺傷細胞、單核細胞和靜止的DC上得到表達。可以結合其同源受體4-1BB的4-1BBL的殘基蛋白，根據本發明來使用。例如，圖3A和3B列出了CSA-鼠4-1BBL的核苦酸和氨基酸序列(SEQIDNO:5和6)。圖4和B顯示了包括人4-1BBL胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:7和8)。么CD柳&CZ)S6CD80(也稱為B7.1,CD28LG,LAB7)和CD86(也稱為B7.2,CD28LG2,LAB72)是示例共刺激多肽，兩者都結合T細胞表達的CD28/CTLA4共受體。CD80含有288個氨基酸(33048Da)。參見Freeman等，J.Immunol.143(8),2714-2722(1989)。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.P33681找到人CD80的全部氨基酸序列。CD80是I型糖蛋白，由殘基1-34形成分泌信號，殘基35-242形成潛在的胞外結構域，殘基243-263形成潛在的跨膜結構域，而殘基264-288形成潛在的細胞質結構域。因此，沒有分泌信號序列的成熟CD80分子表示氨基酸35-288。可以在GenBank登錄號no.NM—005191中找到編碼人CD80的核苷酸序列。可以結合其同源受體CD28的CD80的殘基35-242或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的融合蛋白，根據本發明來使用。例如，圖2A和2B列出了包括人CD80(B7.1)胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的核苦酸(SEQIDNO:3)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)。CD86(B7.2)含有329個氨基酸(37696Da)。參見Freeman等，Science262(5135),909-911(1993)。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.P42081找到人CD86的全部氨基酸序列。CD86是I型糖蛋白，由殘基l-23形成分泌信號，殘基24-247形成潛在的胞外結構域，殘基248-268形成潛在的跨膜結構域，而殘基269-329形成潛在的細胞質結構域。因此，沒有分泌信號序列的成熟B7.2分子表示氨基酸24-329。可以在GenBank登錄號no.NM—175862中找到編碼人CD86的核苷酸序列。可以結合其同源受體CD28的CD86的殘基24-247或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的融合蛋白，根據本發明來使用。例如，圖5A和5B列出了包括人CD86(B7.2)胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:9)和氨基酸序列(SEQIDNO:10)。CD86通常不在靜止的B細胞上表達，而是在外周血單核細胞(PBC)和DC上以低水平表達；然而，在激活后，B細胞和其它APC如巨噬細胞和DC上的表達得到上調。相反，CD86在PBC和DC上得到組成型表達，并且在B細胞上得到更快速的上調。T細胞受體(TCR)與APC上的MHC/肽復合物的相互作用使T細胞上的CD80/86與CD28同時增強，這導致脂質激酶磷脂酰肌醇3-激酶的酪氨酸磷酸化，其隨后抑制一系列導致IL-2基因表達的誘導、細胞增殖和分化成效應物功能的復雜胞內事件。信號2可以通過調節抗凋亡基因(如Bal-xL)防止細胞死亡而進一步增大產生性免疫應答。丄ZJG//71免疫激活的最初階段后，"次要的"受體/配體對，如4-1BBL/4-1BB和LIGHT/HVEM,在T細胞和APC的表面上得到上調。這些受體/配體對涉及最初激活事件后的維持、免疫體內平衡和免疫記憶的產生。LIGHT多肽(也稱為TNFS14、HVEM-L、LTg、TR2)是與淋巴毒素同源的TNF超家族成員。參見Mauri等，Immunity8(1),21-30(1998)。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.043557找到人LIGHT的全部氨基酸序列。LIGHT含有240個氨基酸(26351Da)并且是II型糖蛋白，由殘基1-37形成潛在的細胞質結構域，殘基38-58形成單個預測的跨膜結構域，而殘基59-240形成潛在的胞外結構域。分裂位點涉及殘基82-83。可以在GenBank登錄號no.NM—172014中找到編碼人LIGHT的核苷酸序列。可以結合其同源受體HVEM、LT卩R或TR6的LIGHT的殘基59-240或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的融合體，根據本發明來使用。例如，圖1A和IB列出了包括核心鏈霉抗生物素蛋白和鼠LIGHT胞外結構域的嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:1)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。LIGHT主要在激活的T細胞、NK細胞和未成熟的樹突細胞上表達，并用來調節免疫應答的各個方面。作為膜結合蛋白來合成LIGHT,但是其細胞表面表達受到幾個翻譯后機制的調節。在表達的幾分鐘內通過基質金屬蛋白酶從細胞表面分離LIGHT并作為可溶性分子累積(異形體l;大概表示殘基83-240;Swiss-Prot043557-1)。細胞表面細胞質片段表示異形體2(Swiss-Prot043557-2)。此外，各種細胞類型在泡嚢中存儲LIGHT并在激活時通過各種生物刺激分泌出來。盡管LIGHT的可溶性形式的作用沒有得到充分的表征，可以作為負反饋環，通過與HVEM和LT|3R竟爭來抑制膜結合形式的功能。LIGHT與三個不同的受體相互作用(1)T細胞上的皰滲病毒進入介質(HVEM)，(2)LT|3R,其主要在上皮細胞和基質細胞上表達，和(3)各種細胞上的可溶性誘騙受體。這些相互作用賦予LIGHT不同的功能。與基質細胞上的LT|3R的相互作用與各種細胞因子/趨化因子的產生、淋巴結(LN)器官發生和二級淋巴結構的恢復相關。另一方面，LIGHT與淋巴細胞上的HVEM受體的相互作用導致細胞因子的激活和產生，主要為IFN-y和GM-CSF。關于這點，LIGHT/HVEM軸似乎傳送與Thl型應答激活相關的共刺激信號，這在腫瘤消除中起著關鍵作用。LIGHT在淋巴器官發生和Thl型應答產生中起作用。參見，例如,Yang等，2002,S/o/.Aegw/.Zf謹eoW.々e她,16:206-10;Schneider等，2004,/國畫/.觸，202:49-66。已經在體外和體內的不同肺瘤模型中顯示出LIGHT的作用。已經報道了通過表達LIGHT的單純皰滲病毒擴增子轉導的慢性淋巴細胞性白血病細胞能增強混合淋巴細胞反應中的T細胞增殖。已經顯示MDA-MB-231人乳癌細胞上的LIGHT超表達抑制胂瘤生長。LIGHT轉染至不同的癌細胞系中刺激這些細胞中的ICAM-1表達。認為ICAM-1的存在是有益的，因為它能夠有效傳導信號，以在胂瘤細胞中產生抗腫瘤活性。除了T細胞激活以外，LIGHT的另一個重要功能是通過LT(3R轉導信號的能力，這在次級淋巴結構的產生中起著重要作與基質細胞上的LT卩R的相互作用調節CCL21的表達，這控制天然T細月包回到'淋巴組織。其中將腫瘤細胞工程化來展示LIGHT的本發明的實施方案的一個優勢是LIGHT刺激淋巴器官生成和支持Thl型應答產生的能力。另一個優勢是LIGHT刺激對抗腫瘤的免疫應答和激活腫瘤基質來進一步擴大這些應答的能力。基質作為物理屏障來防止淋巴細胞滲透至腫瘤部位中。基質還抑制了腫瘤微小環境內的淋巴細胞激活。這可能是由于缺乏T細胞激活需要的共刺激信號和/或各種免疫抑制可溶性介質的存在，如TGF-P和IL-IO，這些通過基質成纖維細胞和胂瘤細胞合成并分泌。基質通過將腫瘤細胞限于肺瘤部位來促進免疫無知，因此防止它們轉移至區域性的淋巴結。腫瘤基質細胞還表達各種免疫受體，如LTj3R,根據本發明可以將其開發用于抗腫瘤免疫的增強。(OT視OX40L是由樹突細胞和其它APC表達的，并結合存在于激活的T細胞上的OC40。OX40L含有183個氨基酸(21950Da)。參見Miura等，Mol.Cell.Biol.il:1313-1325(1991)。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.P23510找到OX40L的全部氨基酸序列。OX40L是II型糖蛋白，殘基1-23為細胞質結構域，殘基24-50為跨膜結構域，而殘基51-183為胞外結構域。OX40L的核苷酸序列為3510bp,編碼序列為157-708(參見GenBank登錄號no.NM—003326.2)。可以結合其同源受體OX40的OX40L的殘基51-183或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的C-端融合體，根據本發明來使用。5.CD視CD40L是由激活的T細胞表達的，并且還作為胞外可溶形式存在，其通過蛋白水解過程源自膜形式。CD40L(也稱為TNFSF5)含有261個氨基酸(29350Da)。參見Villinger等，Immumogenetics53:315-328(2001)。可以依據登錄號no.Q9BDN3找到CD40L的全部氨基酸序列。25CD40L是II型糖蛋白，殘基1-22為細胞質結構域，殘基23-43為跨膜結構域，而殘基44-261為胞外結構域。CD40L的核苷酸序列為1834bp，編碼序列為73-858(參見GenBank登錄號no.NM—000074)。可以結合其同源受體CD40的CD40L的殘基44-261或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的N-端融合體，根據本發明來使用。PD-L1在激活的T和B細胞、樹突細胞、角化細胞和單核細胞上得到表達。PD-L1(也稱為B7-H;B7H1;PDL1;PDCD1L1)含有290個氨基酸(33275Da)。參見，Dong等，Nat.Med.5:1365-1369(1999)。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.Q9NZQ7找到PD-L1的全部氨基酸序列。PD-L1含有290個氨基酸，在N端的18個氨基酸表示信號序列。胞外結構域位于氨基酸19-238，跨膜結構域位于殘基239-259,而細胞質結構域位于殘基260-290。PD-L1的核苷酸序列(1553bp)可在公眾數據庫中獲得(參見GenBank登錄號no.NMJ)14143)(編碼序列為53-925)。通過可替換的剪接，存在PD-L1的異形體。可以結合其同源受體PDCD1的PD-L1的胞外結構域或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的N-端融合體，根據本發明來使用。7.GZJOGL50異形體1得到廣泛表達(腦、心臟、腎臟、肝臟、肺、胰腺、胎盤、骨骼肌、骨髓、結腸、卵巢、前列腺、睪丸、淋巴結、淋巴細胞、脾臟、胸腺和扁桃體)；GL50異形體2(swissprot075144)在淋巴結、淋巴細胞和脾臟中以及在激活的單核細胞和樹突細胞上表達。GL50(也稱為B7畫H2;B7H2;B7RP國1;B7RP1;ICOS-L;ICOSLG;KIAA0653;和LICOS)含有290個氨基酸(33275Da)。參見，Wang等，Blood96:2808-2813(2000)。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.075144找到GL50的全部氨基酸序列。GL50含有302個氨基酸，N端的18個氨基酸表示信號序列。胞外結構域位于氨基酸19-256,跨膜結構域位于殘基257-277和細胞質結構域位于殘基278-302。GL50的核苷酸(3239bp)在公眾數據庫中可獲得(參見GenBank登錄號no.NM—015259)(編碼片段表示135-1043)。通過可替換的剪接，存在GL50的異形體。可以結合其同源受體ICOS的GL50的胞外結構域或根據本i明來使用。'、-''''、5表1概括了各種示例性共刺激分子及其受體并包括共受體配體對綴合物的實施方案。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>根據本發明可以-使用其它免疫共刺激多肽。例如，US2003/0219419(在此將其內容全部引入作為參考)描述了可用于本發明中的IL-2-CSA融合蛋白和CSA-CD40L融合蛋白。總之，根據本發明有用的示例性免疫共刺激多肽包括以下的。表2:B7和CD28家族成員<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表4B:TNF家族成員的核苷酸和/或氨基酸序列的參考文獻<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>本發明的方法和組合物用于產生或增強對抗任何抗原或感染劑的免疫應答，包括對抗TAA、與感染劑相關的抗原和感染劑自身。根據本發明，將與靶向腫瘤或感染劑相關的抗原(或感染劑自身)呈現于免疫細胞，因此產生或增強免疫應答。/.在一個實施方案中，抗原是TAA,并且本發明提供了有效產生或增強患者對抗腫瘤的免疫應答的癌癥免疫治療方法。根據該實施方案，本發明提供了降低腫瘤大小的方法和抑制腫瘤細胞生長的方法。本發明對抗有用的代表性腫瘤細胞包括，但不限于，癌，其可以源自各種身體器官中的任一種，包括肺、肝臟、乳房、膀胱、胃、結腸、胰腺、皮膚等。癌可以包括產生于器官或腺體中的腺癌和源于鱗狀上皮的鱗狀細胞癌。可以治療的其它癌癥包括肉瘤，如骨肉瘤或骨源性肉瘤(骨)，軟骨肉瘤(軟骨)，平滑肌肉瘤(平滑肌)，橫紋肌肉瘤(骨骼肌)，間皮肉瘤或間皮瘤(體腔的膜內層)，纖維肉瘤(纖維組織)，血管肉瘤或血管內皮瘤(血管)，脂肪肉瘤(脂肪組織)，神經膠質瘤或星形細胞瘤(腦中發現的神經結締組織)，粘液肉瘤(原始胚胎結締組織)，esenchymous或混合中胚層肺瘤(混合的結締組織類型)。除了骨髓瘤，還易于治療白血病和淋巴瘤。已經鑒定了多種與特定腫瘤類型相關的TAA。這些包括人末端酶逆轉錄酶(hTERT),survivin，MAGE-1,MAGE-3,人絨膜促性腺激素，癌胚抗原，a胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-l,CA125,CA15-3,CA19-9,CA549,CA195,前列腺特異性抗原；前列腺特異性膜抗原，Her2/neu,gp-100,突變K-ras蛋白，突變p53，截斷的上皮生長因子受體，嵌合蛋白p21°BCR-ABL;人乳頭瘤病毒的E7蛋白，和EB病毒的EBNA3蛋白。可以根據本發明使用這些抗原中的任一種，其抗原片段和抗原和/或片段的混合物來產生或增強患者的抗腫瘤免疫應答。表5列出了示例性TAA以及與這些TAA相關的疾病。表5.<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>例如，可以在Novellino等,"AlistingofhumantumorantigensrecognizedbyTcells:March2004update"(由T細胞識別的人胂瘤抗原的歹'J表2004年3月更新)CVmcer/wwwwo/ogyawe//mwimo/7^ra/7_y，54:187-207(2005)中找到由T細胞識別的其它人TAA，在此將其引入作為參考。對應于這些疾病的動物correllaries以及對應于其它動物疾病的許多動物TAA是本領域已知的并包括在本發明的范圍之內。在本發明的一個實施方案中，TAA選自人末端酶逆轉錄酶(hTERT)和survivin，作為TAA。在〉85%人癌癥中表達hTERT,盡管其表達限于正常組織中。參見，例如，Vonderheide等，Immunity1999,10:673-79。相似地，survivin,已經鑒定為凋亡抑制劑，在正常組織中不存在，但在大部分腫瘤類型中得到表達，包括肺、結腸、胰腺、前列腺和乳房癌中。參見，例如，Ambrosini等，Nat.Med.1997，3:917-21。因為這些TAA在大部分癌癥類型中得到表達，并且在正常組織中很少或不存在，因此對于根據本發明的癌癥免疫治療方法中的使用是有吸引力的抗原。在本發明的另一個實施方案中，TAA與宮頸癌相關。全世界每年大概有500,000名婦女產生宮頸癌并且是婦女癌癥死亡的第二大誘因。宮頸癌與人乳頭狀瘤病毒引起的生殖器病毒感染直接相關并且是全世界的健康問題。在大概一半的宮頸癌中特別發現了16型HPV。生殖器16和18型HPV,以及不太常見的31、33、35、45、51和56型，也涉及宮頸癌和其它肛門與生殖器癌癥的病原學。癌細胞中發現的HPV類型在體外研究中具有轉化活性，并且病毒轉化蛋白，E6和E7(也稱為"早期"蛋白)在宮頸癌細胞系和HPV-相關癌癥中得到組成型表達。已知E6和E7各自結合腫瘤抑制劑p53和成視網膜細胞瘤(Rb)。