專利名稱：：芫根總黃酮的制備工藝及其制成品中芫根總黃酮含量的測定方法
技術領域：
：本發明涉及中藥材藥用成分的提取方法，特別是中藥材芫根總黃酮的制備工藝及對制成品中芫根總黃酮含量的測定方法。
背景技術：
：芫根，也叫蕪菁，古名葑，又名蔓菁(中文藥學名稱)、諸葛菜、大頭菜、圓菜頭、圓根、盤菜，為種子植物門，雙子葉植物綱，十字花科蕓苔屬，兩年生草本植物。是芥菜的一個變種,也稱為根用芥菜。藏族人民稱蕪菁為"妞瑪"。據藏醫記截芫根，其外形圓似蘿卜，味甜，密實度高，具有清熱解毒、滋補增氧、降血脂等諸多功能，對人體有著一定保健作用。蕪菁營養成分非常豐富，根含蕓苔素(Rapin);種子含脂肪油33%-45%，揮發油約0.16%;植株中還含維生素B,、抗壞血酸、胡蘿卜素、脂肪、無機鹽、糖類和蛋白質。蕪菁還具有很高的藥用價值。中醫學認為蕪菁味甘、辛、苦，性溫，無毒。入胃、肝、腎三經。具有開胃消食，下氣寬中，止咳化痰，利濕解毒，溫和脾胃之功效。對治療寒積腹痛、食欲不振、食積不化、黃疸、乳癰以及皮膚癤腫等癥效果顯著?，F代醫學研究表明，蕪菁具有以下多種功效l.幫助消化；2.防治結腸癌；3.抗菌驅蟲；4.促進機體平衡。最新藥理實驗還表明蕪菁具有抗癌11、抗衰老[21、抗輻射[3[4、抗突變|51[6][7等作用。由此可見，芫根是一種高價值的藥食兩用植物。本發明從芫根中提取具有很高藥用價值的總黃酮，確定了大孔樹脂吸附分離制備蕪根總黃酮的方法。
發明內容本發明的目的是提供一種芫根總黃酮的制備工藝，以使芫根總黃酮有效成分提取率高，符合工業大生產要求。本發明的目的通過以下技術方案實現一種芫根總黃酮的制備工藝，按以下步驟順次進行a)、取干燥品芫根，將其粉碎成粗粉；b)、加20%30%乙醇57倍量回流提取3次，每次1小時，過濾，濾液減壓回收乙醇，用蒸餾水調整藥材藥液的濃度至l:10;c)、采用AB-8或NKA-12大孔樹脂進行分離純化，動態吸附上樣，上樣速度為11.4BV;d)、上樣后，先用水洗脫，水洗用量為2BV;然后用70%乙醇洗脫，洗脫速度為2BV/h,洗脫劑用量4BV;e)、合并70%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥、粉碎，制得成品。上述b步驟中加30%乙醇7倍量回流提?。籧d步驟中采用AB-8大孔樹脂進行分離純化。上述芫根干燥品含水<4%,BV/h為倍柱體積/小時。本發明的另一目的是提供上述制成品中芫根總黃酮含量的測定方法。本發明的另一目的是這樣實現的一種工藝制成品中芫根總黃酮含量的測定檢測方法，包括下述步驟A)、對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品40mg置100ml量瓶中，加乙醇適量，于水浴上溫熱使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得；B)、標準曲線的制備精密量取對照品溶液O.Oml、1.0ml、2.0ml、3.0ral、4.0ml、5.0ml分別置25ml具塞試管中，各加乙醇使成5ml,加0.lmol/L三氯化鋁液3ml及lmol/L乙酸鉀液5ml，搖勻，放置40min,照比色法，以第一管做空白試驗，在415±lnm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；C)、測定法取本品約50mg,精密稱定，置IOOml量瓶中，加乙醇溫熱使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，初濾液棄去，精密量取續濾液5ml，置50ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取稀釋液3ml,置25ml具塞試管中，加乙醇使成5ral，照標準曲線制備下的方法，自"加0.lmol/L三氯化鋁液3ml"起，依法測定吸收度，以標準曲線中讀出供試液中含黃酮的量，計算，即得；本品含黃酮以(^3。016計算，不得少于50%。第一，本發明人通過實驗驗證回流法優于滲濾法和冷浸法；第二，并采用正交法實驗，并以影響醇提的三個因素如乙醇濃度、乙醇用量以及提取次數優選出最優醇提工藝條件；第三，從靜態吸附和動態吸附的實驗效果綜合考察，確定采用AB-8大孔樹脂分離純化；第四，通過上樣濃度實驗和吸附流速實驗，確定了上樣速度(為lBV/h);繪制并考察泄露曲線，確定最大上樣量(<1.4BV);第五，在實驗基礎上，確定了洗脫劑醇濃度及其洗脫速度以及水洗終點；第六，按確定吸附和洗脫條件，繪制了解吸曲線，最后確定洗脫劑用量為4BV。本發明以理論為依據，以實驗為基礎，并經實驗反復驗證，本工藝的芫根總黃酮提取率相對較高，且滿足工業大生產要求，可以直接應用在工業生產中。圖1是芫根黃酮含量測定標值曲線圖2是樣品液中總黃酮含量的泄露曲線圖3是樣品液中總黃酮含量的洗脫曲線圖。