專利名稱：展示狂犬病病毒保護性抗原的犬Ⅱ型腺病毒活載體重組疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用犬II型腺病毒不同結構蛋白的特性，分別展示狂 犬病病毒保護性抗原或抗原表位的重組疫苗，可用于新型動物狂犬病 疫苗的研制和應用。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的以非化膿性腦脊髓炎為主要特征 的一種重要人畜共患傳染病，感染人和動物后， 一旦發病，死亡率幾
乎是100%。我國是狂犬病的多發地，每年有上千人死于狂犬病，主
要是由帶病毒的犬咬傷引起。盡管目前人用商品疫苗安全有效，但大 量帶毒動物的存在仍然對人類生命安全構成了直接威脅。特別是近年 來，死于狂犬病的人數呈逐年上升的趨勢。因此，減少或控制狂犬病 病毒在家養動物中的貯集是有效控制人狂犬病發生的重要途徑。
目前用于動物狂犬病預防的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗，二 者對預防狂犬病的發生起到了積極重要的作用。但是滅活疫苗免疫周 期短，接種方式單一，不適于動物的田間免疫，而且在我國還沒有實 現國產化，進口滅活疫苗制備工藝復雜，成本昂貴，比較適用于發達 國家。弱毒疫苗在敏感動物體內有毒力返袓的危險，不能從根本上消 除狂犬病，因此，難以在我國得到推廣。
隨著對狂犬病病毒分子生物學特性的不斷研究，已證明糖蛋白是 唯一可以誘導機體產生中和抗體的狂犬病病毒結構蛋白。國際上許多 實驗室都開展了以糖蛋白為保護性抗原的亞單位疫苗、基因工程亞單
位疫苗、DNA疫苗等新型狂犬病疫苗的研究。雖然這些疫苗可以誘 導特異性中和抗體的產生，并具有一定的免疫保護力，但由于免疫原 性較弱，未得到實際應用。以痘病毒和人5型腺病毒為載體表達狂犬 病病毒糖蛋白的活載體重組疫苗研究取得了一定進展，在歐洲和北美 洲的免疫試驗證明，具有良好的免疫原性。但由于存在再次免疫排斥 或安全性問題，而未得到正式批準使用。為提高重組腺病毒疫苗的實際應用價值，目前，以人5型腺病毒為載體的展示疫苗己有研究，而 以犬II型腺病毒為載體的展示疫苗技術在國內外尚未見報道。
以犬II型腺病毒為載體的重組疫苗對犬科動物易感，也可在貓、 牛和豬等家畜動物體內有效復制，而且遺傳特性穩定，安全性好，在 新型狂犬病疫苗的研究中具有較大的開發潛力。本實驗室構建的表達 狂犬病病毒糖蛋白的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，已獲得國家發 明專利，并完成了在生產性試驗階段的生物安全評價，證明具有良好 的免疫效果和安全性。在此基礎上，為進一步提高犬II型腺病毒重 組疫苗的免疫效力和實際應用價值，本發明提供了一系列以犬II型 腺病毒結構蛋白展示表達狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位的重組 疫苗。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供展示狂犬病病毒保護性抗原或抗 原表位的犬II型腺病毒活載體重組疫苗。
本發明的技術方案是以犬II型腺病毒為載體，在其結構蛋白基因 的疏水性位點插入狂犬病病毒保護性抗原基因或表達抗原表位的核 苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結構蛋白融合表達。
進一步講，以犬II型腺病毒疫苗株為載體，在其結構蛋白六鄰粒、 纖突或IX蛋白上，利用這些結構蛋白基因自身的轉錄原件，融合表
達狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位，使其在犬II型腺病毒顆粒表 面得以展示，從而達到增強重組疫苗免疫效力的目的。免疫試驗證明， 該系列重組疫苗均可誘導產生高滴度的針對狂犬病病毒和犬腺病毒 的中和抗體，并能抵抗狂犬病病毒標準強毒株和犬腺病毒強毒株的攻擊。
首先，在不發生堿基缺失和不影響結構蛋白轉錄的前提下，對犬
II型腺病毒全基因組中六鄰粒、纖突或IX蛋白基因進行改造
1、 過重疊PCR分別在犬II型腺病毒全基因組六鄰粒基因超變區 的4個位點，按六鄰粒的轉錄閱讀框分別插入狂犬病病毒糖蛋白中和 抗原表位，使其與六鄰粒在腺病毒顆粒外表面融合表達；