在HPV相關惡性轉化中，后期基因(LI和L2)和一些早期基因(El和E2)通常丟失，留下E6和E7作為癌中通常發現的唯一開放閱讀框。E6和E7的表達很可能勝過了通常由蛋白如p53和Rb的介導的細胞增殖的調節，使其不受控制地生長并提供了惡性轉化的潛能。因此，根據本發明的一個特定實施方案，TAA是E6和E7中的一個或多個。根據本發明的E6和E7的使用給予了幾個優勢。首先，E6和E7在大部分宮頸癌中得到組成型表達。其次，盡管大部分腫瘤抗原源自正常的蛋白質或突變的自體蛋白，E6和E7是完全的外源病毒蛋白，并且比突變蛋白帶有更多的抗原肽或抗原決定部位。第三，E6和E7在惡性表型的誘導和維持中起著重要作用，而如果沒有功能性E6和E7，這些細胞將不再是致癌的。來自不同物種(例如，人，牛)的E6和E7蛋白的核苷酸和氨基酸序列和用于不同乳頭狀瘤病毒類型(例如，HPV16和18)是本領域已知的。參見，例如，http:〃www.stdgen.lanl.gov/stdgen/virus/hpv/index.htm1.6勺HPV序歹'J數凈居庫。HPV16E6、HPV16E6變體和E7的氨基酸各自列于圖6A(SEQIDNO:11)、6B(SEQIDNO:12)和6C(SEQIDNO:13)中。么4染*本發明對抗有用的代表性感染劑包括，但不限于，任何病毒、細菌、真菌或原生動物。表6列出了感染劑的實例。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>人和禽流感、HIV、丙肝、肺結核、西尼羅河病毒、隱球菌(腦膜炎)、皰滲、衣原體和炭疽是代表性的感染劑。根據本發明可以使用與感染劑相關的任何抗原。根據一個實施方案，將感染劑自身用于根據本發明的綴合物中。根據該實施方案，使用包括感染劑如病毒和結合對成員的綴合物。可以使用任何感染劑，如病毒，包括人和禽流感病毒或HIV,或任何其它病毒。可以將感染劑改良或減毒來降低或消除其傳染力。只為了說明的目的，參照流感更詳細地描述了本發明的這個方面。流感是由流感病毒引起的接觸傳染病，通常引起鼻子、喉嚨和肺中的癥狀，以及發熱、頭疼、疲勞和頭疼。還導致了并發癥，如肺炎、支氣管炎或竇和耳朵感染或惡化的慢性病癥。將流感病毒分為A、B或C型。屬于A和B型的菌林在群體中循環并與大部分人流感病例相關。A型流感在人群中引起無法抵擋的大部分的公共健康問題。根據其兩個蛋白的組成將A型流感病毒亞分類；血凝素(H),促進病毒結合并進入目標細胞的蛋白，和神經氨酸酶(N),涉及新形成的病毒顆粒從受感染細胞中釋放出來并通過身體來傳播。已經鑒定出十四個血凝素亞型(H1-H15)和9個神經氨酸酶亞型(Nl-N9)。人群中大的流感爆發由單個血凝素亞型(Hl、H2和H3)和兩個神經氨酸酶亞型(N1和N2)引起。例如，1918年的流感病毒的血凝素是Hl,其神經氨酸酶是Nl,因此稱為H1N1亞型。其它的爆發包括1975年的H2N2亞型，1968年的H3N2亞型，和最近在東南亞、中國以及現在在歐洲和中東在鳥類和人類中爆發的H5N1。流感A病毒經常通過涉及血凝素和神經氨酸酶的反應或抗原位點的突變或改變的機理，或一個血凝素或神經氨酸酶亞型由另一個亞型的突發替代來發展。這些機理形成新的病毒亞型并使流感病毒逃避免疫系統的防御并傳播。每年都會出現流感A病毒的抗原變體，并且基于世界衛生組織正在進行的流感病毒國際監視，需要最新的疫苗制劑。由于這種新流感病毒亞型不斷出現的現象，如近些年的H5N1，預期將會發生更大的流感爆發。在特定的似是而非的生物恐怖主義情況中，將實驗室產生的病毒進行相似的設計來實現抗原改變，并因此引起逃避已建立的宿主防御的爆發。本發明的綴合物可以用于流感疫苗中，流感疫苗容易生產并可快速制造，可以基于當前的健康需要來改變和更新其抗原成分，而沒有任何困難，其選擇性地靶向病毒機構和受感染的細胞，并且對于治療性效果，可以注射后給予，以及注射前給予，用于預防。因此，根據一個實施方案，將流感抗原(或其抗原片段)用作本發明綴合物的抗原成分。例如，抗原可以包括一個或多個H1和N1(都是高度致免疫的)和/或一個或多個核蛋白(NP)和基質蛋白1(MP1)和/或基質蛋白2(MP2)(全部是高度保守的結構蛋白)。根據本發明，來自流行林如H5的蛋白，也可以用作抗原。盡管不希望收到任何理論36的束縛，胞內蛋白如NP和MP2可以提供更通用的疫苗，因為它們呈現出幾乎沒有改變，并因此防止異種病毒感染，而不需要每年調整。例如，NP在流感A分離物中呈現出>90%的蛋白序列同源性，并含有占優勢的細胞毒性T細胞目標抗原決定部位。本發明中有用的其它流感抗原包括PA、PB1和PB2(RNA聚合酶亞基)以及NS1和NS2(干擾素應答抑制劑和RNP核輸出)。請參閱，Brown，2000,Biomed.Pha腿cother.54:196-209;Steinhauer等，2002,36:305-32;DeJong等，2000,40:218-28;Alexander,Vet.Microbiol.74:3-13。因此，根據一個實施方案，將A型流感血凝素蛋白(或其抗原片段)用作本發明綴合物的抗原成分。目前通過皮下注射含有H作為主要成分的流感疫苗來獲得流感的預防。例如，來自流感病毒A/PuertoRico/8/34(PR8)(N1H1)的HI是主要的循環H蛋白，且已經得到充分的表征，并可以根據本發明來使用。在另一個實施方案中，將A型流感神經氨酸酶蛋白(或其抗原片段)用作綴合物的抗原成分。將包括含有H-蛋白的綴合物或含有N-蛋白的綴合物的組合物用作對抗流感的疫苗。(例如，目前的流感疫苗包括作為主要成分的H蛋白，并且已經顯示出能誘導足夠的免疫力來預防同源病毒的流行)。或者，給予包括H蛋白的綴合物和包括N蛋白的綴合物兩者，或抗原的任意組合物，如可變和保守抗原的組合物將是有利的。通過給予兩種或多種組合物來實現這，每個組合物包括含有單個抗原的綴合物，或在單個組合物中提供兩個或多個綴合物(并因此提供兩個或多個抗原)來實現這。在一個實施方案中，基于目前的公共健康需要來選擇綴合物的抗原成分。在一個實施方案中，綴合物包括4-lBBL作為免疫共刺激多肽。盡管不希望受到任何理論的束縛，認為將該綴合物體內給予患者時，將通過DC上的4-1BBL和4-1BB之間的相互作用來結合DC，使得疫苗內在化和流感抗原在DC的表面上遞呈，以及DC的激活和成熟。DC的激活隨后導致與CD8和CD4T細胞的相互作用并激活這些細胞。然后，激活的CD4T細胞與B細胞反應，并使它們激活和分化成分泌抗體的細胞，導致體液應答。CD8T細胞的激活還導致更多的CD8T細胞的分化和增殖，其用來殺滅受病毒感染的細胞。綴合物還可以直接結合激活的CD8和CD4T細胞，表達4-1BB受體，并進一步擴大信號。此外，綴合物(通過4-1BBL)可以直接結合激活的自然殺傷(NK)細胞，其也用來殺滅受病毒感染的細胞，這些全部導致更強的免疫應答。因此，綴合物將產生細胞和體液應答，支持其在治療性和預防性疫苗中的功效。本領域技術人員可以以類似的方法來選擇用作對抗其它感染劑疫苗的綴合物的抗原成分，基于與這些感染劑相關的抗原。例如，與HIV相關的抗原包括HIV包膜gpl20抗原決定部位(例如，可變環，如V3)，或其它HIV蛋白，如Gag蛋白(Pr55gag、基質p17、衣殼p24、核衣殼p7)、p5;Pol(聚合酶)、Vif(病毒傳染力因子p23);Vpr(病毒蛋白Rpl5);Rev(病毒基因表達的調節劑pl9);Vpu(病毒蛋白U);Env(gpl60、gpl20、gp41);Tat(轉錄激活子pl4);和負效應物p24)。參見，例如，Peters，201.Vaccine2:688-705;Michael,2003,Clin.Med.3:269-72;Gandhi&Walker,2002,Ann.Rev.Med.53:149-72;Haseltine，1991,FASEB5:2349-60。疫苗中有用的其它抗原包括b型流感嗜血桿菌(//aewo//zz7/wz"/7wewzae)的莢膜多糖、腦膜炎奈瑟菌(A/e/Mename"/"g"z'(i^)的莢膜多糖、肺炎鏈球菌(5^e/7fococcwsp"ewwom.ae)的莢膜多糖、乙肝的表面抗原，以及失活的白喉外毒素和破傷風毒素。參照如上所述的流感抗原，根據本發明來使用這些抗原。結合對示例結合對是生物素和鏈霉抗生物素蛋白(SA)或抗生物素蛋白。還可以使用保持對生物素的基本結合活性的SA或抗生物素蛋白片段，如各自至少50%或更多天然SA或抗生物素蛋白的結合活性。這樣的片段包括"核心鏈霉抗生物素蛋白"("CSA"),全長鏈霉抗生物素蛋白多肽的截斷形式，其包括鏈霉抗生物素蛋白殘基13-138、14-138、13-139和14-139。參見，例如，Pahler等,J.Biol.Chem.1987.262:13933-37。還可以使用保持強烈結合生物素的其它鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的截斷形式。參見，例如，Sano等，JBiolChem.1995年11月24日，270(47):28204-09(描述了核心鏈霉抗生物素蛋白變體16-133和14-138)(U.S.專利no.6.022,951)。還可以使用保持基本生物素結合活性或提高的生物素結合活性的鏈霉抗生物素蛋白突變體和鏈霉抗生物素蛋白核心形式。參見，Chilcoti等,ProcNatlAcadSciUSA.1995Feb3828;92(5):1754-8;Reznik等，NatBiotechnol.1996年8月；14(8):1007-11。例如，可以使用具有降低免疫原性的突變體，如通過定點誘變除去潛在的T細胞抗原決定部位或淋巴細胞抗原決定部位突變的突變體。參見Meyer等，ProteinSci.200110:491-503。同樣，也可以使用保持基本生物素結合活性或提高的生物素結合活性的抗生物素蛋白的突變體和抗生物素蛋白的核心形式。參見，Hiller等，J.Biochem.(1991)278:573-85;Livnah等，ProcNatlAcadSciUSA(0:5076-80(1993)。為了方便，在此刻的描述中，如在此所用的術語"抗生物素蛋白"和"鏈霉抗生物素蛋白"包括這些結合對成員的生物素結合片段、突變體和核心形式。抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白可從商業供應商獲得。此外，可以找到編碼鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的核酸序列以及鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白氨基酸序列，例如，在GenBank登錄號No.X65082;X03591;NM—205320;X05343;Z21611和Z21554。如在此所用的"生物素"包括能夠結合表面如細胞表面(包括腫瘤細胞表面)的含生物素部分，如NHS-生物素和EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC曙生物素(Pierce)。這樣的生物素的蛋白反應性形式是可購得的。在本發明的范圍中，生物素及其結合伴侶抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白之間的相互作用賦予了幾個優勢。例如，生物素對于鏈霉抗生物素蛋白(10"M")和抗生物素蛋白(10"M—1)具有非常高的親和性。此外，鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白是各自結合四個生物素分子的四聚合多肽。因此，包括鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的免疫共刺激部分具有形成四聚物和高級結構的趨勢。因此，它們可以交聯其對應的免疫細胞受體，用于更有效的信號轉導，如通過受體的累積。本領域技術人員將認識到可以使用其它機理(例如，其它綴合方法，例如使用其它連接部分或化學或基因交聯)來提供免疫共刺激分子的高階結構，如包括免疫共刺激分子的二聚物、三聚物、四聚物和高階多聚物的綴合物，其同樣呈現出有利的特性。這樣的綴合物包括在本發明的范圍內。綴合物可以通過本領域公知的方法來形成包括免疫共刺激多肽、抗原或感染劑和結合對成員的綴合物。例如，可以將多肽/抗原/感染劑和結合個實施方案，多肽/抗原/感染劑和結合對成員是融合蛋白的成分。可以通過本領域已知的各種不同方法中的任一種來制備融合蛋白。例如，可以化學合成或使用公知的重組核酸技術產生融合蛋白的一種或多種成分多肽。(如在此所用的，"核酸"指的是RNA或DNA)。例如，可以使用聚合酶鏈式反應(PCR)來獲得本發明中有用的核酸序列。例如，各種PCR方法描述于尸C/尸〃mer爿Z^6orafo^yA/a"wa/(PCR引物實驗室手冊)，Dieffenbach7Dveksler編輯，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。根據一個實施方案，免疫共刺激多肽通過其C-端與結合對成員的N-端結合。例如，免疫共刺激多肽通過其C-端結合核心鏈霉抗生物素蛋白(CSA)的N-端。因此，本發明包括CD80-CSA融合蛋白，其中CD80部分通過其C-端結合CSA的N-端。根據另一個實施方案，免疫共刺激多肽通過其N-端與結合對成員的C-端結合。例如，免疫共刺激多肽通過其N-端結合CSA的C-端。例如，本發明包括CSA-4-lBBL、CSA-LIGHT、CSA-CD40L和CSA-OX40L融合蛋白，其中CSA部分通過其C-端結合免疫共刺激多肽的N-端。免疫共剌激多肽可以直接與結合對成員結合或通過一個或多個連接部分如一個或多個連接多肽與結合對成員結合。根據一個實施方案，將免疫共刺激多肽、抗原或感染劑生物素化。可以通過本領域已知的方法來形成生物素化的綴合物，并在以下的實施例中舉例說明。例如，可以使用來自Avidity,Inc.(Denver,CO)的生物素AviTag技術來產生生物素化的蛋白質或感染劑。生物素AviTag由獨特的15個氨基酸肽構成，該肽由生物素連接酶BirA識別，將生物素連接肽序列中的賴氨酸殘基。Schatz，1993,S/o^c/mo/ogy,11:1138-43。生物素AviTag可以在遺傳上與任何目標蛋白融合，使蛋白質受到生物素分子的才示"i己。生物素AviTag技術的一個潛在缺陷是低程度生物素化的可能性，因為系統在標記片段中的單個唯一賴氨酸殘基處生物素化蛋白質。為40了克服這樣的問題，可以使用純化的生物素連接酶在體外修飾純化的標記蛋白。因為是通過酶進行的生物素化，反應條件是比較溫和的，標記是高度特異性的，并且反應比使用生物素衍生物的蛋白質化學修飾更有效。或者，可以使用Jordan等，2003，Clin.Diag.Lab.Immunol.10:339-44中所述的方法來產生遺傳工程化的生物素化蛋白。免疫共刺激多肽、結合對成員、抗原或感染劑的片段在本發明中是有用的，只要片段保持參照的全長部分的活性。因此，例如，免疫共刺激多肽片段應當保持其免疫共刺激活性(例如，保持其結合其受體或配體的能力)，結合對成員片段應當保持其結合其結合伴侶的能的免疫應i-#力。可以J本領域的常規方J篩選保持活的^^段。以上列出了免疫共刺激多肽的示例性片段。綴合物可以在結合對成員和免疫共刺激多肽、抗原或感染劑之間包括連接物，如肽連接物。可以選擇連接物的長度和組成來增強綴合物的任一或兩個功能端的活性(例如，共刺激多肽/抗原、感染劑或結合對成員)。連接物通常為約3至約15個氨基酸長，更優選約5至約10個氨基酸長，然而，可以使用更短或更長的連接物，或可以全部分配連接物。在這點上，可以使用已經用來連接單鏈抗體的重鏈和輕鏈的彈性連接物(例如，(Gly4Ser)3)。參見，Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883;U.S.專利No.5,091,513,5,132,405,4,956,778;5,258,498和5,482,858。其它連接物是FENDAQAPKS或LQNDAQAPKS。免疫球蛋白Fc片段的一個或多個結構域(例如，CHl、CH2和/或CH3)也可以用作連接物。還可以使用化學連接物。修飾的、改變的或突變的核酸和多肽在本發明中也是有用的，只要它們保持參照核酸或多肽的活性。例如，適用于本發明的核酸和多肽序列與參照核酸或多肽，即，與編碼已知免疫共刺激多肽或結合對成員的核酸序列，具有至少約80%的序列同一性(包括至少80%的序列同一性)。在一些實施方案中，核酸序列或多肽與參照核酸或多肽具有至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%的序列同一性。本發明包括堿基改變"沉默"的核酸，因為它們編碼相同的氨基酸(即。簡并核酸序列)。本發明還包括編碼具有保守氨基酸置換的多肽的核酸，以及這樣的多肽。保守氨基酸置換(例如，用不同的疏水性殘基替代一個疏水性殘基)是本領域公知的并可以例如通過點突變等來實現。可以使用本領域已知的受體結合和/或生物篩選方法來證實給定的修飾序列、變體或突變體的適用性，如以上關于片段所述的那些方法。如在此所用的，通過測定比對的核酸或多肽序列中配對位置的數量，將配對位置的數量除以比對核苷酸或氨基酸各自的總數并乘以100來計算"％序列同一性"。配對的位置指的是在比對序列的相同位置出現相同核苷酸或氨基酸的位置。