具體實施例方式芫根總黃酮的制備工藝按以下步驟順次進行a)、取干燥品芫根，將其粉碎成粗粉；b)、加20%30%乙醇5~7倍量回流提取3次，每次l小時，過濾，濾液減壓回收乙醇，用蒸餾水調整藥材藥液的濃度至l:10;c)、采用AB-8或NKA-12大孔樹脂進行分離純化，動態吸附上樣，上樣速度為lL4BV;d)、上樣后，先用水洗脫，水洗用量為2BV;然后用70%乙醇洗脫，洗脫速度為2BV/h，洗脫劑用量4BV;e)、合并水洗脫液和70%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥、粉碎，制得成品。所述b步驟中加30%乙醇7倍量回流提??；c步驟中采用AB-8大孔樹脂進行分離純化。具體實驗研究如下取干燥品芫根(含水<4%),將其粉碎成粗粉，加2030%乙醇57倍量回流提取3次，每次1小時，過濾，濾液減壓回收乙醇，用蒸餾水調整濃度為1:10(藥材藥液)，采用AB-8大孔樹脂進行分離純化，動態吸附上樣，上樣速度為lBV/h(l倍柱體積/小時)；上樣量不高于1.4BV;上樣后，先用水洗脫，水洗用量為2BV;然后用70%乙醇洗脫，洗脫速度2BV/h,洗脫劑用量犯V，合并70%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥，粉碎，即得。一、工藝路線選擇1、有效部位確定根據現有研究資料，芫根有效部位還不明確。文獻報道有抗癌[1、抗衰老[21、抗輻射[3]41、抗突變5[6][71等作用。對芫根不同溶劑部位進行抗腫瘤試驗。以選擇其有效部位。1.1樣品制備取芫根粉末，分別以石油醚、氯仿、乙醇、水依次進行提取。提取物濃縮至l:l備用，作為樣品。1.2抗腫瘤實驗在無菌條件下抽取接種傳代第7日的S咖肉瘤小鼠腹水，用生理鹽水以1:4比例稀釋，每只鼠0.2ml接種于小鼠右前肢腋窩皮下。接種后24h，將小鼠隨機分成8組模型對照組，陽性對照組(環磷酰胺50mg/kg),樣品組(40g/kg),各組均每日灌胃l次，連續10天。第ll天稱體重并處死動物，剝離瘤塊并稱重。按下式計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(XX(c—T)c]X100X，式中c為模型對照組平均瘤種，T為給藥組平均瘤重。結果見下表。表l芫根提取物對荷S,s。小鼠肉瘤的生長抑制作用(X士s)分組劑量(g/kg)瘤重(g)腫瘤抑制率(%)模型對照-1.698±0.795-石油醚提取物401.591±0.3426.30氯仿提取物401.702±0.497-0.24乙醇提取物401.047±0.482*38.34水提取物401.028±0.363*39.46環磷酰胺0.050.508±0.412**70.08與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。實驗結果顯示，荷瘤對照組小鼠腫瘤平均重量為1.698土0.795g,表明腫瘤生長良好，證實本實驗接種結果有效。對小鼠S!8。肉瘤的抑瘤率為乙醇提取物組為38.34%;水提取物組為39.46%，其他兩組基本沒有抑制腫瘤作用。結果表明，芫根抗腫瘤有效成分多集中在較高極性部位。2、工藝路線確定根據大生產實際情況和芫根有效部位為較高極性部位的性質，決定提取溶媒為低濃度乙醇。藥材提取后，提取液進行大孔樹脂吸附進行分離純化。二、工藝條件篩選芫根提取工藝條件研究1、提取方法1.1醇提工藝條件1.1.1乙醇濃度對提取效果的影響水平分別為0%、10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%。方法稱取芫根粗顆粒50克，按上述濃度加入乙醇300ml,加熱回流2次，每次1.5小時，合并濾液，定容至IOOOml，備用。評價指標根據文獻報道w及預試驗，芫根水提物中含黃酮類成分。因此，工藝研究過程中以總黃酮含量進行評價。結果見表2:表2不同醇濃度考察結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>20%3.132120%3.261530%4.450830%4.34354.393930%4.387450%3.140150%3.12163.02850%2.822360%3.121660%2.84252.951760%2.891070%3.109370%3.06833.204670%3.436180%2.983880%2.99093.154080%3.4874結果表明，30%乙醇提取效果優于其它濃度。1.1.2醇提方法的篩選乙醇常用的提取方法有滲漉法、冷浸法、回流法，故對這三種方法進行考察。實驗方法如下滲漉法稱取芫根粗顆粒50克，加30%乙醇100ml浸12小時，再加入500ml進行滲漉，收集滲漉液，定容至1000ml，備用。冷浸法稱取芫根粗顆粒50克，加30%乙醇300ml浸12小時，抽濾，藥渣再加250ml浸12小時，抽濾，濾液合并，定容至1000ml,備用。回流法稱取芫根粗顆粒50克，加30%回流提取兩次，第一次加300ml回流提取1.5小時，第二次加250ml回流提取1.0小時，合并濾液，定容至一定體積，備用。評價指標芫根總黃酮含量。