2、 在犬II型腺病毒全基因組28106 bp處引入一段人工合成的核 酸序列(含XmaI酶切位點)，在XmaI酶切位點處，按纖突的轉錄 閱讀框插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其與纖突在腺病毒顆 粒外表面融合表達；3 、利用犬II型腺病毒IX蛋白基因內的限制性內切酶Ase I位點，
在IX蛋白轉錄終止密碼子處插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區基因和 SV40病毒多聚A轉錄終止信號，使IX蛋白與外源抗原表位利用同 一轉錄閱讀框在腺病毒顆粒外表面融合表達。
其次，狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位能隨重組犬II型腺病 毒結構蛋白一起轉錄，在病毒顆粒表面產生多個拷貝，其免疫效力好 于單一拷貝的重組疫苗；第三，重組疫苗的增殖、擴大培養以及免疫 接種的方式均與載體病毒疫苗株犬II型腺病毒一致；第四，動物接 種重組疫苗后，將同時獲得針對犬腺病毒感染和狂犬病病毒感染的免 疫力，并能抵抗正常致死劑量強毒株的攻擊。
展示狂犬病病毒保護性抗原的重組犬II型腺病毒的構建過程
1、 利用實驗室前期構建的含犬II型腺病毒全基因組質粒
pPOLYII-CAV2中兩個單一酶切位點得到含六鄰粒基因的大片段，將 其克隆入pET-28a載體，獲得重組質粒pET-LH。再利用pET-LH中 大片段的兩個單一酶切位點得到含六鄰粒基因的小片段，將其克隆入 pET-28a載體，獲得重組質粒pET-SH。通過重疊PCR將狂犬病病毒 中和抗原表位分別插入六鄰體超變區內的4個不同位點(分別在犬II 型腺病毒全基因組的17378 bp、 17450 bp、 17623 bp和18084 bp處)， 并將PCR產物克隆入pMD18-T載體，進行序列測定。測序正確后，
利用六鄰粒中兩個單一酶切位點將改造后的六鄰粒基因克隆入 pET-SH。最后，按照上述路線返向克隆，獲得重組犬II型腺病毒全 基因組。
2、 利用pBluescriptn KS(屮/一)中的酶切位點Sac I和Kpn I，插入 人工合成序列Linker SK (依次含Sal I、 Xma I、 Spe I和Pac I多個酶 切位點)，獲得重組質粒pBS-SKI。按纖突基因序列，人工合成犬II 型腺病毒全基因組序列28050 bp 28106 bp區段，并插入Linker SK 中Sal I Xma I之間，利用PCR獲得犬II型腺病毒全基因組中30182 bp 29358 bp序列，將兩片段插入Linker SK中Spe I Pac I之間， 獲得重組質粒pBS-SKII。再將狂犬病病毒中和抗原表位按纖突基因 的轉錄閱讀框插入pBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位點之間， 獲得改造后的纖突基因。最后，通過Linker SK中兩端的酶切位點Sal I和PacI，將改造的纖突基因插入pPOLYII-CAV2中，得到重組犬II 型腺病毒全基因組。
3、 利用pPOLYII-CAV2中兩個單一酶切位點得到含IX蛋白基因的大片段，將其克隆入pBluescriptII KS(:+Z—)載體，獲得重組質粒 pBS-LIX。再利用pBS-LIX中大片段的兩個單一酶切位點得到含IX 蛋白基因的小片段，將其克隆入pEGFP-Cl載體，獲得重組質粒 pEGFP-SIX。然后，在IX蛋白終止密碼子處，利用其自身的酶切位 點插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區基因與SV40多聚A轉錄終止序列， 實現IX蛋白與糖蛋白膜外區融合表達。最后，按照上述路線，返向 克隆獲得重組犬II型腺病毒全基因組。
4、堿裂解法大量制備各種重組犬II型腺病毒基因組質粒，分別 經Asc I和Pme I雙酶切游離全基因組后，通過脂質體轉染5pg基因 組DNA于犬腎傳代細胞系MDCK，隔天傳代1次，直至出現典型的 犬腺病毒病變(葡萄串狀)。
展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗免疫 原性