比對核苷酸或氨基酸的總數指的是比對第二個序列需要的核苷酸或氨基酸的最小數量，并不包括非同源序列的比對(例如，強迫的比對)，如可以在目標序列的N-端或C-端融合的那些序列(即，編碼免疫共刺激多肽或結合對成員的序列)。比對核苷酸或氨基酸的總數可以對應于完整的編碼序列，或可以對應于全長序列的片段，如在此所限定的。可以使用Altschul等(1997,NucleicAcidsRes.,25'.3389-3402)描述的算法來比對序列，因為引入了BLAST(基本局部比對搜索工具)程序中，在環球網的ncbi.nlm.hih.gov可獲得。可以進行BLAST搜索或比對來測定核酸分子("詢問序列")和任何其它序列或其片段之間的百分比序列同一性，使用Altschul算法。可以使用BLASTN來比對和比較核酸序列之間的同一性，而使用BLASTP來比對和比較氨基酸序列之間的同一性。使用BLAST程序計算編碼治療性多肽的核酸序列與另一個序列之間的百分比同一性時，可以使用各自程序的缺省參數，包括缺口懲罰的缺省。可以通過如DNA或RNA印跡分析(即，雜交)、PCR或原位雜交分析這樣的方法來檢測本發明的核酸。通常通過轉染細胞系中的免疫細胞化學或通過十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳接著考馬斯藍染色或蛋白質印跡分析來檢測多肽，使用具有特定多肽的特異性結合親和性的抗體(單克隆或多克隆)。這些方法中的許多更詳細地描述于Sambrook等(1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實馬t室手冊)，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。編碼免疫共刺激多肽和結合對成員的核酸序列可以在構建體中可操作地相互連接，使用常規的分子生物學技術。參見，例如，A/o/ecw/wC/謹'wg.'丄W固f"她畫/(分子克隆實驗室手冊)(Sambrook等,2001,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress)或幼oW尸rafocoAs,"Mo/ecw/w5zo/ogy(分子生物學的簡潔實馬全方案)(Ausubel等，2002,第5版，CurrentProtocols)。適用于這些方法中的構建體是可購得的并是本領域日常使用的。構建體可以包括表達需要的序列，如啟動子序列，調控序列，如增強子序列，和應答序列和/或可誘導的序列，調節核酸序列的表達。如在此所用的，"可操作地連接"指的是(i)以指導或調節核酸表達的方式相對于核酸序列來放置啟動子和/或其它調控序列；和/或(ii)放置編碼免疫共刺激多肽的核酸和編碼結合對成員的核酸，使得編碼序列"在框內"，即，使得構建體編碼包括免疫共刺激多肽和結合對成員的融合蛋白。可以通過本領域已知的方法將構建體繁殖或表達，以在宿主細胞內產生多肽。如在此所用的，術語"宿主"或"宿主細胞，，意思是不僅包括原核生物，如大腸桿菌，而且包括真核生物，如酵母、昆蟲、植物和動物細胞。動物細胞包括，例如，COS細胞和HeLa細胞。可以用DNA分子(例如，構建體)轉化或轉染宿主細胞，使用本領域技術人員公知的任一種技術，如磷酸鉤或醋酸鋰沉淀、電穿孔、脂轉染和微粒轟擊。含有本發明載體的宿主細胞可以用于如繁殖載體、生產核酸(例如，DNA或RNA)、表達免疫共刺激多肽或其片段或表達融合蛋白的目的，如上所述。圖1A&1B、2A&2B、3A&3B、4A&4B、5A&5B和7A&7B顯示了代表性的核酸序列(SEQIDNO.1、3、5、7、9&14),這些序列包括包含核心鏈霉抗生物素蛋白和免疫共刺激多肽的免疫共刺激部分的編碼序列，以及相應編碼的氨基酸序列(SEQIDNO.2、4、6、8、10&15)。免疫治療本發明的一個實施方案提供了產生或增強對抗第一抗原或感染劑的免疫應答的方法，通過將(a)第一綴合物和(b)笫二綴合物給予需要的患者，第一綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員，而第二綴合物包括(i)包括第一抗原或感染劑的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二43個成員的綴合物成員。在可替換的實施方案中，用第一和第二綴合物處理免疫細胞，然后給予患者。如上所述，可以使用任何免疫共刺激多肽和與腫瘤或感染劑相關的任何抗原(或感染劑自身)，同樣可以使用任何結合對。本發明包括使用嵌合共刺激分子，使用或不使用與目標抗原的綴合。在將綴合物直接給予患者的實施方案中，可以同時或在不同時間按次序給予第一綴合物和第二綴合物。在一個實施方案中，在給予患者之前，通過結合對成員的結合活性將綴合物結合在一起。例如，可以在體外混合第一和第二綴合物并在單個組合物中給予。在另一個實施方案中，首先給予第一綴合物，接著在足以使免疫共刺激多肽結合免疫細胞的時間后，給予第二綴合物。例如，時間段可以為一至幾小時，一天至數天，一周或更長。可以將第一或第二綴合物全身或局部給予患者，如通過靜脈內、鼻內、腹膜或皮下注射。在一個實施方案中，通過直接注射至腫瘤部位，如通過腫瘤內注射，或注射至局部感染部位，來局部給藥一個或多個組合物。在另一個實施方案中，通過不同的途徑來給藥一個或多個組合物。例如，可以局部給藥一個或多個組合物，而全身^^藥一個或多個組合物。在綴合物用來處理隨后直接給予患者的免疫細胞的實施方案中，用第一和第二綴合物同時或在不同的時間按次序處理免疫細胞。在一個實施方案中，在用于處理免疫細胞之前，第一和第二綴合物通過結合對成員的結合活性結合在一起。例如，可以將第一和第二綴合物混合在單個組合物中并用來在體外處理免疫細胞，如通過將免疫細胞接觸組合物。在另一個實施方案中，用第一綴合物處理免疫細胞，一段時間后用第二綴合物處理。該時間段，例如，為一至幾小時，一天至幾天，一周或更長時間。通過上述的任何方式將處理過的免疫細胞給予患者，包括全身或局部給藥，如腫瘤內注射或注射至局部感染的部位中。根據一個實施方案，該方法進一步包括給予第三綴合物或用第三綴合物來處理免疫細胞。在一個實施方案中，第三綴合物包括(i)包括免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括與肺瘤或感染劑相關的第二抗原或感染劑自身的綴合物成員。第三綴合物的免疫共刺激多肽可以與第一綴合物的免疫共刺激多肽相同或不同，第二抗原可以與第一抗原相同或不同。在該實施方案的特定方面，免疫共刺激多肽和第二抗原通過結合對成員與各自相連的免疫共刺激多肽和第二抗原的相互作用結合在一起。根據該實施方案，第三綴合物的第一個和第二個結合對成員可以與第一和第二綴合物的笫一個和第二個結合對成員相同或不同。在一個實施方案中，第一綴合物包括結合組成型受體的免疫共刺激多肽，如CD80、LIGHT和CD40L，而第三綴合物包括結合誘導型受體的免疫共刺激多肽，如4-lBBL和OX40L。以下的表7提供了組成型和誘導型共刺激分子的列表。表7組成型誘導型CD80畫CSACSA曙4-1BBLCSA-CD40LCSA-OX40LCSA隱LIGHTPD-L1-CSAGL50國CSA可以通過測定腫瘤細胞增殖和/或腫瘤大小的降低來測試癌癥免疫治療的功效。腫瘤細胞的數量不是靜止的，并且反應出經受細胞分裂的細胞數量和細胞死亡數量(例如，通過凋亡)。提高個體對抗腫瘤細胞的免疫應答可以抑制細胞的增殖。在此所用的腫瘤細胞的增殖指的是給定時間段內(例如，幾小時，幾天，幾周或幾個月)肺瘤細胞數量的增加(在體外或在體內)。可以通過胂瘤細胞增加速率的降低、肺瘤細胞的完全失去或其中增殖的任何降低來測量腫瘤細胞增殖的抑制。實體腫瘤大小的降低是腫瘤細胞增殖抑制的表征。通過免疫共刺激多肽(如4-lBBL)與其受體的相互作用，通過提供將TAA特異性靶向DC的能力，本發明賦予了超過現有癌癥疫苗的優勢。此外，本發明提供了可以通過注射給予患者并通過DC在體內吸收的疫苗，使得抗原遞呈和激活，而不需要DC的分離和exvivo操縱或使用基因治療。45可以通過測定患者的感染負荷，已經通過測定臨床終點，如發燒或腫脹，來測定免疫治療對抗傳染的功效。根據本發明的抗生物素蛋白/生物素結合對的使用(或提供高階免疫共刺激分子的其它機理)賦予了更多的優勢提供了四聚體結構(或其它多聚體結構)，該結構允許免疫共刺激受體交聯，用于更強的應答，并允許多個抗原分子傳送至DC。在一個實施方案中，結合對的第一個成員，即，第一綴合物(包括第一免疫共刺激多肽)的結合對成員是抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或核心鏈霉抗生物素蛋白，而結合對的第二個成員，即，第二綴合物的結合對成員(包括第一抗原或感染劑)是生物素。在另一個實施方案中，結合對的第一個成員是生物素，而結合對的第二個成員是抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或核心鏈霉抗生物素蛋白。將4-1BBL用作免疫共刺激多肽可以給予更多的優勢，因為用4-1BBL刺激DC顯示出使Treg細胞的抑制功能無效，Treg細胞在免疫系統的腫瘤逃避中起著主要作用。因此，本發明包括4-1BBL和TAA的綴合物將TAA傳送至DC,用于有效的遞呈，激活DC，用于產生各種細胞因子，并使Treg細胞的功能無效，同時加強Teff和NK細胞的功能，用于胂瘤根除。修飾的免疫細胞本發明還提供了可用于上述免疫治療方法中的修飾免疫細胞，及其制備方法。根據本發明的這個方面，提供了修飾免疫細胞來產生或增強對表達第一抗原相關抗原的腫瘤或對感染劑的免疫應答的方法。該方法包括將表達第一免疫共刺激多肽受體的免疫細胞接觸(a)第一綴合物和(b)第二綴合物，第一綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；第二綴合物包括(i)包括與肺瘤或感染劑相關的抗原或感染劑的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員。根據該方法，通過免疫共刺激多肽和受體之間的結合將第一綴合物與免疫細胞綴合，通過第一個和第二個結合對成員之間的結合將第二綴合物與免疫細胞綴合。可以通過任何方式將免疫細胞與第一和第二綴合物接觸，并可以在體內或在體外來實現這。例如，體內方法可以包括將第一和第二綴合物給予含有免疫細胞和含有腫瘤或感染劑或處于含有腫瘤或感染劑風險中的患者。根據該方法，可以基本上同時(在相同或分開的組合物中)或按次序(在分開的組合物中)來給予第一和第二綴合物。在患者含有腫瘤的一個實施方案中，通過腫瘤內注射來給予第一和第二綴合物中的至少一個。示例性的體外方法可以包括將免疫細胞在體外接觸第一和第二綴合物，如通過接觸包括第一和第二綴合物的單個組合物，或接觸各自包括第一和第二綴合物的第一個和第二個組合物。在單個組合物中提供綴合物時，它們可以通過組合物中提供的第一個和第二個結合對成員之間的結合而結合在一起。在本發明的這個方面中，可以使用任何免疫共刺激多肽、抗原或感染劑，以及結合對成員，包括上述的每一種。根據該方法可以修飾表達第一免疫共刺激多肽受體的任何免疫細胞。在一個實施方案中，免疫細胞是T細胞或嗜中性粒細胞。示例性T細胞包括CD4+細胞，CD8+細胞，自然殺傷細胞，單核細胞和樹突細胞。在本發明這個方面的更多實施方案中，免疫細胞包括第二免疫共刺激多肽的受體，并且該方法進一步包括將免疫細胞與笫三綴合物接觸，第三綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的第一綴合物成員和(ii)包括與腫瘤或感染劑相關的抗原(或感染劑自身)的第二綴合物成員。在這個實施方案中，第二免疫共刺激多肽可以和第一免疫共刺激多肽相同或不同，而第二抗原，如果存在，可以和第一抗原(如果存在)相同或不同。在另一個特定的實施方案中，第一和第二綴合物成員各自進一步包括第一個和第二個結合對成員。根據該實施方案，第三綴合物的第一個和第二個結合對成員與第一和第二綴合物的第一個和第二個結合對成員相同或不同。此外，第一綴合物成員可以通過第一個和第二個結合對成員之間的結合與第二綴合物成員結合。象如上所述的第一和第二綴合物一樣，第三綴合物可以含有任何免疫共刺激多肽、抗原或感染劑以及結合對成員，包括本文描述的任意那些。在相關方面中，本發明提供了通過該方法制得的免疫細胞群。與其它的免疫細胞接觸時，這樣的免疫細胞產生或增強對腫瘤的免疫應答。本發明還提供了表達第一免疫共刺激多肽受體的修飾免疫細胞，其中用(a)第一綴合物和(b)第二綴合物來修飾修飾的免疫細胞，第一綴合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；第二綴合物包括(i)包括第一抗原或感染劑的綴合物成員和(ii)包括結合對的第二個成員的綴合物成員。根據該實施方案，通過免疫共刺激多肽和受體之間的結合將第一綴合物與免疫細胞綴合，通過第一個和第二個結合對成員之間的結合將第二綴合物與免疫細胞綴合。按照上述的方法，在本發明的這個方面中，可以使用任何免疫共刺激多肽、抗原或感染劑，以及結合對成員，包括上述的每一種。此外，根據該方法，可以修飾表達第一免疫共刺激多肽受體的任何免疫細胞。在一個實施方案中，免疫細胞是T細胞或嗜中性粒細胞。示例性T細胞包括CD4+細胞、CD8+細胞、自然殺傷細胞、單核細胞和樹突細胞。免疫刺激部分本發明還提供了具有免疫刺激活性的免疫刺激部分。單獨給藥時，或用作佐劑結合抗原或其它免疫刺激劑給藥時，免疫刺激部分是有用的。例如，在疫苗、癌癥免疫治療以及基于免疫失調的治療中，免疫刺激部分是有用的。可以將免疫刺激部分配制于適用于給予動物的組合物中，并可以給予需要免疫刺激的動物，如接受疫苗、癌癥免疫治療或經受基于免疫失調治療的動物。根據一個實施方案，免疫刺激部分包括上述免疫共刺激多肽的任一種，如4-lBBL、CD86、ICOSL、PD國L1、PD國L2、B7畫H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。在另一個實施方案中，免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF和APRIL。再一個實施方案中，免疫共刺激多肽是4-lBBL。根據該實施方案的一個特定方面，免疫刺激部分進一步包括鏈霉抗生物素蛋白或核心鏈霉抗生物素蛋白。例如，免疫刺激部分可以是包括免疫刺激多肽和核心鏈霉抗生物素蛋白的綴合物或融合蛋白。在另一個實施方案中，免疫刺激部分基本上由免疫共刺激多肽和鏈霉抗生物素蛋白或核心鏈霉抗生物素蛋白構成。根據該實施方案，免疫刺激部分沒有包括，或沒有綴合或另外結合任何其它免疫刺激劑，如另一個免疫共刺激多肽或抗原。本發明還包括免疫刺激方法，包括將免疫刺激部分給予需要免疫刺激的患者。在該方法的一個實施方案中，免疫刺激部分包括免疫共刺激多肽和鏈霉抗生物素蛋白或核心鏈霉抗生物素蛋白。在另一個實施方案中，免疫刺激部分基本上由免疫共刺激多肽和鏈霉抗生物素蛋白或核心鏈霉抗生物素蛋白構成。在進一步的實施方案中，該方法進一步包括將抗原給予患者，與免疫刺激部分的給藥同時或按次序(之前或之后)。在同時給藥的一些實施方案中，在單個組合物中給藥免疫刺激部分和抗原，如包括免疫刺激部分和抗原的混合物。在同時給藥的其它實施方案中，在分開的組合物給藥免疫刺激部分和抗原。在一些實施方案中，作為上述的含抗原綴合物來給予抗原，如包括抗原和結合對成員的綴合物。在其它實施方案中，沒有作為包括結合對成員的綴合物來給予抗原。免疫刺激方法的另一個實施方案基本上由給予免疫刺激部分構成，免疫刺激部分基本上由免疫共刺激多肽和鏈霉抗生物素蛋白或核心鏈霉抗生物素蛋白構成。根據該實施方案，沒有給予其它將與免疫刺激部分綴合或另外結合的免疫刺激劑，如另一個免疫共刺激多肽或抗原。因此，例如，沒有給予生物素化的分子，如生物素化的細胞或包括生物素的蛋白質綴合物。盡管不希望受到任何理論的束縛，認為本發明的免疫刺激部分刺激了細胞表面免疫受體及其配體之間的相互作用，因此促進了體液和細胞免疫應答。包括鏈霉抗生物素蛋白(或核心鏈霉抗生物素蛋白)的免疫刺激部分形成穩定的四聚體飽和寡聚物，其有效地結合受體并刺激B細胞、單核細胞和樹突細胞，用于產生細胞因子、趨化因子和上調免疫刺激分子。以下的實施例更詳細地說明了本發明，并且不是用來限制本發明任何方面的范圍。實施例實驗方法動物。成年近交BALB/c(H-2d)和C57B/6小鼠購自JacksonLaboratories(BarHarbor,Maine)。TCR轉基因OT-I、DOll.lO、C57BL/6.SJL動物購自Taconics(Germantown，NY)并依據NIH指導來伺養。表達OVA的A20細胞的建立。OVA構建體獲自劉易斯威爾大學的Dr.TomMitchell并直接克隆至用BglII和EcoRI限制的pcDNA3載體中(Invitrogen,SanDiego,CA)。細菌轉化并在氨千青霉素培養基上選擇后，將幾個克隆接受迷你質粒制備并用BglII/EcoRI消化來鑒定陽性克隆。然后將含有插入片段的克隆用于大的質粒制備，并根據制造商的說明使用Lipofectamine2000(Invitrogen)試劑盒轉染至A20細胞中。在含有G418(Genetidn)的培養基中選擇細胞并使用蛋白質印跡、對抗OVA的抗體或T細胞增殖測試來測定OVA的表達。TC-l可移植宮頸癌才莫型的建立。