結果見表3:表3不同提取方法的考察結果醇濃度總黃酮(％)平均值滲漉-13.2922滲漉-23.45053.3405滲漉-33.2788冷浸-11.0997冷浸-21.56561.2571冷浸-31.1060回流-14.4508回流-34.34354.3939回流-34.3874結果表明，回流法較優。1.1.3正交優選最佳醇提工藝影響醇提的主要因素有乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數。依據上述單因素考察的結果，以乙醇用量、提取時間、提取次數三個因素設計三個水平進行L9(34)正交實驗。實驗方法稱取芫根粗顆粒約25克，按正交表中的安排進行提取，合并濾液，定容至500ml,備用。評價指標芫根總黃酮含量。表4因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表5正交實驗安排表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>470.5251.03671.51790.53891.01991.52表6正交實驗安排及結果#膝縣列號總黃酮含量頭股5ABCD1111160.32122284.03133386.44213265.35221392.56232156.2312371.48323157.09331271.8I230.72196.92173.51224.61II213.94233.53221.00211.50III200.17214.38250.32208.72R30.5536.6176.8115.90由表6直觀分析可知，影響醇提條件各因素的大小順序為C〉B〉A，即提取次數對實驗影響最大。最佳工藝條件為即5倍量乙醇提取3次，每次1小時。表7芫根提取正交實驗方差分析表方差來源離差平方和自由度F值顯著性A156.095423.2489C1001.5884220.8463*B223.528324.6524誤差(D)48.04632*表示P<0.05。結果表明，提取次數具有顯著性差異。結合直觀分析，得醇提工藝路線為益智粗粉加5倍量30%乙醇加熱回流提取3次，每次1小時。驗證實驗按處方稱取藥材三份，每份50g，用篩選出的醇提工藝條件(30%乙醇，5倍量，提取3次，每次lh)進行提取，測定總黃酮含量，結果見表8。表8醇提正交驗證實驗數據表實驗號總黃酮含量(％)15.224.634.8平均值4.9結果顯示此醇提工藝條件較穩定、可行。1.2含量測定方法總黃酮的含量測定-紫外分光光度法對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品適量，加乙醇制成每毫升含0.04毫克的溶液，作為對照品溶液。最大吸收波長的選擇取對照品溶液分別在190nnT700nm波長范圍內進行掃描，結果最大吸收為415醒。標準曲線的制備精密量取對照品溶液O.Oml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml分別置25ml具塞試管中，各加乙醇使成5ml，加0.lmol/L三氯化鋁液3ml及lmol/L乙酸鉀液5ml，搖勻，放置40min,照比色法測定，以第一管做空白試驗，在415nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。測定法取樣品溶液水浴蒸干，加乙醇溫熱使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，初濾液棄去，精密量取續濾液5ml，置50ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取稀釋液3ml，置25ml具塞試管中，加乙醇使成5ml，照標準曲線制備下的方法，自"加0.lmol/L三氯化鋁液3ml"起，依法測定吸收度，以標準曲線中讀出供試液中含黃酮的量，計算，即得。2、芫根提取物除雜方法2.1芫根總黃酮提取液制備根據正交實驗的結果，以30%乙醇提取芫根總黃酮的得率最高，因此采用5倍量30%乙醇進行提取，提取液濃縮至1:2(藥材重量與藥液體積比)備用。經測定提取液中總黃酮含量約為42mg/mL左右。2.2樹脂的預處理清洗分離柱，防止污染，在吸附柱內加入相當于填裝樹脂體積0.4-0.5倍的95%乙醇，投入大孔樹脂。使其液面高于樹脂層0.3M,浸泡24小時。用2BV(倍體積)95X乙醇，以2BV的流速通過樹脂層，并浸泡4-5小時。用95%乙醇以2BV的流速通過樹脂層，洗至流出液加5倍水不呈白色渾濁為止，并用水以同樣的流速洗凈乙醇。用2BV的5XHCL溶液，以4-6BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2-4小時，并用水以同樣的流速洗凈至出水pH中性。用2BV的2XNAOH溶液，以4-6BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2-4小時，并用水以同樣的流速洗凈至出水pH中性。