1、 利用MDCK細胞大量制備重組疫苗，并測定疫苗的TCID^(均 不低于1065TCID5Q/0.1ml)。取無狂犬病免疫史的家犬為試驗動物， 分別兩側股內側肌肉注射和口服接種。
2、 免疫時每條犬肌肉注射lml或口服2ml —種重組疫苗，免疫一 次，免疫前及免疫后每周采血并分離血清。
3、 采用熒光抗體狂犬病病毒中和試驗(FAVN)法，檢測免疫犬 血清中和抗體效價，結果顯示，重組疫苗誘導的平均中和抗體水平在 免疫后第3周時，均能達到國際最低保護水平(0.5IU/ml)以上，第 4 5周達到最高(4.62 6.43IU/ml)。通過血凝抑制試驗，檢測試驗 犬體內腺病毒抗體效價，結果顯示，重組疫苗誘導的腺病毒抗體水平 在免疫后第4周時最高，均為1:2，
展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗的免 疫保護作用
免疫6周后，對各試驗組動物進行攻毒，每組分別用100LDs。的 狂犬病病毒標準強毒CVS-24和犬腺病毒強毒進行攻毒。攻毒后對試 驗動物進行封閉隔離飼養，相互之間不接觸，每天觀察并記錄試驗動 物的采食和發病情況，觀察40天。結果顯示，口服和肌肉注射任何 一種重組疫苗的犬均可抵抗強毒的攻擊，存活率在90%以上。
具體實施方案
下面結合實施例，對本發明做進一步描述
實施例1:以六鄰粒展示狂犬病病毒保護性抗原的重組疫苗全基因組的克隆
Eco52 I和SnaB I雙酶切pPOLYII-CAV2，經瓊脂糖凝膠電泳回收 12516 bp片段，克隆入pET-28a載體，獲得重組質粒pET-LH。再用 Nde I和Mlu I雙酶切pET-LH，經瓊脂糖凝膠電泳回收4325 bp片段， 克隆至pET-28a載體，獲得重組質粒pET-SH。通過重疊PCR將狂犬 病病毒中和抗原表位分別插入六鄰體內4個不同位點，并將PCR產 物克隆至pMD18-T載體，進行序列測定。測序正確后，利用六鄰粒 Kpn I和Dra I兩個自然酶切位點將改造后的六鄰粒基因克隆入 pET-SH。最后，按照上述路線，返向克隆獲得4種重組犬II型腺病 毒全基 因 組質粒 pPolylI-CAV2/HVRl-GAP 、 pPolylI-CAV2/HVR2-GAP 、 pPoly:[I-CAV2/HVR3-GAP 和 pPolyII畫C AV2/HVR4-GAP 。
重疊PCR引物序列
HV(forward):
5 ，-ATATCAGGGGTACCCTAGACAGAG-35; HV(reverse):
5 ,-GGTGTGTATTTAAAGGCATCAGGC-3 ，； HVRl-GAP(fo歷rd):
5'-CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGCT GTCAC AAACAATACCTACCA-3'; HVRl畫GAP(reverse):
5,-TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGCAC AGTTATGGCACCTGCAGAGG-3,; HVR2畫GAP (forward):
5,-CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGAG CTGGGGGATGCGTCTGGCCG扁3 ，； HVR2-GAP(reverse):
5,畫TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGATC GACCCAGCTTTCAGGGCCCA隱3，； HVR3-GAP (forward):
5 ， -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGAC ATACTAGGTTC AGCC ATGCTATAC ACTGAAGATGT-3,; HVR3-GAP (reverse):
5 ， -TGAACCTAGTATGTC AATAGGGCTCC AGGATCCGAGGGTGGTCACCTTATAAAATCTGG-3'; HVR4-GAP (forward):
5'-CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCATTTC AGGC AGAAAATACCAATGT-3 ，； HVR4-GAP (reverse):