在C57BL/6小鼠中建立TC-l腫瘤;f莫型。通過用HPV-16E6和E7以及激活的ras致癌基因共轉化初級C57BL/6小鼠肺上皮細胞來產生致腫瘤的TC-l細胞系，并已經表征為人宮頸癌的模型。TC-l細胞在同系C57BL/6小鼠中形成腫瘤。為了建立模型，將1"05個腫瘤細胞移植至C57BL/6小鼠的右側，并監控動物的腫瘤生長。使用昆蟲DES表達系統的重組4-1BBL的表達和純化。按照Singh等，2003,Owe"Tm.63:4067-73中所述的使用果蠅DES表達系統(Invitrogen;Carlsbad,CA)來建立表達4-1BBL的穩定轉化子。在設定為25。C和105rpm的培養箱搖瓶中，在補充ImM石危酸銅的果蠅無血清培養基(Gibco;Carlsbad,CA)中誘導轉化子的重組蛋白表達72小時。通過離心收集培養物上清液并接受大規模純化，使用鈷(n)-羧甲基天冬氨酸鹽交聯的瓊脂糖固定的金屬親和性樹脂(BD-Talon,BDBiosciences)或Ni-NTA金屬親和性樹脂(Qiagen),利用6x-His-標記物工程化至蛋白質中。簡而言之，通過逐滴加入95%乙醇產生10%乙醇的終濃度，來沉淀含有4-1BBL的培養基，在4。C過夜孵育后，將沉淀的4-lBBL重新溶解于1/10的體積中，使用結合緩沖液(50mM磷酸鈉pH7.0;500mM50氯化鈉；0.5%吐溫-20;1%甘油；5mM2-巰基乙醇)。使用5x凝膠床體積的結合緩沖液來平衡金屬親和性樹脂，加入含有4-1BBL的重新溶解的蛋白質溶液，并用顛倒旋轉在室溫孵育45分鐘。用50-100ml洗滌緩沖液(50mM磷酸鈉pH7.0;500mM氯化鈉)將結合4-lBBL的金屬親和性樹脂洗滌2次。用2x凝膠床體積的洗脫緩沖液(50mM磷酸鈉pH7.0;500mM氯化鈉，150mM咪唑)從金屬親和性樹脂洗脫結合的4國1BBL。合并純化的4-1BBL洗出液并裝栽于AmiconUltra(Millipore;Bedford,Mass)離心過濾裝置中，使用30kD分子量截留膜。將離心過濾裝置在3000rpm(2000xg)4。C離心15分鐘。將無菌PBS加入截留物中，并將濾器在3000rpm(2000xg)再次離心。從離心過濾裝置中吸出濃縮/脫鹽的4-1BBL的截留物，置于無菌低溫小瓶中，并儲存在液氮中。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分離蛋白的純度。根據制造商的說明使用BCA蛋白測定(Pierce)來測定蛋白質濃度。生物素化的OVA的表達和純化。將上述的OVA構建體亞克隆至來自Avidity,Inc.(Denver,CO)的pAN和pAC載體中，用來各自表達N-端以及C-端AviTag-蛋白質融合體。細菌轉化并在氨千青霉素培養基上選擇后，將幾個克隆接受最小質粒制備并用合適的限制酶消化來鑒定陽性克隆。將含有插入片段的克隆用于大的質粒制備。將質粒用于轉化AVB100大腸桿菌，這是具有穩定整合至染色體中的h>v4連接酶基因的菌林。用L-阿拉伯糖誘導蛋白質表達，L-阿拉伯糖用于帶有生物素標記物的OVA的高水平表達。使用AviTag抗體瓊脂糖純化所表達的蛋白質。使用蛋白質印跡測定純化OVA的濃度、內毒素水平和生物素化，并將堿性磷酸酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白用于探測。如果需要，使用Detoxi-凝膠內毒素去除試劑盒(Pierce)除去內毒素。將生物素化的OVA綴合CSA-4-lBBL融合蛋白，并在體內增殖測試中使用OT-ITCR轉基因細胞來測試，如下所述。將蛋白質等分并在-70。C直至使用。增殖測試。對于體內增殖測試，從OT-I(OVA257-264/Kb)TCR轉基因動物收集脾臟和淋巴結細胞。用5itiMCFSE(羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯)標記細胞并通過尾靜脈注射將一百萬個CFSE-標記的細胞轉移至CD45.1+致癌B6-SJL小鼠中。24小時后，用單獨的10貼51OVA,與CSA或CSA-4-1BBL混合的OVA或綴合CSA或CSA-4-1BBL的OVA激發動物。3天后收集脾臟和淋巴結細胞，并通過淋巴結gate中的CD8+CD45.r(OT-1)細胞群中的CFSE稀釋分析來測定增殖。將從沒有接受OVA蛋白的一些動物收集的細胞用來測定親本群體，用于分析。如下進行體外增殖測試將來自BALB/c小鼠的CFSE標記的DO11.10(OVA323.339/I-Ad)TCR轉基因細胞用作應答劑，以不同的比例來對抗照射過的表達OVA的A20轉染子，持續3天。收集培養物并在流式細胞術中分析增殖。流式細胞術。使用標準程序進行流式細胞分析，首先滴定目標一抗和二抗，然后在流式細胞術使用最佳濃度。參見，例如，Mhoyan等，1997,rra"5//a^a"ow64:1665-70。同型匹配的抗體用作負對照。將樣品在FACSCalibur或VantageSorter(BectonDickinson;MountainView,CA)上運行，并使用FlowJo軟件(TreeSoft)進行分析。免疫治療。如下進行接種。簡而言之，以各種摩爾比將CSA-4-1BBL融合蛋白與PBS中的生物素化OVA混合，然后通過腹膜內注射至BALB/c小鼠中，用于預接種，或用于免疫治療，注射至已經在側面皮下接種致死量的活A20(lxlO6)細胞的動物中。對照包括沒有接種的動物或接種對照蛋白的那些。一旦檢測到，使用卡尺每隔一天測量肺瘤并作為最長直徑和垂直直徑的平均值士標準誤差來報告。當腫瘤大小達到大約20mm直徑時，將動物麻醉，以避免不舒服。統計學。使用Kaplan-Meier曲線估算處理對胂瘤存活的作用。使用對數級4企-驗(Savage/MantelCox概括的)測定不同組之間的存活差異。涉及來自各自動物組實驗數據比較的程序與使用F檢驗(兩組)或Levene，s檢驗(多組)檢測的變化相等。如果變化不相等，進行對數變換。當比較正常分布的樣品平均值時，使用Student'st檢驗(兩組)或Newman-Keuls檢驗(多組)。當數據沒有正常分布時，使用Mann-WhitneyU檢驗(兩組)或Kruskal-Wallis檢驗(多組)。將統計學差異定義為P<0.05。實施例1:CSA-4-lBBL擴大了同種抗原產生的應答如上所述，4-lBBL在獲得性和先天性免疫應答調節中起著重要作52用。4-lBBL作為共刺激分子，用于激活CD4+和CD8+T細胞、NK細胞和DC，并抑制Treg細胞的抑制功能。因此，該分子可以用作產生有效腫瘤應答的特定佐劑，用于癌癥治療。由于核心鏈霉抗生物素蛋白部分的存在，CSA-4-1BBL融合蛋白形成四聚/寡聚結構，并且是可溶性的分子。使用同種抗原混合淋巴細胞反應(MLR)證明了CSA-4-1BBL對T細胞應答的免疫刺激活性，如下所述。在CSA-4-1BBL的存在或不存在下，將C57BL/6小鼠淋巴結細胞用作對抗BALB/c照射過的脾細胞的應答劑。在培養階段的最后18小時，用卩H]胸腺嘧咬核香標記培養物，并測定增殖。與對照比較，補充CSA-4-1BBL的培養物顯示出有效的增殖活性(圖8)。實施例2:CSA-4-1BBL提高了T細胞增殖為了測定4-l-BBL融合蛋白與對抗4-1BB的單克隆抗體的相對活性，在增殖測試中，在各種含量的4-1BBL融合蛋白和抗體的存在下，用次佳濃度的抗-CD3抗體將通過流式細胞術分選的CD4+和CD8+T細胞多克隆刺激。融合蛋白對T細胞增殖的活性比抗體高70-倍(圖9)。因為該抗體Ab已經顯示出在癌癥免疫治療的動物模型中具有有效的活性。參見，例如，Melero等，1998,CellImmunol.190:167-72;Melero等，1997Nat.Med.3:682-85,該數據表明CSA-4-1BBL融合蛋白將是癌癥疫苗的有用成分，作為佐劑或作為將TAA傳送至DC的載體。實施例3:生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物對CD8+T細胞的作用使用可購得的試劑盒(PierceBiotechnology,Rockford,IL)將卵清蛋白肽(OVA)生物素化。將生物素化的OVA在體外與CSA-4-1BBL融合蛋白以不同的比例預先混合，用于綴合，并將一百萬個OT-IT細胞在腹膜內注射至獲得性轉移的天然C58BL/6.SJL動物中。具體地，用CFSE標記一百萬個OT-ICD8+T細胞并轉移至B6.SJL小鼠中，該小鼠用生物素化的卵清蛋白(10itig/注射)("OVA")和與生物素化的OVA混合的CSA-4-lBBL(1嗎/注射)("41BBL+OVA")或綴合的OVA-生物素/CSA-4-lBBL("41BBL-OVA")免疫。(圖10)圖10的最后一張圖("41BBL-0VA，，)顯示了對5|ng綴合lOpg生物素化的OVA的CSA-4-1BBL的應答。為了對照，以與CSA-4-1BBL等摩爾水平來使用核心鏈霉抗生物素蛋白("SA，，)。如圖10中所示的，與對照"SA/OVA"綴合物(33.6%)或未綴合的單個蛋白質"41BBL+OVA"(35.5%)相比較，4-1BBL/OVA綴合物在OT-l細胞中產生了有效的(73.5%)增殖應答。增殖應答是劑量依賴性的，因為5ing劑量的CSA-4-1BBL比lpg劑量(73.5%)產生了更高的應答(94.5%)。該實施例顯示了CSA-4-1BBL融合蛋白提高了抗原特異性CD8+T細胞的增殖應答，表明4-lBBL-CSA/生物素化的抗原構建體可以成功地將抗原傳送至專門的APC并激活這些細胞，用于產生有效的免疫應答。實施例4:CSA-4-lBBL將抗原傳送至DC該實施例證明了CSA-41BBL有效地將抗原傳送至DC。生物素化的PE用作熒光抗原。用250ngCSA-41BBL在水上與生物素化的PE(250ng)綴合30分鐘。用生物素化的PE(250ng/ml)或生物素化的PE/CSA-41BBL綴合物將JawII樹突細胞(5"05/孔)培養16小時。使用流式細胞術檢測PE的水平。圖IIA是顯示PE+細胞的柱狀圖。灰色填充部分表示未處理的細胞，黑色虛線表示用生物素化PE處理的細胞，而黑線表示用生物素化PE/CSA-41BBL綴合物處理的細胞。圖11B顯示了每個處理的PE平均熒光強度(MFI),并且證明了綴合物處理過的細胞呈現出顯著更高的應答。實施例5:CSA-4-1BBL激活DC該實施例證明了4-1BBL激活樹突細胞。JawII樹突細胞(5xl05/孔)未處理，或用5|tig/mlCSA-41BBL綴合物或5pg/ml脂多糖(LPS)在5ng/mlGM-CSF存在下在24-孔平板中處理48小時。使用流式細胞術分析CD86和II類MHC水平，如圖12A中所示的。右側灰色填充部分表示同型處理的細胞，黑灰色填充的表示未處理的細胞，黑線表示CSA-4-1BBL處理的細胞，而虛線表示LPS處理的細胞。圖12B顯示了CD86和II類MHC的平均焚光強度(MFI)，并證明了CSA-4-1BBL處理的細胞呈現出顯著更高的應答。實施例6:CSA-4-lBBL將抗原傳送至DC并在體內激活DC該實施例證明了CSA-4-1BBL將生物素化的抗原傳送至樹突細胞并驅動這些細胞在體內激活。將生物素化的OVA接觸CSA-41BBL來產生生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物。將綴合物或生物素化的OVA/CSA綴合物靜脈內注射至天然C57BL/6小鼠中。24小時后，將動物麻醉并收集脾細胞。使用流式細胞術分析CDllc+細胞群中的樹突細胞激活。測定來自天然、生物素化OVA-SA處理的和生物素化OVA/CSA-41-BBL處理的動物的樹突細胞上的CD40、CD86和II類MHC表達的平均焚光強度(MFI)，如圖13所示的。該圖證明了生物素化的OVA/CSA-41-BBL處理過的動物呈現出顯著更高的應答。實施例7:CSA-4-1BBL中和Treg細胞的抑制功能如上所述，天然產生的CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞組成型地表達4-1BB受體，因此，應答4-lBBL刺激。以下的實施例證明了Treg細胞上4-1BBL融合蛋白的刺激活性。使用流動分選分離CD4+CD25，eff細胞和CD4+CD25+Treg細胞，以1:1比例在照射過的同系細胞和抗CD3抗體的存在下培養。為了區分CD4+CD25+(DP)對CD4+CD25-(SP)T細胞在共培養實驗中的增殖，用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE,MolecularProbes,OR)將CD4+CD25-染色并用于抑制測試中。簡而言之，用PBS洗滌細胞，在4ml2.5jiMCFSE/lxl(^細胞中(當較少量的細胞得到標記時，保持該比例)在室溫孵育7分鐘。然后將細胞在兩體積的肽牛血清中孵育1分鐘，并用PBS洗滌2次來確保除去所有過量的CFSE。使用流式細胞術測定增殖。Treg細胞沒有應答抗CD3刺激，因為它們是無反應力的，但顯示出應答4-1BBL的適度增殖(圖15)。特別地，Treg細胞抑制Teff細胞的增殖應答，這是通過加入4-lBBL可以逆轉的一種作用。這與4吏用天然Treg細胞的數據相一致，其中通過CSA-4-1BBL的存在抵消了擴大細^^的抑制作用。這些數據證實了4-1BBL的免疫調節作用，及其用于癌癥免疫治療的用途。例如，4-1BBL融合蛋白加強了Teff功能，而下調了Treg細胞的抑制功能，用于更強有力的抗腫瘤免疫應答。實施例8:4-lBBL的雙重作用4-1BB/4-1BBL介導的信號在調節Treg功能中的作用是最近兩個研究的主題，具有相反的發現。盡管一個研究證明了4-1BB信號抵消Treg細胞的抑制作用，Chol等,2004,/歷o/.75:785-91,而另一個研究則報道了4-lBB信號介導Treg增殖，對其抑制功能沒有顯著作用，Zheng等,2004，J.Immonul.173:2428-34。為了澄清這種矛盾，使用CSA-4-lBBL融合蛋白來研究4-lBB信號在Treg功能中的作用。從天然BALB/c小鼠的脾臟和外周淋巴結分選CD4+CD25-(單陽性；SP)和€04+0025+(雙陽性；DP)T細胞，并單獨或以1:的比例培養3天。將培養物補充照射過的脾細胞，抗CD3抗體(0.5pg/ml),4-1BBL的濃度(pig/ml)或等量的對照CSA蛋白顯示于圖14A中。在共培養實驗中，使用流式細胞分選從天然BALB/c小鼠純化的CD4+CD25+雙陽性(DP)T細胞顯著抑制了由抗體對抗CD3誘導的單陽性(SP)CD4+CD25Teff細胞的增殖應答。通過給培養物補充lpg/mlCSA-4-lBBL有效而特異性地逆轉了該抑制作用，但沒有使用等摩爾水平的對照CSA。為了測試所觀察到的由CSA-4-1BBL融合蛋白引起的抑制逆轉是否是由于SP細胞的增殖應答的恢復引起的，用CFSE標記SP細胞，并在CSA-4-1BBL(0.5pg/ml)或用作對照蛋白的CSA存在下用于共培養實驗中。CSA-4-lBBL將SP的增殖從對照的44%和CSA蛋白的46%提高至DP細胞的60%,顯著降低了SPT細胞(16%)的增殖，這通過4-lBBL得到顯著恢復(34%),但CSA對照蛋白沒有(17%)。(圖14B)這些數據證明了4-1BBL融合蛋白下調了Treg細胞的抑制功能。因此，我們的工作表明了CSA-4-1BBL融合蛋白對Treg細胞呈現出兩種相反的活性。一方面，它與抗CD3抗體和IL-2協同作用來促進Treg細胞擴大。另一方面，它阻斷天然和激活的Treg細胞的抑制功能，不僅是在Treg細胞接觸4-1BBL融合蛋白時，因為從培養基將其除去導致了抑制功能的恢復。4-1BBL這后一種作用在使用Treg細胞作為免疫逃避機制的肺瘤和感染的范圍中具有一定的意義。實施例9:抗原-4-l-BBL綴合物作為癌癥疫苗的用途(a)表達作為可溶性蛋白的OVA的A20轉染子的產生。根據制造商(Invitrogen)的實驗方案使用LipofectamineTM2000試劑盒將上述的OVA構建體轉染至A20細胞中。在G418選擇培養基中選擇穩定的轉染子，在單細胞水平克隆，并使用蛋白質印跡測試OVA的表達。將具有顯著水平的OVA表達的克隆作為CFSE增殖測試中OVA肽特異性的DOll.lOCD4+T細胞的刺激劑，如參照以上的圖10所述的。一旦證實了對于OVA表達是陽性的，將一百萬個活的A20細胞皮下注射至BALB/c小鼠的右側中。每隔一天監控動物的肺瘤產生和存活，并當腫瘤直徑達到20mm大小時，將動物麻醉。將接種親本A20細胞的動物作為胂瘤生長的對照。當注射至同系BALB/c小鼠中時，表達OVA的A20細胞轉染子將形成肺瘤。(b)使用昆蟲DES系統產生CSA-4-1BBL融合蛋白。使用DES表達系統(Invitrogen)和我們建立的實驗方案制備CSA-4國1BBL蛋白。參見，例如,Singh等,2003,CancerRes.63:4067-73;Yolcu等，2002，Immunity17:795-808。使用固定化金屬基親和性色譜純化融合蛋白，利用工程化至CSA-4-1BBL融合蛋白之后呢單個6XHis標記物。將蛋白質脫鹽，通過超濾濃縮，并通過SDS-PAGE分析純度。