2.3樹脂的篩選考察了靜態吸附與動態吸附，以樹脂吸附與解吸附的效果作為篩選樹脂的指標。2.3.1靜態吸附將經過預處理的5種大孔樹脂去除表面水后，各取一定量分別置于具塞磨口三角瓶中，加入總黃酮濃度為42nig/raL的提取濃縮液適量，使其成為過飽和狀態，振搖24h,使樹脂充分吸附總黃酮后測定樹脂的靜態吸附效果，過濾取出吸附飽和的樹脂(得濾液l),向其中加入80niL體積分數95X乙醇振蕩24h使總黃酮解吸附，再過濾(得濾液2),分別測定濾液1和濾液2中總黃酮的濃度，結果如表9。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>NKA-93360248088026.19487.5NKA-1233601420194057.731787.5NKA-1233601380198058.92177590.69NKA-1233601380198058.921787.5D402033602060130038.69743.75D402033602100126037.5743.7558.93D402033602080128038.09775從靜態吸附與動態吸附的效果綜合考察，可以看出，AB-8的吸附及解吸效果均較好，因此采用AB-8大孔樹脂進行分離純化。2.4樹脂分離純化總黃酮的工藝參數考察2.4.1上樣濃度的考察將不同濃度的樣品液分別通過AB-8樹脂柱，進行動態吸附，檢查流出液，待流出液能測出總黃酮含量時，停止上樣，記錄上樣量。計算總黃酮吸附量。結果見表1。表11上樣濃度對芫根總黃酮吸附量的影響上樣濃度(藥材與體水洗黃酮含加入量總黃酮含吸附量平均吸附積比)量(mg)(ml)量mg(mg)吸附率％率％1:114751002850137548.245611:11512.510028501337.546.9298247.221:11525訓2850132546.491231:21387.510028501462.551.315791:213751002850147551.7543951.731:21362.510028501487.552.192981:56751002850217576.315791:5675訓2850217576.3157976.321:56751002850217576.315791:86601002850219076.842111:86801002850217076.1403576.611:86601002850219076.84211<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從表中結果可以看出，吸附流速越慢，吸附效果越好，因此擬確定上樣速度為lBV/h。(BV指倍體積，以下同)2.4.3泄漏曲線的繪制按上述所確定的吸附條件，取樣品液通過AB-8樹脂柱，進行動態吸附，分段收集流出液，每lOml收集l份，共收集10份，每份流出液過0.2um微孔濾膜，測定總黃酮含量，繪制泄漏曲線。結果見表13。表13泄漏曲線的考察<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從表及圖中結果可以看出，當上樣量大于1.4BV時，開始出現泄漏。_2.4.4洗脫劑濃度的考察按上述所確定的吸附條件，取樣品液分別通過4根AB-8柱，進行動態吸附。4根樹脂柱先用水洗脫至洗脫液近無色，再分別用30%、50%、70%和90%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，測定總黃酮含量。結果見表14。表14洗脫劑濃度的考察<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>含量mg/ml0.00790.00800.00790.00940.00970.00950.01060.01050.01100.00890.00860.0085平均值0.00790.00950.01070.0087從表中的結果可以看出，當洗脫劑醇濃度為70%時，洗脫效果最好，因此擬采用70%乙醇進行洗脫。2.4.5洗脫速度的確定按上述所確定的吸附條件進行動態吸附后，以70%乙醇為洗脫劑，分別以l、2、3BV/h的速度進行洗脫，測定乙醇洗脫液中總黃酮的含量。結果見表15。表15洗脫流速對總黃酮解吸效果的影響流速lBV/h2BV/h3BV/h12312323總黃酮含量mg/ml0.01090.01090.01090.01060.01060.01060.00980.00980.0098平均值0.01090.01060.0098從表中的結果可以看出，洗脫速度越慢，解吸效果越好，但lBV/h與2BV/h的差別不是很大，考慮到大生產上節約時間，提高效率等因素，擬采用2BV/h的流速洗脫。2.4.6水洗終點的考察將上述所確定的吸附條件進行動態吸附后，以70%乙醇為洗脫劑，每20ml收集1份，共收集12份，測定總黃酮含量，確定水洗終點及水洗用量。結果見表16。