5，-TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGAAC CTTCATGGTGGTCATGTTTG-3'。
其中，在犬II型腺病毒全基因組17378 bp處插入外源基因時，用 引物HV和HVR1-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質粒 pPolylI-CAV2/HVRl-GAP;在17450 bp處插入時，用引物HV和 HVR2-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質粒 pPolylI-CAV2/HVR2-GAP;在17623 bp處插入時，用引物HV和 HVR3-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質粒 pPolylI-CAV2/HVR3-GAP;在18084 bp處插入時，用引物HV和 HVR4-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質粒 pPolylI-CAV2解R4-GAP 。
狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位DNA序列
5 ,-TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAG畫3'。
PCR反應條件
以在犬II型腺病毒全基因組17378 bp處插入外源基因為例，質粒 pET-SH為模板，HVR (reverse)和HVRl-GAP(forward)為引物，在 TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95 □預變性5min， 94□變性45s， 59口退火45s， 72口延伸lmin，共30個循環，得到突變位點左側片段 (2L)。以pET-SH為模板，HVR1-GAP (reverse)和HV(forward)為 引物，在TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95口預變性5min， 94口 變性45s， 56口退火45s， 72口延伸lmin，共30個循環，72口延伸10min 擴增突變位點右側片段(2R)。 PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收 純化。然后，進行第二步PCR，分別取25-50 ng 2L和2R片段充分 混勻作為模板，以HV(forward)和HV(reverse)為引物，在TaKaRaEx Taq DNA聚合酶作用下，95口預變性5min， 94口變性45s， 56C退火 45s， 72E]延伸lmin，共30個循環，擴增得到HVR1-GAP突變片段。 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收純化，連接到pMD18-T Vector,進行測序。在其他位置插入時以相同方法，利用各自引物進行重疊PCR 擴增。
實施例2:以纖突展示狂犬病病毒保護性抗原的重組疫苗全基因 組的克隆
利用pBluescriptII KS(十/一)中的酶切位點Sac I和Kpn I，插入人 工合成序列Linker SK (依次含Sal I、 Xma I、 Spe I和Pac I多個酶切 位點)，獲得重組質粒pBS-SKI。按纖突基因序列，人工合成犬II型 腺病毒全基因組序列28050 bp 28106 bp區段，并插入Linker SK中 Sal I Xma I之間，利用PCR獲得犬II型腺病毒全基因組中30182 bp 29358 bp序列，將兩片段插入Linker SK中Spe I Pac I之間， 獲得重組質粒pBS-SKII。再將狂犬病病毒中和抗原表位按纖突基因 的轉錄閱讀框插入pBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位點之間， 獲得改造后的纖突基因。最后，通過Linker SK中兩端的酶切位點Sal I和PacI，將改造的纖突基因插入pPOLYII-CAV2中，得到重組犬II 型腺病毒全基因組質粒pPOLYII-CAV2/Fiber-GAP。
Linker SK序列