使用二辛可寧酸(BCA)測試(Pierce)測定蛋白質制劑的濃度，并使用來自Cambrex的QCL-1000ChromogenicLAL終點測試來檢測內毒素的存在。(c)OVA的生物素化根據制造商(MolecularProbes,SanDiego,CA)的實驗方案使用DSB-X生物素標記試劑盒將馬來酰亞胺激活的無內毒素的雞OVA(Pierce)生物素化。在PBS中徹底滲析后，使用蛋白質印跡測定生物素化OVA的濃度、內毒素水平和生物素化，并將綴合堿性磷酸酶的鏈霉抗生物素蛋白用于探測。如果需要，使用Detoxi-凝膠內毒素去除試劑盒(Pierce)除去內毒素。將生物素化的OVA綴合CSA-4-1BBL融合蛋白。將蛋白綴合物等分，并冷凍于-8(TC,直至使用。(d)生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物作為癌癥疫苗的用途將CSA-4-lBBL和生物素化的OVA在PBS中以不同的摩爾比預先混合，如l:1、1:5、1:10、5:1和10:1的4-1BBL:OVA,并以不同劑量(如10、50和100|LigOVA)以每周三次的間隔通過腹膜內注射至一組BALB/c小鼠中。注射綴合鏈霉抗生物素蛋白的生物素化OVA,生物素化的OVA單獨或混合CSA-4-1BBL的未生物素化的OVA動物用作對照。用1百萬個活的A20胂瘤細胞在右側皮下激發動物，每隔一天監控胂瘤產生和存活，并在腫瘤直徑達到20mm大小時，將動物麻醉。用生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物接種將產生有效的抗肺瘤免疫應答，使得預防腫瘤生長。用未綴合的4-1BBL和OVA接種也可以產生應答，但任何這樣的應答將小于抗原/4-lBBL綴合物產生的。用單獨的OVA或CSA-OVA接種只產生最小的應答，因此在預防腫瘤生長中應該是無效的。實施例10:用抗原-4-lBBL綴合物的早期/后期接種如上所述，腫瘤通過隨著肺瘤生長過程產生的各種機制來逃避免疫系統。在還沒有建立逃避機制時，通過與腫瘤激發同時接種動物來證明本發明的綴合物在腫瘤進展早期的功效。一旦已經建立腫瘤并且已經完全產生免疫逃避機制，通過接種動物來證明本發明的綴合物對抗已建立肺瘤的功效。(a)在腫瘤進展早期的功效用一百萬個活的A20細胞在右側激發BALB/c小鼠，同時在腹膜內接種生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物。一周重復接種抗原/4-1BBL綴合物一次，持續四周，到該時間，對照動物中的腫瘤直徑將達到10-15mm大小。未操縱的動物和接種CSA-OVA綴合物的動物將作為對照。58(b)對抗已建立肺瘤的功效在右側將BALB/c小鼠皮下接種1百萬個活的A20腫瘤細胞。監控動物的腫瘤產生，并且當腫瘤達到直徑4-6mm大小時，接種生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物。接種實驗方胺最初將涉及每周腹膜內注射，直至腫瘤小鼠或達到直徑20mm的大小。在腫瘤消失后60天用2百萬個活的A20細胞激發有效根除其腫瘤的動物，用來測試記憶應答。盡管不希望受到任何理論的限制，在腫瘤進展早期給予時，與一旦建立了腫瘤的給藥相比較，本發明的抗原/4-lBBL綴合物在預防腫瘤生長中具有更高的功效，這是由于在腫瘤進展過程的早期缺少各種抑制機制。盡管如此，由于抗原對DC的特異性靶向，用于有效的抗原遞呈，DC的激活，用于產生危險信號(佐劑作用)以及下調Treg細胞的抑制功能，抗原/4-lBBL綴合物在根除已建立的腫瘤中顯示出功效。除了對DC的間接作用，通過結合激活T和NK細胞上的4-1BB受體，導致它們強有力的增殖、存活和記憶T細胞功能，重復注射疫苗可以進一步加強免疫系統。實施例11:抗原-4-lBBL綴合物通過旁觀者作用的功效。以下的實施例將證明生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物產生了對抗未確定的A20腫瘤抗原(而不是OVA)的免疫應答，通過旁觀者作用或抗原決定部位擴展。將BALB/c動物在右側接種表達OVA的A20,在左側接種親本未修飾的A20細胞。一旦可摸出肺瘤，將動物接種生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物。按照上述的接種時間表，但也可以按照需要來改變以提高功效。監控動物中兩種胂瘤類型的生長。或者，在根除表達OVA的A20腫瘤后60天，在對側用2百萬個親本A20細胞皮下激發動物，該動物在接種生物化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物后已經成功根除了腫瘤(如以上的實施例)。生物素化的OVA/CSA-4-1BBL綴合物疫苗將顯示出對抗缺乏作為TAA的OVA的親本A20腫瘤的功效。例如，對抗OVA的有效免疫應答將導致腫瘤的殺滅，腫瘤抗原的脫落，并通過APC捕獲和遞呈，用于產生對抗新一組TAA的T細力包應答。可以通過產生的對抗A20-OVA59腫瘤的旁觀者作用來進一步促進親本腫瘤的根除。實施例12:使用細菌表達系統產生生物素化的抗原。在一些情況中，有利的是在遺傳上產生生物素化的抗原，用作本發明疫苗的抗原成分。在這點上，可以使用Avidity,Inc.(Denver,CO)的生物素AviTag技術。生物素AviTag由唯一的15個氨基酸肽構成，該肽由生物素連接酶BirA識別，生物素酶連接生物素與肽序列中的賴氨酸殘基。生物素AviTag可以在遺傳上融合至任何目標蛋白，使得可以用生物素分子標記蛋白質。將編碼OVA的cDNA亞克隆至pAN和pAC載體中，以各自表達N-端以及C-端AviTag-蛋白融合體。用穩定整合至染色體中的基因轉化AVB100大腸桿菌，并用L-阿拉伯糖誘導，用于高水平表達攜帶生物素標記物的OVA。使用AviTag抗體瓊脂糖純化所表達的蛋白。使用BCA試劑盒、QCL-1000ChromogenicLAL試劑盒和用綴合堿性磷酸酶的鏈霉抗生物素蛋白作探針的蛋白質印跡測定純化OVA的濃度、內毒素水平和生物素化。如果需要，使用Detoxi-凝膠內毒素去除試劑盒(Pierce)來除去內毒素。如上所述，將生物素化的OVA與CSA-4-lBBL綴合。將蛋白質綴合物等分并在-8(TC冷凍，直至使用。實施例13:包括TERT和Survivin的抗原/4-lBBL綴合物的用途以上舉例的生物素化抗原/CSA-4-1BBL綴合物和生物素化的OVA/CSA-4-1BBL可以與任何抗原用于任何疫苗情況中。在癌癥疫苗的范圍中，兩種通用人TAA,末端酶逆轉錄酶和survivin,可以是本發明的生物素化抗原/CSA-4-1BBL綴合物的有利抗原成分。實施例14:E7/4-lBBL綴合物如上所述，包括人乳頭狀瘤病毒E7抗原作為抗原成分的本發明的綴合物在對抗宮頸癌中是有用的。該實施例涉及本發明的這個特定實施方案。(a)生物素化的HPV-16E7的產生將生物素化的E7用作綴合物的抗原成分，該綴合物根據本發明用作HPV疫苗。在一個實施方案中，全長E7蛋白提供了最大數量的抗原決定部位。使用來自TC-1細胞的總RNA通過RT-PCR克隆編碼全長HPV-16E7的cDNA。證實序列后，將cDNA在具有6X-His標記物的框內亞克隆至pMIB/V5-His載體(Invitrogen)中，用于在DES系統中組成型表達和分泌。如上所述使用金屬親和性樹脂純化分泌的蛋白。按照制造商的實驗方案(Pierce)使用EZ-LinkSulfo-NHS-LC-生物素在體外將純化的E7生物素化。簡而言之，將純化的濃縮E7在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中緩沖交換，并在室溫用EZ-LinkSulfo-NHS-LC-生物素孵育1消失。使用切線流過濾(SpectrumLabs,NJ)除去未綴合的生物素。(b)E7/4-1BBL綴合物的產生按照上述的一般程序，使用生物素化的E7和CSA-4-1BBL融合蛋白產生包括E7和4-1BBL的綴合物。為了比較，如下產生E7/4-1BBL融合蛋白。將編碼E7和4-1BBL的cDNA在具有6X-His標記物的框內亞克隆至pMIB/V5-His載體(Invitrogen)中，用于在DES系統中組成型表達和分泌，并將蛋白表達和純化，如上所述。(c)E7/4-1BBL綴合物的結合活性如下測定E7/4-lBBL綴合物的生物素結合和4-lBB受體結合活性。對于生物素結合，將TC-1細胞生物素化并在冰上用PBS中的CSA-4-1BBL(100ng/106細胞)孵育。用PBS將細胞徹底洗滌，用焚光染料標記的抗4-lBBL的抗體來染色，并使用流式細胞術來分析。綴合CSA的生物素化細胞用作對照。為了測試綴合物或融合蛋白與激活T細胞上的4-1BB受體的結合，用5|iig/ml的伴刀豆球蛋白(ConA)將來自C57BL/B6小鼠的脾細胞激活36h,用PBS洗滌并用在水上用各種濃度的綴合物或融合蛋白孵育。將細胞徹底洗滌，并用合適的熒光染料標記的4-lBBL、核心鏈霉抗生物素蛋白或E7的抗體來染色，并在流式細胞術中分析。使用1:4比例(CSA-4-1BBL:E7)通過第一個形成綴合物來測定CSA-4-1BBL綴合物與生物素化E7的結合，接著CSA-生物素結合的化學計算，然后在夾層ELISA中測試綴合物。簡而言之，將綴合的蛋白結合覆蓋抗E7抗體的96-孔平板，洗滌，然后用反應性抗-鏈霉抗生物素蛋白抗體孵育，來測量存在的E7/4-1BBL復合物的含量。證實綴合物的形成后，測試它們結合激活T細胞上4-1BB受體的能力，如上所述。實施例15:通過E7/4-lBBL綴合物誘導的免疫應答(a)劑量的最佳化可以如下測定包括E7/4-lBBL綴合物的疫苗的最佳劑量。使用1、10或50pg生物素化的E7,通過以兩個比例(如1:4和1:8的CSA-4-1BBL:E7)混合生物素化的E7和CSA-4-1BBL來形成包括生物素化E7和CSA-4-1BBL的綴合物。還使用了相當量的對照未生物素化的E7。(這些E7劑量是基于證明了接種50pgE7能有效產生對抗TC-1細胞的保護性免疫應答的研究)。通過在各種實驗方案下，如以下所述的那些，測定對疫苗的免疫應答，可以測定4-lBBL:E7的最佳比例和抗原的最佳含量，并通過實驗來調節。(b)四聚物分析對于CD8+T細胞的擴大，四聚物染色可以測定疫苗功效。給C57BL/6雌性小鼠腹膜內注射上述PBS中的疫苗制劑。注射PBS、CSA-4-lBBL、CSA-4-lBBL+未生物素化的E7或E7-4-1BBL融合蛋白的小鼠作為對照。IO天后，腹膜內給予第二次相等的劑量，并在最后一次接種后三天，收集脾細胞，并使用四聚物技術和流式細胞術定量E7-特異性CD8+T細胞的數量。簡而言之，用FITC-抗-CD8抗體標記來自免疫動物的脾細胞，并用E7的免疫顯性抗原決定部位(肽49-57(RAHYNIVTF))標記I類MHCH-2Db的PE-四聚物。(四聚物可以獲自NationalInstitutesofHealthTetramerFacility(Atlanta,GA))。裝載仙臺病毒核蛋白324-332肽(FAPGNYPAL)的I類H-2Db分子用作負對照。染色后，通過流式細胞術來分析細胞，以定量對四聚物陽性的CD8+T細胞的百分比。(c)胞內IFN-y分析疫苗誘導的CD8+T細胞對于IFN-y(效應CD8+T細胞的信號細胞因子)表達的表征使得可以測定T細胞的功能。將雌性C57BL/6腹膜內注射最佳劑量的生物素化E7/CSA-4-1BBL綴合物疫苗(如上所述測定的)，并在10天后，收集來自免疫動物的脾細胞，并與表達E7的照射過的TC-1細胞共培養5天，然后補充Golgi轉運抑制劑布雷菲德菌素A過夜。使用Ficoll梯度收集活細胞并用抗鼠Fcy受體抗體(來自美國典型培養物中心的2.4G2)孵育一小時，接著用FITC標記的抗-CD8抗體染色。然后將細胞固定、滲透、對于PE標記的抗IFN-y抗體(Pharmingen)染色并通過流式細胞術分析。用同型抗體染色的細胞用作對照。來自用PBS、E7-4-1BBL融合蛋白或CSA-4-lBBL+未生物素化E7免疫動物的脾細胞用作對照。(d)殺滅應答如下測定了疫苗誘導的CD8+T細胞裂解表達E7分子的TC-1細胞的能力。將從上述接種的動物收集的脾細胞在100ng/mlE7蛋白存在下共培養5天。將培養物補充50U/ml外源IL-2來支持CD8+T細胞的生長。使用Ficoll梯度收集有活力的脾細胞并用作JAM測試中對抗TC-1輩巴細月包的效應細月包，以不同的效應物目標物比例(如l:1、10:1、20:1、40:1和80:1)。參見，例如，Singh等，2003,Omceri^s.63:4067-73。因為由CD8+T細胞引起的腫瘤細胞的直接殺滅對癌癥免疫治療是重要的，該測試中功效的證明將進一步支持疫苗對抗宮頸癌的功效。(e)CD4+T細胞增殖應答如下測定了生物素化的E7/CSA-4-lBBL在誘導CD4+T細胞應答中的功效。用CFSE標記來自免疫動物的脾細胞，并在上述的相同培養條件下與重組E7共培養，除了沒有將IL-2加入培養物中。在培養過程中的不同天收集細胞，用APC-CD4抗體染色，并使用流式細胞術分析增殖。沒有使用E7蛋白或使用OVA蛋白的培養物用作對照。因為存在一般的意見CD4+T細胞應答對于CD8+T細胞和B細胞應答是重要的，該測試中功效的證明進一步支持了疫苗對抗宮頸癌的功效。63(f)體液應答如下測定用生物素化的E7/CSA-4-1BBL疫苗體內處理來產生體液應答的能力。收集來自接種小鼠的血液，并分離血清和用于篩選覆蓋E7蛋白的MaxisorbELISA平板(NalgeneNuncInternational)。用綴合辣根過氧化物酶的山羊抗-鼠IgG和山羊抗-鼠IgM抗體檢測抗-E7IgG和IgM。對照包括從接種PBS和對照蛋白如上述那些的動物收集的血清。生物素化的E7/CSA-4-1BBL綴合物疫苗在這些測試中將產生有效的應答。接種E7-4-1BBL融合蛋白也產生了應答，但預期任何這樣的應答將是較小規模的。接種CSA-4-1BBL加未生物素化的E7可以產生應答，但是任何這樣的應答不會和綴合物疫苗一樣強，因為APC吸收E7抗原是隨機情況，不會和通過綴合物獲得的E7耙向傳送至APC—樣有效。實施例16:E7/4-1BBL綴合物的治療功效在兩種不同的情況中測定了本發明包括E7/4-1BBL綴合物的疫苗在預防和根除TC-1可移植胂瘤模型中腫瘤形成的功效。第一種情況涉及在肺瘤注射前，免疫逃避機制還沒有產生時接種。笫二種情況涉及對抗完全產生了免疫逃避機制的已建立腫瘤的接種。給C57BL/6小鼠注射TC-1細胞來誘導腫瘤形成，并在TC-1注射之前和之后接種生物素化的E7/CSA-4-1BBL綴合物。如上所述測定免疫應答。每隔一天還監控小鼠的腫瘤產生和存活，并當腫瘤達到直徑20mm大小時，將動物麻醉。(a)E7/4-1BBL綴合物對抗隨后的胂瘤激發的功效。以下實施例將證明用本發明的E7/4-1BBL綴合物免疫產生了對抗腫瘤激發的保護性免疫。給雌性C57BL/6小鼠腹膜內注射單獨的PBS、單獨的CSA-4-lBBL、與未生物素化E7混合的CSA-4-lBBL、本發明的生物素化E7/CSA-4-1BBL綴合物和E-7-4-1BBL融合蛋白。使用如上所述最佳化的劑量。收集TC-1細胞，重懸浮于無菌PBS中并用于在最后一次免疫后注射十四天。在右側用lxlO5個TC-1細胞皮下激發小鼠并觀察60天。作為證實綴合物對E7+肺瘤特異性的對照，用A20癌細胞激發一組免疫過的小鼠。每隔一天監控小鼠的腫瘤產生和存活，并當腫瘤達到20mm直徑大小時，將動物麻醉。在第一次腫瘤激發后60天用lx106個TC-1細胞再次激發沒有產生胂瘤的動物來測試記憶應答。以十四天的間隔，將來自每組的小鼠犧牲，并收集它們的脾細胞。如上所述，使用四聚物染色和細胞因子染色，將脾細胞用于測定CD8+T細胞應答。(b)E7/4-1BBL綴合物對抗已有腫瘤的功效如下證明了本發明的E7/4-1BBL綴合物對抗預先已經存在的腫瘤的治療效果。將雌性C57BL/6小鼠在右側皮下注射TC-1細胞并在100%小鼠具有可觸知的腫瘤時接種。每周在腹膜內給予如上所述最佳化劑量的疫苗直至腫瘤大小達到20mm直徑，在這時將小鼠麻醉。測定腫瘤的生長率和發病率，持續60天。此外，測定長期存活并持續卯天。用本發明的生物素化E7/CSA-4-1BBL綴合物接種將在兩種情況中產生有效的抗腫瘤免疫應答，使得防止胂瘤生長并根除已有的胂瘤。接種未綴合的CSA-4-lBBL和E7以及接種E7-4-lBBL融合蛋白也可以產生抗腫瘤應答，但任何這樣的應答將是最小的，并且在防止腫瘤生長或根除已有腫瘤中很可能是無效的。實施例17:包括流感A抗原的綴合物通過從流感ARNA的逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應產生目標流感蛋白(例如，HI、Nl、NP和/或MP2)的cDNA。將cDNA亞克隆至pCSA載體中，并轉移至果蠅昆蟲細胞中，用于建立穩定的轉染子。利用工程化至蛋白中的6X-His標記物，使用金屬親和性樹脂和切線流過濾(ApoImmune已經使用的方法和技術)從果蠅培養基純化所分泌的H1、Nl、NP和MP2蛋白。通過凝膠電泳、免疫印跡技術、基質輔助激光解吸/離子化質譜(MALDI-MS)和分析超離心來分析純化的蛋白。將CSA-4-lBBL(如上所述制得)以1:4的摩爾比與生物素化的Hl、Nl、NP或MP2混合，來形成流感A/4-1BBL綴合物。