表16水洗終點及水洗用量的考察<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從表中結果可以看出，當水洗用量超過2BV(100ml)時，總黃酮的含量降低不明顯，同時實驗中也發現，水洗用量越多，總黃酮損失也越大，因此確定水洗用量為2BV。2.4.7解吸曲線的考察按上述所確定的吸附和洗脫條件，取樣品液進行上柱、吸附和洗脫，分段收集洗脫液，每10ml收集1份，第15份后每20ml收集l份，共收集20份，測定含量，繪制洗脫曲線。結果見表17。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從表及圖中可以看出，當收集到第18份時，總黃酮含量已經很低，考慮到大生產中節約時間及降低成本的原則，故確定洗脫終點為第18份(200ml),即洗脫劑用量為4BV。2.5驗證實驗按上述確定的工藝條件重復操作3次，計算總黃酮的含量。結果見表18。表18三批樣品驗證實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>~~~三批樣品的驗證實驗結果表明，該工藝穩定、可行。2.7結論由以上實驗篩選，得出芫根提取液大孔樹脂吸附除雜工藝為提取液減壓回收乙醇后，備用。采用AB-8大孔樹脂進行分離純化。調整為藥材與藥液比為l:10,動態吸附上樣，上樣速度為lBV/h;上樣量不高于1.4BV;上樣后，先用水洗脫，水洗用量為2BV;然后用70%乙醇洗脫，洗脫速度2BV/h,洗脫劑用量4BV，合并70%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥。權利要求1、一種芫根總黃酮的制備工藝，其特征是按以下步驟順次進行a)、取干燥品芫根，將粉碎成粗粉；b)、加20％～30％乙醇5～7倍量回流提取3次，每次1小時，過濾，濾液減壓回收乙醇，用蒸餾水調整藥材藥液的濃度至1∶10；c)、采用AB-8或NKA-12大孔樹脂進行分離純化，動態吸附上樣，上樣速度為1～1.4BV；d)、上樣后，先用水洗脫，水洗用量為2BV；然后用70％乙醇洗脫，洗脫速度為2BV/h，洗脫劑用量4BV；e)、合并70％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥、粉碎，制得成品。2、根據權利要求1所述芫根總黃酮的制備工藝，其特征是所述b步驟中加30%乙醇7倍量回流提取；c、d步驟中采用AB-8大孔樹脂進行分離純化。3、一種如權1工藝制成品中芫根總黃酮含量的測定檢測方法，其特征是包括下述步驟A)、對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品40mg置100ml量瓶中，加乙醇適量，于水浴上溫熱使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得；B)、標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml分別置25ml具塞試管中，各加乙醇使成5ml，加0.1mol/L三氯化鋁液3ml及1mol/L乙酸鉀液5ml，搖勻，放置40min，照比色法，以第一管做空白試驗，在415土lnm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；C)、測定法取本品約50mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加乙醇溫熱使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，初濾液棄去，精密量取續濾液5ml，置50ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取稀釋液3ml，置25ml具塞試管中，加乙醇使成5ml，照標準曲線制備下的方法，自"加0.1mol/L三氯化鋁液3ml"起，依法測定吸收度，以標準曲線中讀出供試液中含黃酮的量，計算，即得；本品含黃酮以<:27113()016計算，不得少于50%。全文摘要本發明公開了一種芫根總黃酮的制備工藝及其制成品中芫根總黃酮含量的測定方法。按以下步驟順次進行a)取干燥品芫根，將粉碎成粗粉；b)加20％～30％乙醇5～7倍量回流提取3次，每次1小時，過濾，濾液減壓回收乙醇，用蒸餾水調整藥材∶藥液的濃度至1∶10；c)采用AB-8或NKA-12大孔樹脂進行分離純化，動態吸附上樣，上樣速度為1～1.4BV；d)上樣后，先用水洗脫，水洗用量為2BV；然后用70％乙醇洗脫，洗脫速度為2BV/h，洗脫劑用量4BV；e)合并70％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥、粉碎，制得成品。經實驗證明，芫根總黃酮提取率高、工藝方法滿足大生產要求。文檔編號A61K36/31GK101204413SQ20071005079公開日2008年6月25日申請日期2007年12月14日優先權日2007年12月14日發明者輝梁,江春艷申請人:輝梁