Sense sequence:
5'隱CGTCGACAGTCCCGGGAGTGGCGCCAGTGGGCCCAGTAC TAGTGCCTTAATTAAGGTAC-3'; Antisense sequence:
5，-CTTAATTAAGGCACTAGTACTGGGCCCACTGGCGCCACTC CCGGGACTGTCGACGAGCT -3，。
人工合成犬II型腺病毒全基因組28050 bp 28106 bp區段序列 Sense sequence:
5，-TCGACGGTGCCCCCAGCAGAAGTATCGACTGCATGCTAAT TATTAACAAACCAAAAC畫3 ，； Antisense sequence:
5'-CCGGGTTTTGGTTTGTTAATAATTAGCATGCAGTCGATACT TCTGCTGGGGGCACCG-3，。
PCR引物序列Forward: 5 ，畫TGATCACCGCAACGGTGAATG-3' Reverse: 5，隱TGAGTATGATGATGCTCTTGCAC-3，
PCR反應條件
在TaKaRaExTaqDNA聚合酶作用下，95口預變性5min， 94匚:變 性45s， 55口退火45s， 72口延伸lmin，共30個循環，72口延伸10min。 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收純化，連接到pMD18-T Vector,進
行測序。
實施例3:以IX蛋白展示狂犬病病毒保護性抗原的重組疫苗全基 因組的克隆
EcoR I和Cla I雙酶切pPOLYII-CAV2，瓊脂糖凝膠電泳回收3610 bp片段，克隆入pBluescriptII KS(+/—)，獲得重組質粒pBS-LIX。 Mlu I與EcoR I雙酶切pBS-LIX，瓊脂糖凝膠電泳回收340 bp片段， 克隆入pEGFP-Cl，獲得重組質粒pEGFP-SIX。在IX蛋白終止密碼 子處，利用單一酶切位點Ase I插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區基因(G，) 與SV40多聚A轉錄終止信號序列，實現IX蛋白與糖蛋白膜外區融 合表達。最后，按照上述路線，返向克隆獲得重組犬II型腺病毒全 基因組質粒pPOLYII-CAV2/IX-G'。
實施例4:重組疫苗的包裝與鑒定
1、 重組疫苗的包裝
取改造的犬二型腺病毒質粒pPolylI-CAV2/HVRl-GAP 、 pPolylI-CAV2/HVR2-GAP 、 pPolylI-CAV2/HVR3-GAP 、 pPolyll-CAV2/HVR4-GAP ， pPOLYII畫CAV2/Fiber隱GAP 和 pPOLYII-CAV2/IX-G'各5fig，分別以Asc I和Pme I雙酶切釋放重組 的全基因組，利用LipofectamineTM2000轉染至MDCK細胞系，直到 細胞出現病變。
酶切條件
限制性內切酶Asc I和Pme I各10U， 10xBuffer 5(^1，質粒5pg， 加水補至5(^1。 37D水浴反應lh后，氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次， 2倍體積無水乙醇沉淀，滅菌四餾水溶解沉淀，—20口保存備用。
2、 重組疫苗的鑒定重組疫苗基因組鑒定
取50ml培養瓶內已呈葡萄串狀病變的單層MDCK細胞，傾棄培 養基，以PBS洗滌2次，加入800^il新鮮配制的細胞裂解液(0.6Q/。 SDS， 1 OmM EDTA ， 100^ g^ml蛋白酶K) ， 37 □溫育1 h ，加入200^11 5M NaCl ， 輕輕混勻后，冰水浴lh。將全部混合物移入離心管，于4LJ， 12000rpm 離心40min，上清移入加一離心管，以等體積酚:氯仿抽提2次，加入 終濃度0.25M醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，12000rpm離心10min， DNA沉淀以70。/。乙醇洗滌1次，無菌風干后，溶于5(V1去離子水。 以基因組為模板，PCR擴增外源基因，測序鑒定。
鑒定用PCR引物序列
□ CAV2/HVR1-GAP、 CAV2/HVR2-GAP、 CAV2/HVR3-GAP和 CAV2/HVR4-GAP鑒定用弓|物序列