簡而言之，用CSA-4-lBBL將生物素化的Hl、Nl、NP或MP2在4。C孵育一'卜時。用CSA-4-1BBL將育未生物素化的Hl、Nl、NP或MP2，來作為未綴合的對照。可以將綴合物配制于用作疫苗的組合物中。實施例18:對抗流感A的接種(a)劑量最佳化給C57BL/6小鼠接種不同劑量的流感A抗原/4-lBBL綴合物，如上所述。使用標準免疫技術測定小鼠中的免疫應答，這些技術包括四聚物技術、細胞因子染色、細胞毒性測試和體液應答的測量，如上所述。將最初的結果用來測定疫苗的最佳劑量方案。(b)接種和感染激發如下在用流感A激發的小鼠中證明流感A抗原/4-lBBL綴合物疫苗的預防性和治療性功效。在感染前后用流感A抗原/4-lBBL綴合物疫苗治療人流感病毒感染的動物，并測量病毒滴定度來測定治療功效。在感染后第1、3、5、7和9天收集來自接種和對照感染動物的肺。每天測定體重丟失，作為發病率的直接測量。在另一系列的實驗中，評價肺病理學并測定肺病毒滴定度。出于該目的，將肺均質并將勻漿在1500xg離心15分鐘后收集病毒上清液，并冷凍于-80。C直至隨后的分析。將來自肺的病毒上清液的稀釋液加入96-孔U底平板中，至3xl04MDCK細胞/孔，在37。C持續24小時，從孔中除去培養基，并加入無血清培養基。四天后，在鑒定培養物上清液不再凝集雞紅血球的稀釋度后，使用已知病毒濃度的標準曲線和TCID的Reed-Munch計算來測定病毒滴定度。實施例19:免疫共刺激CD40L部分在該實施例中所用的人單核細胞性白血病THP-1和鼠A20B-細胞淋巴瘤系購自美國典型培養物中心(ATCC,Rockville，MD,USA)。在補充10%熱滅活肽牛血清(FBS;ValleyBiomedical,Winchester,VA,USA)、12mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100貼/ml鏈霉素(全部來自GIBCO)和50iuM2陽巰基乙醇(Sigma,St.Louis，MO，USA)的DMEM(GIBCO,Gaithersburg,MD,USA)中培養A20細胞。在66補充5%FBS、100U/ml青霉素和O.lmMHepes緩沖液(GIBCO)的RPMI中培養THP-1細胞，在37。C,在潮濕的5。/。C02培養箱中。將細胞在懸浮液中生長，37°C，5%C02。該實施例中所用的中國倉鼠卵巢(CHO)和穩定的鼠CD154轉染的CHO(CHO-mCD40L)系由Dr.GailBishop(衣阿華州大學)提供，并維持于含有100mMHepes，50ng/ml慶大霉素和5。/oFBS的RPMI1640中(GIBCO)。從人外周血單核細胞通過逆流洗脫分離的初級單核細胞是來自Dr.LaryyWahl(NICDR)的禮物。按照之前所述的，用含有v-wy/c和v-ra/致癌基因的鼠重組J2逆轉錄病毒感染骨髓細胞來建立來自CD40敲除小鼠(CD40KO細胞系)的永久巨噬細胞系。參見，例如，Clemon-Miller等，2000，Immunobiol.202:477-92。為了產生穩定的表達轉染子的人CD40,用10pgDNA在600v,20p秒和2個脈沖將J2轉化的系電穿孔。轉染后24h將zeocin(lOOpg/ml)加入培養基中，并將有抵抗力的菌落染色，用于CD40的表面表達。使用FACSVantageSE(BectonDicknson,SanJoseCA，USA)分選高CD40表達的細胞，并維持，用于這些研究中。(a)CSA-CD40L部分的克隆和表達使用分離自阿維丁鏈霉菌(SWe/&m_ycwaWt/,m7)的基因組DNA作為模板和特異性引物(圖16中的a和b)在PCR中克隆編碼CSA的基因。使用產自總RNA的笫一鏈cDNA作為模板和CD40L-特異性引物(圖16中的c和d)在PCR中克隆人CD40L的胞外結構域，總RNA分離自植物凝血素(PHA)激活的人外周血淋巴細胞。以與CSA-hCD40L的相同方式克隆鼠CD40L,使用分離自用伴刀豆球蛋白A(ConA)激活的鼠脾細胞的總RNA。然后在框內將CSA/CD40L基因亞克隆至pMT/BiP/V5-HisCuS04-可誘導的載體中，用于表達至果蠅S2表達系統中(DES;Invitrogen,SanDiego,CA,USA)。根據制造商的實驗方案(Invitrogen)使用磷酸4丐轉染試劑盒用20貼重組載體來轉染果蠅S2細胞。通過用lpgpCoHygro載體共轉染來建立穩定的轉染子并在300|tig/ml潮霉素存在下維持。使用500pM終濃度的硫酸銅獲得重組蛋白的表達。誘導后3天收集培養物上清液，用40%過硫酸銨沉淀，并對于PBS進行滲析。按照之前所述的，使用改進的金屬離子親和性色譜方法純化重組蛋白。參見，例如，Lehr等，2000,ProteinExpressionPurif.,19:362-68。簡而言之，將培養上清液或沉淀的蛋白通過包裝螯合瓊脂糖快流(PharmaciaBiotech,Upsala,Sweden)的PharmaciaXK164主,并用50mM咪唑洗脫重組蛋白。使用Bradford染料結合方法或ELISA(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)測定蛋白質濃度。(b)通過蛋白質印跡和ELISA表征CSA-CD40L部分使用QuantikineCD40L免疫測試檢測并定量CSA-hCD40L的表達，其使用預先覆蓋于微量平板上的CD40L特異性的多克隆Ab,按照制造商的說明所述的(R&DSystems)。對于蛋白質印跡分析，首先通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳在天然和變性條件下將CSA-hCD40L和CSA-mCD40L的上清液分級，然后使用半干印跡裝置(BioRad,Hercules,CA,USA)轉移至聚乙二烯二氟化物膜上。首先在阻斷緩沖液中孵育膜，然后在阻斷緩沖液中以1:1000稀釋度的山羊抗-SAAb(Pierce,Rockford,IL,USA)中室溫贈育l小時。然后將膜徹底洗滌，并用1:4000稀釋度的綴合辣根過氧化物酶的抗山羊抗體孵育r小時。最后，根據制造商的說明(ECL，AmershamBiosciences,UK)使用化學發光底物沖全測蛋白質。在非變性PAGE條件下，轉染子表達高水平的形成穩定四聚物和高階結構的CSA-CD40L部分。只在IO(TC而非60。C加熱后的變性條件下，才發生解離成單體。這些數據證明了免疫共刺激部分的CD40L多肽沒有影響表達、正確的折疊和CSA作為寡聚物的存在。(c)受體結合和激活測試用200ng/ml的CSA-CD40L(人或鼠)部分或對照CSA蛋白將一百萬個CD40陽性鼠A20B細胞淋巴瘤或人巨喧細胞THP-1細胞在4。C孵育30分鐘。用PBS洗滌幾次后，使用綴合FITC的抗鏈霉抗生物素蛋白抗體(VectorLaboratories,Burlingame，CA,USA)在流式細胞術中檢測結合的蛋白。將CSA用作負對照來檢測非特異性結合。通過用100ng/mlCSA-hCD40L或CSA培養0.5><106個CHO細胞或與用CD40L膜形式轉染的0.5x106個CHO細胞共培養48小時來測定CSA-CD40L刺激對CD80和II類MHC分子表達的作用。然后將細胞洗滌，并用飽和濃度的綴合FITC的抗-CD80(L307.4)和II類HLA(TU36)抗體(BD畫PharMingen,SanDiego，CA,USA)染色，并通過流式細胞術來分析。CSA-mCD40L結合了人和鼠CD40受體(圖17A&B,暗線)，如通過流式細胞術所測定的，并顯示于圖17中。相反，CSA-hCD40L只與人細胞上的受體相互作用，與鼠細胞具有最小至不可檢測的結合(圖17C&D,暗線)，證明了其的物種特異性。這些相互作用使CD40-特異性的，因為將CSA用作對照蛋白時，不存在可檢測的結合(圖17,灰色填充部分)。使用II類HLA(圖18A)和CD80(圖18B)分子的抗體在流式細胞術中在所有測試的CSA-hCD40L蛋白濃度檢測THP-1細胞表面上的II類MHC和CD80分子的上調表達，在刺激后48小時在100ng蛋白質/5xl05個細胞獲得最大上調。CSA-hCD40L(細實線)在上調II類HLA分子中比CHO細胞上表達的膜結合形式的CD40L(粗實線)更有效(55.8的MFI對35.5)。相反，通過兩種形式的CD40L的CD80上調幾乎是相當的(33.6的MFI對36.2)。上調的表達是CSA-hCD40L特異性的，因為用CSA蛋白的孵育(實心柱狀圖)沒有顯著影響CD80和II類HLA分子的表達超過背景水平。(d)骨髓衍生的DC的產生從6至8周大小鼠的股骨沖洗出骨髓，并通過吸移分散成單個細胞，用氯化銨鉀(ACK)溶液裂解紅血球。然后使用TIB105、TIB146和克隆RL-172雜交瘤細胞培養物飽和的上清液的混合物耗盡單細胞懸浮液的T和B細胞，在水上持續30分鐘。(培養物上清液是匹茲堡大學的Dr.TatianaZorina的禮物，PA)。用兔子補體將細胞在37°C孵育30分鐘，并在完全培養基(RPMI1640,2mML-谷氨酰胺、100|Lig/ml青霉素和鏈霉素、10%FBS、O.lmM非必需氨基酸、lmM丙酮酸鈉、lpg/ml茚甲新和50pMN-曱基-L-精氨酸)(Sigma)中在六孔平板中以1()S個細胞/ml濃度培養過夜(37°C,5%C02)。通過溫和吸移收集未附著的細胞，并以1()S個細胞/ml的濃度重懸浮于補充重組鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(5ng/ml)和rmlL-4(5ng/ml)(全部來自USBiological,Swampscott,MA，USA)的完全培養基中。將細胞在六孔平板中(4ml/孔)培養5天。在第五天，對于細胞表面MHC和共刺激分子的表達，測定培養物中存在的DC的類型，并用不同濃度(0.1-0.5|iig/106個細胞)的CSA-mCD40L、單獨的培養基或CSA孵育。在不同的天數收集細胞并使用PE標記的抗CDllc的單克隆抗體(HL3)和FITC標記的CD80(16-10A1)和CD86(GL1)的mAb(全部來自PharMingen)來分析成熟標記的表達。用各種濃度(0.1-0.5^/106個細胞)的鼠CSA-CD40L孵育48小時的來自第5天鼠骨髓培養物的未成熟樹突細胞顯示出提高的CD80和CD86共刺激分子的表達(圖19A&B),在0.2|1^/106個細胞的濃度，對CD80表達上調的作用高于CD86的(倍3對2倍)。更高濃度的CSA-CD40L融合蛋白或更長的孵育時間段沒有導致進一步的上調(數據未顯示)。該作用是免疫共刺激部分特異性的，因為用CSA蛋白孵育的細胞在超過背景水平的共刺激分子表達中具有最小至不可檢測的改變。(e)促炎細胞因子產生的分析將人單核細胞涂布于96-孔微量滴定平板中并使用lng/ml可購得的三聚重組人CD40L(rhsCD40L)+ljug/ml增強子(AlexisBochemicals,SanDiego,CA,USA)和100ng/mlCSA畫hCD40L、CSA國mCD40L或CSA來刺激。在孵育18小時后收集上清液并通過ELISA來測試，對所有的細胞因子使用OpffilA裝置(PharMinger)。使用E-maxPrecision孩吏量滴定平沖反讀數器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA，USA)來進行分析。人單核細胞連接CSA-hCD40L導致超過單獨CSA5倍的人IL-l卩產生刺激，這等于由rhsCD40L誘導的水平(圖20A&B)。相似地，用CSA-mCD40L的人單核細胞刺激導致強有力的人IL-6刺激(圖20C&D)。因此，人和鼠CSA-CD40L融合蛋白都能夠刺激人單核細胞上的CD40來產生IL-1J3和IL-6。70(f)RNAse保護測試通過RNAse保護測試來進行細胞因子mRNA合成的分析。將細胞涂布于6-孔平板中并使用CSA-CD40L通過CD40刺激3至4小時。用增強子表達CD40L和rhsCD40L的CHO轉染子用作對照。按照制造商的說明(Invitrogen)所述的使用Trizol來提取RNA。將RNA(5jng)與放射性標記的探針在55。C雜交過夜，探針產自人細胞因子/RNA模板套系，mCK-3b(RiboQuant,BD畫PharMingen,SanDiego,CA，USA)。將RNAse處理在37。C進行45分鐘，此后純化受保護的探針，并使用TBE緩沖液中的5%聚丙烯酰胺凝膠(BioRad)通過凝膠電泳來收集。將凝膠干燥并暴露于KodakBiomaxXLX-射線膠片(EastmanKodak,Rochester,NY,USA)。使用未消化的探針作為標記，在半對數坐標紙上以移動距離對核苷酸長度來作出標準曲線。然后從圖中推斷樣品中RNAse保護條帶的特性。如圖20D中所示的，用CSA-hCD40L刺激導致IL-6mRNA超過單獨的CSA2.8-倍提高。總而言之，這些數據表明人和鼠CSA-CD40L能夠誘導單核細胞和巨噬細胞中的CD40信號。(g)CSA-hCD40L刺激IFN-y引發的巨噬細胞中的iNOS產生IFN-y引發的巨噬細胞的CD40連接導致一氧化氮產生的刺激，這在巨噬細胞的殺微生物和細胞毒活性中起著關鍵作用。可誘導的一氧化氮合酶(iNOS)屬于從L-精氨酸催化合成一氧化氮的一氧化氮合酶家族。Thl和Th2T輔助細胞可以不同地調節巨噬細胞中的精氨酸代謝。Thl細胞誘導通過巨噬細胞的iNOS產生，而Th2細胞誘導巨嚆細胞產生精氨酸酶，其與抗炎功能相關。因此，巨噬細胞iNOS產生是Thl型免疫應答的標志。如下證明了CSA-CD40L部分刺激鼠巨噬細胞中iNOS產生的能力。用IFN-y將CD40KO-人CD40細胞引發24小時，隨后用CSA-hCD40L、rhsCD40L或單獨的CSA刺激24h。將細胞裂解物標準化并通過蛋白質印跡來分析，使用抗-iNOSAb。如圖21中所證明的，用CSA-hCD40L或rhsCD40L而不是CSA刺激巨喧細胞導致iNOS產生的刺激。用lpg/ml商業rhsCD40L刺激導致超過背景6倍的iNOS刺激，而用300ng/ml的CSA-hCD40L刺激導致超過單獨的CSA9倍的iNOS刺激。這些數據表明CSA-hCD40L是巨噬細胞iNOS產生的有效刺激劑。實施例20:由CSA-4-lBBL誘導的體內殺滅應答用50pg卵清蛋白(OVA)作為抗原，和兩個劑量(各自為12.5pg和25pg)的CSA-4-lBBL或LPS作為佐劑，在靜脈內免疫天然C57BL/6小鼠。將天然動物用作對照。七天后，所有小鼠接受如下制備的CFSE標記的目標細胞。將來自天然C57BL/6小鼠的脾細胞分成兩群。用0.25pMCFSE(CFSE低)標記第一個群，用2.5pMCFSE標記第二個群，然后用2pg/mlOVA257.264肽(SIINFEKL)脈沖1小時(CFSE高)。將細胞以1:1的比例混合，將總的"107個細胞靜脈內注射至接受動物中。48小時后收集脾臟，并通過流式細胞術分析CFSE熒光強度。結果顯示于圖22中，表示為肽脈沖的CFSE高峰與參照CFSE低峰相比較的百分比裂解，標準化至天然動物。如圖22中所示的，用OVA和CSA-4-1BBL免疫在目標細胞內產生了有效的體內殺滅應答，CSA-4-1BBL證明了在兩個測試的濃度比LPS更強的佐劑作用。實施例21:用4-1BBL共刺激4及大程度地提高了小鼠中對HPV16E7蛋白的免疫應答，控制了TC-1腫瘤并誘導了抗腫瘤記憶。在基于給予HPV16E7抗原決定部位Pl的CD8+T細胞抗原決定部位(具有氨基酸序列RAHYNIVTF)的接種實驗方案中，在右側用lxl()S個活的TC-1細胞皮下激發天然B6小鼠，TC-1細胞穩定表達人乳頭狀瘤病毒-16E7蛋白。圖23顯示了該TC-1腫瘤模型中小鼠的存活。IO天后，小鼠接受一次以下之一的皮下注射(i)PBS(tn=20);(iO50|iigPl+12.5pgCSA(■，n=6);(iii)25jtigCSA-4曙1BBL(▲,n=10);(iv)50pgPl+25(igCSA-4-lBBL(A,n=13),或(v)50pgPl+10jxgCpG(□,n=7)。如圖23中所示的，用Pl或CSA-4-1BBL免疫獲得了一些成功的免疫治療，但是用Pl和CSA-4-lBBL接種獲得了更高的結果(包括提高的存活)。所有只接受PBS的動物產生了腫瘤。在笫60天(黑色箭頭)將存活的動物再次激發。一周監控腫瘤生長3次。與單獨的Pl或CSA-4-1BBL,或Pl和CpG相比較，胂瘤激發后一起給予CSA-4-1BBL和Pl限制提高了動物的存活。重要地，Pl+CSA-4-lBBL組中沒有一個存活動物在第二次激發時產生腫瘤，證明了免疫記憶。實施例22:接種0VA/CSA-4-1BBL防止了肺瘤生長用綴合25pgCSA-4-1BBL的50jngOVA或50pg生物素化的OVA免疫天然C57BL/6小鼠。留下一些動物未處理作為對照。7天后，用lx105個OVA表達-EG.7腫瘤細胞在右側皮下激發小鼠。使用卡尺一周監控腫瘤生長三次。結果(無腫瘤存活)顯示于圖24中。如所示的，所有對照動物和接種OVA的動物產生了胂瘤，而接種了生物素化的OVA/CSA-4-1BBL的所有動物沒有產生胂瘤，證明了接種生物素化的OVA/CSA-4-1BBL導致thyoma腫瘤生長的100%防止。實施例23:4-1BBL強烈提高了體內抗原特異性CTL應答用(l)50ngOVA,(ii)50ngOVA和25ingCSA畫4國lBBL,(iii)50^igOVA和25pg抗-CD137抗體或(iv)50|ngOVA和25jigLPS給天然C57BL/6小鼠靜脈內免疫。天然動物用作對照。七天后，所有小鼠接受CFSE標記的靶細胞。簡而言之，將來自天然C57BL/6小鼠的脾臟分成兩群。用0.25pMCFSE標記第一個群(CFSE低)。用2.5^iMCFSE標記第二個群，然后用2pg/mlOVA257-264SIINFEKL肽脈沖1小時(CFSE高)。將細胞以1:1的比例混合，并將總的1><107個細胞靜脈內注射至接受動物中。48小時后收集脾臟，并通過流式細胞術分析CFSE熒光強度，結果顯示于圖25中。將結果表示于每個圖的角上，作為肽脈沖的CFSE高峰與參照CFSE低峰相比較的百分比裂解，標準化至天然動物。該測試揭示了4-1BBL可以將抗原特異性的CTL應答提高至較高水平(95%),與單獨的抗原(OVA)(24.2%),或抗原和LPS(35%)相比較，導致大部分靶細胞的殺滅。實施例24:4-lBBL共刺激提高了體內抗原遞呈至CD8+T細胞用(i)10|ugOVA,(ii)10ngOVA和5jxg4-lBBL將天然B6畫SJL(CD45.1+)動物靜脈內免疫，或(iii)留下未處理。2天后，通過靜脈內注射，動物接受lx106CFSE標記的OT-l細胞(CD45.2+)。3天后收集脾臟，并使用流式細胞術分析OT-l細胞的增殖，如圖26中所示的。4-1BBL和抗原的一起給予提高了抗原遞呈至CD8+T細胞，如通過大部分OT-l細胞的增殖所證明的。(對于OVA+4-lBBL為83.2%;對于OVA為13.7%;對于未處理的為8.8%)。實施例25:4-lBBL共刺激提高了樹突細胞的抗原吸收給天然BALB/c小鼠皮下注射25pgOVA-FITC,25pgOVA-FITC和10jxgCSA，或25pgOVA-FITC和25jLigCSA-4-lBBL。3小時后，收集注射部位的腹股溝淋巴結。使用流式細胞術分析FITC+CDllc+群中的細胞，來測定體內熒光標記的抗原更新，如圖27中所看到的。如所示的，4-lBBL信號提高了CDllc+DC的抗原吸收，而對照CSA蛋白沒有效果。盡管足夠詳細地描述和舉例說明了本發明，用于本領域技術人員來制備和使用，各種替換、改變和改進應當是清楚的，而沒有脫離本發明的精神和范圍。在此提供的實施例是優選實施方案的表示，并不是打算來限制本發明的范圍。本領域技術人員將產生其中的改變和其他用途。這些改變包括在本發明精神內，并由權利要求的范圍來限定。對在此公開的本發明形成各種替代和改變而沒有脫離本發明的范圍和精神是本領域技術人員顯而易見的。說明書中提及的所有專利和出版物是本發明所屬領域的普通技術人員水平的表示。在此引入所有專利和出版物作為參考，至如同每篇單獨的出版物特意并單獨表示引入作為參考的相同程度。可以在缺少在此未特意公開的任意要素、限制的情況下合適地實施在此說明性描述的本發明。因此，例如，在此的每個情況中，術語"包括"、"基本上包括"和"包含"中的任一個可以由其他兩個術語中的任一個來替代。已經使用的術語和表述用作描述而非限制的術語，沒有使用這樣的術語和表述排除所示和所述的任何等價特征或其一部74分的意圖，但是認為各種改變在所要求的本發明范圍內是可能的。因此，應當理解盡管已經通過優選的實施方案和任選特征特異性地公開了本發明，在此公開的概念的改變和變化依靠本領域的技術人員，并以下列出了其他示例性實施方案和權利要求示例性實施方案1.一種組合，其包括(a)第一綴合物，包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)第二綴合物，包括(i)包括第一抗原的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員。2.實施方案1的組合，其中所述結合對的所述第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，并且所述結合對的所述第二個成員包括生物素。3.實施方案2的組合，其中所述結合對的所述第一個成員包括核心鏈霉抗生物素蛋白。4.實施方案1的組合，其中所述第一綴合物包括融合多肽，該融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述結合對的所述第一個成員。5.實施方案1的組合，其中所述第一免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD國L2、B7-H3、B7誦H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。6.實施方案5的組合，其中所迷第一免疫共刺激多肽是4-lBBL。7.實施方案6的組合，其中所述第一綴合物包括融合多肽，該融合多肽包括SEQIDNO:8的氨基酸序列。8.實施方案1的組合，其中所述笫一抗原與感染劑相關。9.實施方案8的組合，其中所述感染劑選自人或禽流感和人免疫缺陷病毒。10.實施方案1的組合，其中所述笫一抗原是腫瘤相關抗原。11.實施方案10的組合，其中所迷腫瘤相關抗原選自人末端酶逆轉錄酶，survivin,MAGE-l,MAGE-3,人絨膜促性腺激素，癌胚抗原，a胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-l,CA125，CA15-3，CA19-9,CA549,CA195，前列腺特異性抗原；前列腺特異性膜抗原，Her2/neu，gp-lOO，突變K-ras蛋白，突變p53,截斷的上皮生長因子受體，嵌合蛋白p210BCR-ABL;HPVE6，HPVE7;EB病毒EBNA3蛋白，及其組合或片段。12.實施方案1的組合，其中作為分開的組合物來提供所述笫一和第二綴合物。13.實施方案1的組合，其中作為單個組合物來提供所述第一和第二綴合物。14.實施方案13的組合，其中所述組合物包括藥物學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。15.實施方案13的組合，其中，在所述組合物中提供的，所述第一綴合物通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述第二綴合物結合。16.實施方案1的組合，其中所述第一免疫共刺激多肽沒有包括免疫共刺激分子的跨膜結構域。17.實施方案1的組合，其中所述第一免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的跨膜結構域，或其受體結合部分。18.實施方案1的組合，進一步包括第三綴合物，包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和結合對的第一個成員的綴合物成員和(ii)包括第二抗原和結合對的第二個成員的綴合物成員，其中所述第二免疫共刺激多肽與所述第一免疫共刺激多肽相同或不同；所述第二抗原與所述第一抗原相同或不同；所述第三綴合物的第一個和第二個結合對成員與所述第一和第二綴合物的所述第一個和第二個結合對成員相同或不同，和所述第一綴合物成員通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述第二綴合物結合。19.一種組合，包括(a)第一綴合物，包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)第二綴合物，包括(i)包括感染劑的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員。20.產生或增強對抗表達腫瘤相關抗原的腫瘤的免疫應答的方法，包括將以下物質給予帶有所述腫瘤的患者(a)第一綴合物，包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員，和第二綴合物，包括(i)包括所述第一腫瘤相關抗原的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員；或(b)已經用所述第一綴合物和第二綴合物在體外處理過的免疫細胞。21.實施方案20的方法，其中將所述第一和第二綴合物給予所述患者。22.實施方案21的方法，其中分開給予所述第一和第二綴合物。23.實施方案21的方法，其中同時給予所述第一和第二綴合物。24.實施方案20的方法，其中在單個組合物中提供所述第一和第二綴合物。25.實施方案24的方法，其中，在所述組合物中提供的，所述第一綴合物通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述第二綴合物結合。26.實施方案21的方法，其中通過腫瘤內注射來給予所述第一和第二綴合物中的至少一個。27.實施方案20的方法，其中所述第一腫瘤相關抗原選自人末端酶逆轉錄酶，survivin，MAGE-l,MAGE-3,人絨膜促性腺激素，癌胚抗原，a胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-l,CA125，CA15-3,CA19-9,CA549,CA195,前列腺特異性抗原；前列腺特異性膜抗原，Her2/neu,gp-100,突變K-ras蛋白，突變p53,截斷的上皮生長因子受體，嵌合蛋白p210BCR-ABL;HPVE6，HPVE7;EB病毒EBNA3蛋白，及其組合或片段。28.實施方案20的方法，進一步包括給予第三個組合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和結合對的第一個成員的綴合物成員和(ii)包括第二腫瘤相關抗原和結合對的第二個成員的綴合物成員，其中所述第二免疫共刺激多肽與所述第一免疫共刺激多肽相同或不同；所述第二抗原與所述第一抗原相同或不同；所述第三綴合物的第一個和第二個結合對成員與所述第一和第二綴合物的所述第一個和第二個結合對成員相同或不同，和所述第一綴合物成員通過所述笫一個和第二個結合對成員之間的77結合與所述第二綴合物結合。29.實施方案28的方法，其中所述第二腫瘤相關抗原選自人末端酶逆轉錄酶，survivin，MAGE-1,MAGE-3,人絨膜促性腺激素，癌胚抗原，a胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-1，CA125，CA15-3，CA19-9,CA549，CA195，前列腺特異性抗原；前列腺特異性膜抗原，Her2/neu,gp陽訓，突變K-ras蛋白，突變p53，截斷的上皮生長因子受體，嵌合蛋白p210BCR-ABL;HPVE6,HPVE7;EB病毒EBNA3蛋白，及其組合或片段。30.實施方案20的方法，其中所述結合對的所述第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，并且所述結合對的所述第二個成員包括生物素。31.實施方案30的方法，其中所述結合對的所述第一個成員包括核心鏈霉抗生物素蛋白。32.實施方案20的方法，其中所述第一綴合物包括融合多肽，該融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述結合對的所述第一個成員。33.實施方案20的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD國L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。34.實施方案33的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽是4-lBBL。35.實施方案34的方法，其中所述第一綴合物包括融合多肽，該融合多肽包括SEQIDNO:8的氨基酸序列。36.實施方案20的方法，其中所述免疫共刺激多肽沒有包括免疫共刺激分子的跨膜結構域。37.實施方案20的方法，其中所述免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的胞外結構域，或其受體結合部分。38.實施方案20的方法，其中將已經用所述第一和第二綴合物在體外處理過的免疫細胞給予所述患者。39.實施方案38的方法，其中所述免疫細胞包括所述免疫共刺激多肽的受體，并且其中所述第一綴合物通過所述免疫共刺激多肽和所述受體之間的結合與所述免疫細胞綴合，并且所述第二綴合物通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述免疫細胞綴合。40.實施方案38的方法，其中用所述第一和笫二綴合物同時處理所述免疫細胞。41.實施方案38的方法，其中用所述第一和第二綴合物分開處理所述免疫細胞。42.修飾免疫細胞來產生或增強對表達胂瘤相關抗原的胂瘤或對感染劑的免疫應答的方法，包括將表達第一免疫共刺激多肽受體的免疫細胞接觸(a)第一綴合物，包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)第二綴合物，包括(i)包括感染劑的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員，其中所述第一綴合物通過所述免疫共刺激多肽和所述受體之間的結合與所述免疫細胞綴合，并且所述第二綴合物通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述免疫細胞綴合。43.實施方案42的方法，其中將所述第一綴合物和第二綴合物分開接觸。44.實施方案42的方法，其中將所述第一和第二綴合物同時接觸。45.實施方案44的方法，其中在單個組合物中提供所述第一和第二綴合物。46.實施方案45的方法，其中，在所述組合物中提供的，所述第一綴合物通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述第二綴合物結合。47.實施方案42的方法，其中所述通過將所述第一和笫二綴合物給予含有所述免疫細胞的患者來實現所述接觸。48.實施方案47的方法，其中所述笫二綴合物包括胂瘤相關抗原，所述患者進一步包括所述腫瘤，通過腫瘤內注射來給予所述第一和第二綴合物中的至少一個。49.實施方案42的方法，其中所述免疫細胞是T細胞或嗜中性粒細胞。50.實施方案49的方法，其中所述T細胞選自CD4+細胞、CD8+細胞、自然殺傷細胞、單核細胞和樹突細胞。51.實施方案42的方法，其中所述第二抗原包括腫瘤相關抗原。52.實施方案51的方法，其中所述肺瘤相關抗原選自人末端酶逆轉錄酶，survivin,MAGE-1，MAGE-3,人絨膜促性腺激素，癌胚抗原，a胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-1,CA125,CA15-3,CA19-9,CA549,CA195,前列腺特異性抗原；前列腺特異性膜抗原，Her2/neu,gp-100,突變K-ras蛋白，突變p53，截斷的上皮生長因子受體，嵌合蛋白p210BCR-ABL;HPVE6,HPVE7;EB病毒EBNA3蛋白，及其組合或片段。53.實施方案42的方法，其中所述第二綴合物包括與感染劑相關的抗原或感染劑。54.實施方案42的方法，其中所述感染劑是細菌。55.實施方案54的方法，其中所述細菌選自結合分枝桿菌；炭疽桿菌；金黃色葡萄球菌。56.實施方案42的方法，其中所述感染劑是病毒。57.實施方案56的方法，其中所述病毒選自腺病毒；沙粒病毒；杯狀病毒；冠4犬病毒；絲4犬病毒；黃病毒；肝病毒；皰滲病毒；正l占液病毒；乳頭瘤病毒；樣支小病毒；痘病毒；呼吸孤病毒；逆轉錄病毒；棒4犬病毒；和4皮"莫病毒。58.實施方案42的方法，其中所述感染劑是寄生物。59.實施方案58的方法，其中所述寄生物選自變形體和利什曼蟲。60.實施方案42的方法，其中所述感染劑是真菌。61.實施方案60的方法，其中所述真菌選自曲霉屬；假絲酵母屬；球蟲屬；隱球菌；Geotricha;組織胞漿菌；微孢子蟲；肺孢子蟲。62.實施方案47的方法，其中所述患者選自馬、羊、公山羊、牛、豬、鳥類、狗、貓和靈長類物種。63.實施方案47的方法，其中所述患者是人。64.實施方案42的方法，其中所述免疫細胞包括第二免疫共刺激多肽的受體，該方法進一步包括將所述免疫細胞接觸第三綴合物，其包括(i)包括所述第二免疫共刺激多肽和結合對的第一個成員的綴合物成員和(ii)包括第二個與所述胂瘤或感染劑相關的抗原或所述感染劑和所述結合對的第二個成員的綴合物成員，其中所述笫二免疫共刺激多肽與所述第一免疫共刺激多肽相同或不同；所述第二抗原，如果存在，與所述第一抗原(如果存在)相同或不同；所述第三綴合物的第一個和第二個結合對成員與所述第一和第二綴合物的所述第一個和笫二個結合對成員相同或不同，和所述第一綴合物成員通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述第二綴合物結合。65.實施方案42的方法，其中所述結合對的所述第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，而所述結合對的所述第二個成員包括生物素。66.實施方案65的方法，其中所述結合對的所述第一個成員包括核心鏈霉素。67.實施方案42的方法，其中所述第一綴合物包括融合多肽，該融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述結合對的所述第一個成員。68.實施方案42的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD誦L2、B7-H3、B7國H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。69.實施方案68的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽是4-lBBL。70.實施方案69的方法，其中所述第一綴合物包括融合多肽，該融合多肽包括SEQIDNO:8的氨基酸序列。71.實施方案42的方法，其中所述免疫共刺激多肽沒有包括免疫共刺激分子的跨膜結構域。72.實施方案42的方法，其中所述免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的胞外結構域，或其受體結合部分。73.通過實施方案42的方法制得的免疫細胞群，其中接觸其他免疫細胞時，所述免疫細胞產生或增強對所述胂瘤的免疫應答。74.表達第一免疫共刺激多肽受體的修飾免疫細胞，其中所述修飾的免疫細力包包括(a)第一綴合物，包括(i)包括所述笫一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)第二綴合物，包括(i)包括第一抗原或感染劑的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員，其中所述第一綴合物通過所述免疫共刺激多肽和所述受體之間的結合與所述免疫細胞綴合，并且所述第二綴合物通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述免疫細胞綴合。75.實施方案74的免疫細胞，其中所述免疫細胞選自T細胞、嗜中性粒細胞、自然殺傷細胞、單核細胞和樹突細胞。76.實施方案75的免疫細胞，其中所述T細胞選自CD4+細胞和CD8+細胞。77.實施方案76的免疫細胞，其中所述結合對的所述第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，并且所述結合對的所述第二個成員包括生物素。78.實施方案76的免疫細胞，其中所述結合對的所述第一個成員包括核心鏈霉抗生物素蛋白。79.實施方案74的免疫細胞，其中所述第一綴合物包括融合多肽，該融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述結合對的所述笫一個成貝。80.實施方案74的免疫細胞，其中所述第一免疫共刺激多肽選自4曙1BBL、CD86、ICOSL、PD畫L1、PD畫L2、B7-H3、B7國H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。81.實施方案80的免疫細胞，其中所述第一免疫共刺激多肽是4-lBBL。82.誘導或增強對抗感染劑的免疫應答的方法，包括將以下物質給予患有所述感染劑感染或處于所述感染劑傳染風險中的患者(a)第一綴合物，包括(i)包括所述第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)第二綴合物，包括(i)包括第一個與所述感染劑相關的抗原或包括所述感染劑的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員。83.實施方案82的方法，其中將所述第一和第二綴合物分開給予。84.實施方案82的方法，其中將所述第一和第二綴合物同時給予。85.實施方案84的方法，其中在單個組合物中提供所述第一和第二綴合物。86.實施方案85的方法，其中，在所述組合物中提供的，所述第一綴合物通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述第二綴合物結合。87.實施方案82的方法，其中通過選自以下的途徑來給予所述第一和第二綴合物中的至少一個口服；舌下；經粘膜；經皮；直腸；陰道；皮下；肌內、靜脈內；動脈內；鞘內；通過導管；通過植入；和直接至腫瘤中。8288.實施方案82的方法，其中所述感染劑是細菌。89.實施方案88的方法，其中所述細菌選自結合分枝桿菌；炭疽桿菌；金黃色葡萄球菌。90.實施方案82的方法，其中所述感染劑是病毒。91.實施方案90的方法，其中所述病毒選自^病毒；沙粒病毒；杯狀病毒；冠3犬病毒；絲一大病毒；黃病毒；肝病毒；皰滲病毒；正點'液病毒；乳頭瘤病毒；微小病毒；痘病毒；呼吸孤病毒；逆轉錄病毒；棒狀病毒；和4皮膜病毒。92.實施方案82的方法，其中所述感染劑是寄生物。93.實施方案92的方法，其中所述寄生物選自變形體和利什曼蟲。94.實施方案82的方法，其中所述感染劑是真菌。95.實施方案94的方法，其中所述真菌選自曲霉屬；假絲酵母屬；球蟲屬；隱球菌；Geotricha;組織胞漿菌；微孢子蟲；肺孢子蟲。96.實施方案82的方法，其中所述患者選自馬、羊、公山羊、牛、豬、鳥類、狗、貓和靈長類物種。97.實施方案96的方法，其中所述患者是人。98.實施方案82的方法，其中所述感染是人或禽流感，并且所述抗原選自H、N、Ml、M2e、NS1、NS2(NEP)、NP、PA、PB1和PB2。99.實施方案82的方法，其中所述感染是HIV,并且所述第一抗原選自由Gag蛋白、Pol、Vif、Vpr、Rev、Vpu、包膜抗原決定部位、Tat和Nef構成的HIV抗原。100.實施方案82的方法，進一步包括給予第三綴合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和結合對的第一個成員的綴合物成員和(ii)包括第二個與所述感染相關的抗原或所述感染劑和所述結合對的第二個成員的綴合物成員，其中所述第二免疫共刺激多肽與所述第一免疫共刺激多肽相同或不同；所述第二抗原，如果存在，與所述第一抗原(如果存在)相同或不同；所述第三綴合物的第一個和笫二個結合對成員與所述第一和第二綴合物的所述第一個和第二個結合對成員相同或不同，和所述第一綴合物成員通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述第二綴合物結合。101.實施方案100的方法，其中所述感染是人或禽流感，并且所述第二抗原是H、N、Ml、M2e、NS1、NS2(NEP)、NP、PA、PB1和PB2。102.實施方案101的方法，其中所述感染是HIV,并且所述第二抗原選自由Gag蛋白、Pol、Vif、Vpr、Rev、Vpu、包膜抗原決定部位、Tat和Nef構成的HIV抗原。103.實施方案82的方法，其中所述結合對的所述第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，并且所述結合對的所述第二個成員包括生物素。104.實施方案103的方法，其中所述結合對的所述第一個成員包括核心鏈霉抗生物素蛋白。105.實施方案82的方法，其中所述第一綴合物包括融合多肽，該融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述結合對的所述第一個成貝。106.實施方案82的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD畫L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。107.實施方案106的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽是4-lBBL。108.實施方案107的方法，其中所述第一綴合物包括融合多肽，該融合多肽包括SEQIDNO:8的氨基酸序列。109.實施方案82的方法，其中所述免疫共刺激多肽不包括免疫共刺激分子的跨膜結構域。110.實施方案82的方法，其中所述免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的胞外結構域，或其受體結合部分。111.基本上由免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白構成的綴合物，其中所述免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7畫H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。112.實施方案111的綴合物，包括核心鏈霉抗生物素蛋白。113.實施方案111的綴合物，其中所述免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7國H3、B7誦H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF和APRIL。114.誘導動物中免疫刺激應答的方法，基本上包括將綴合物給予動物，該綴合物基本上由免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白構成。115.實施方案114的方法，其中所述綴合物包括核心鏈霉抗生物素蛋白。116.實施方案114的方法，其中所述免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD國L1、PD國L2、B7國H3、B7醫H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。117.實施方案116的方法，其中所述免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF和APRIL。118.包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的綴合物，其中所述免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD國L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。119.誘導動物中免疫刺激應答的方法，包括將綴合物給予動物，該綴合物包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，其中所述免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7畫H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。120.實施方案119的方法，進一步包括將抗原給予動物。121.實施方案120的方法，其中作為包括所迷抗原和結合對成員的綴合物來給藥所述抗原。8權利要求1.一種組合，其包括(a)第一綴合物，其包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)第二綴合物，其包括(i)包括第一抗原的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員。2.權利要求1的組合，其中所述結合對的所述第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，并且所述結合對的所述第二個成員包括生物素。3.權利要求1的組合，其中所述第一免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD國L2、B7-H3、B7國H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。4.權利要求1的組合，其中所述第一抗原選自與感染劑相關的抗原和腫瘤相關抗原。5.—種組合，其包括(a)第一綴合物，其包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)第二綴合物，其包括(i)包括與感染劑相關的抗原或感染劑的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員。6.權利要求5的組合，其中感染劑選自細菌、病毒和寄生物。7.產生或增強對抗表達第一腫瘤相關抗原的腫瘤的免疫應答的方法，所述方法包括將以下物質給予帶有所述腫瘤的患者(a)第一綴合物，其包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員，和第二綴合物，其包括(i)包括所述第一腫瘤相關抗原的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員；或(b)已經用所述第一和第二綴合物在體外處理過的免疫細胞。8.權利要求7的方法，其中所述結合對的所述第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，并且所述結合對的所述第二個成員包括生物素。9.權利要求7的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD國L2、B7-H3、B7陽H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。10.權利要求7的方法，其中所述患者選自馬、羊、公山羊、牛、豬、鳥類、狗、貓和靈長類物種。11.權利要求10的方法，其中所述患者是人。12.修飾免疫細胞來產生或增強對表達腫瘤相關抗原的肺瘤或對感染劑的免疫應答的方法，所述方法包括將表達第一免疫共刺激多肽受體的免疫細胞接觸(a)第一綴合物，包括(i)包括所述第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)第二綴合物，包括(i)包括與所述胂瘤或感染劑相關的抗原或所述感染劑的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的笫二個成員的綴合物成員，其中所述第一綴合物通過所述免疫共刺激多肽和所述受體之間的結合與所述免疫細胞綴合，并且所述第二綴合物通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述免疫細胞綴合。13.表達第一免疫共刺激多肽受體的修飾免疫細胞，其中所述修飾的免疫細胞包括(a)第一綴合物，其包括(i)包括所述第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)笫二綴合物，其包括(i)包括第一抗原或感染劑的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員，其中所述第一綴合物通過所述免疫共刺激多肽和所述受體之間的結合與所述免疫細胞綴合，并且所述第二綴合物通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述免疫細胞綴合。14.誘導或增強對抗感染劑的免疫應答的方法，所述方法包括將以者人；，；-、；，；乂、(a)第一綴合物，其包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的綴合物成員；和(b)第二綴合物，其包括(i)包括與所述感染劑相關的第一抗原或包括所述感染劑的綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的綴合物成員。15.權利要求4的方法，其中所述患者選自馬、羊、公山羊、牛、豬、鳥類、狗、貓和靈長類物種。16.權利要求15的方法，其中所述患者是人。17.包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的綴合物，其中所述免疫共刺激多肽選自4-lBBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD曙L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。18.誘導動物中免疫刺激應答的方法，所述方法包括將綴合物給予動物，該綴合物包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。19.權利要求18的方法，其中該方法進一步包括將抗原給予動物。20.權利要求18的方法，其中所述動物選自馬、羊、公山羊、牛、豬、鳥類、狗、貓和靈長類物種。全文摘要本發明提供了包括免疫共刺激多肽和抗原或感染劑的綴合物。將綴合物用于產生或增強對抗抗原或感染劑的免疫應答。本發明該提供了用用于產生或增強對抗原或感染劑的免疫應答的綴合物修飾的免疫細胞。本發明還提供了免疫刺激部分，其包括用于刺激免疫應答的免疫共刺激多肽。本發明還提供了免疫治療方法和治療或預防感染的方法。文檔編號A61K47/48GK101426533SQ200680052551公開日2009年5月6日申請日期2006年12月7日優先權日2005年12月8日發明者E·S·尤爾庫,H·什爾萬,K·G·埃爾佩克申請人:路易斯維爾大學研究基金會有限公司