Forward: 5 ， -GGTGTGTATTTAAAGGCATCAGGC-3'; Reverse: 5，匿ATATCAGGGGTACCCTAGACAGAG-3,。
口CAV2/Fiber-GAP鑒定用引物序列
Forward: 5 ， -AGCAGAAGTATCGACTGCAT-3';
Reverse: 5 ，-TGAGTATGATGATGCTCTTGCAC陽3'。
□ CAV2/IX-G'鑒定用引物序列
Forward: 5，-AGCTGAAGATCCAGGTGGCT-3';
Reverse: 5, -ACGCTGGACACGGTATTATC-3'。
PCR反應條件
同上。 TCID5Q的測定
將lxlO"MDCK細胞傳入96孔細胞培養板，每孔內細胞約lxl06， 補加培養基至100^1。次日，接入待測病毒樣品。在1 11孔內，進 行10" 10—n稀釋，A H列為同濃度重復。7天后，以Karber法計 算待測重組疫苗的TCID5o。
免疫原性鑒定(Western blotting)
取含狂犬病病毒SRV9株的細胞裂解液50^1，加等量2xSDS-PAGE 上樣緩沖液，沸水浴10min，冷卻至室溫，短暫離心后進行SDS-PAGE 電泳。電泳完畢，將膠上蛋白樣品電轉移到硝酸纖維素膜上，分別與 犬抗重組疫苗的多抗及陽性和陰性對照多抗、HRP標記兔抗犬二抗 反應，最后以DAB/H202顯色，根據顯色帶出現與否及其位置判定重 組疫苗是否表達狂犬病病毒抗原。毒力鑒定
取4 5月齡犬腺病毒和狂犬病病毒抗體陰性犬60條，按接種重 組疫苗不同分為6組，每組10條，分別用含1(fTCID5。和107TCID5。
的重組疫苗細胞培養液各肌肉注射5條犬。注射后，觀察注射犬的飲 食、精神狀態等表現，測量體溫、計數白細胞數量和其它臨床表現等， 并在4周后解剖注射犬，觀察犬體病理變化，并進行肝等主要臟器的 組織切片觀察。 穩定性鑒定
lxl(^MDCK細胞傳入25cn^細胞培養瓶內，細胞長成單層后，按 培養瓶內培養基體積的0.5%接入重組疫苗，接種后3 4天收毒，對 各種重組疫苗分別連續傳代40次，標記并保存每次的培養液，同時 每隔5代，提取感染細胞中的腺病毒基因組，通過PCR和DNA測序 鑒定外源基因的大小、方向和位置。
結果
1.各重組疫苗基因組內均正確插入了狂犬病病毒保護性抗原，轉 錄方向與病毒基因組轉錄方向一致；
2.0.1ml各重組疫苗的TCID5o無明顯差別，為1065 107;
3. 各重組疫苗均表達了狂犬病病毒糖蛋白中和表位，抗體可以與 狂犬病病毒糖蛋白特異性結合；
4. 毒力檢測結果顯示，注射犬未出現飲食和精神表現等異常，體 溫在正常范圍內G7.5 38.5口)。體內白細胞計數顯示，白細胞總數
(7.5 16.0xl09/L)分類計數均在正常范圍內，注射犬未出現藍眼或 厭食等臨床表現。解剖未見主要組織器官出現異常變化，重組疫苗注 射犬肺、肝和腎等組織切片與健康犬的組織切片無明顯區別。
5. 穩定性鑒定結果表明，各重組疫苗經過40代傳代，其基因組 (包括外源基因的大小、方向和位置)均保持不變，外源基因序列均
未發生改變。
實施例5:以六鄰粒展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒 活載體重組疫苗的免疫效果 實驗動物
狂犬病病毒和腺病毒抗體陰性的4 5月齡犬80條，隨機分為8 組，每組10條。 動物免疫分別以TCID5。為1065的重組疫苗CAV2/HVR1-GAP 、 CAV2/HVR2-GAP、 CAV2/HVR3-GAP和CAV2/HVR4-GAP對8組
犬進行免疫。每種重組疫苗各免疫20條犬，其中肌肉注射10條，lml/ 條；口服10條，2ml/條。 免疫檢測
免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN 檢測受試犬狂犬病病毒中和抗體水平。 攻毒試驗
免疫6周后，每組隨機抽取5條犬，以100LD5。狂犬病標準強毒 株CVS-24接種；其余犬以100 LDso犬I型和II型腺病毒強毒混合物 接種。隔離觀察各犬至接種后40天，詳細記錄各組犬的發病及死亡 情況。
結果
1. 所有受試犬的免疫前血清內檢不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒 的特異性抗體；
2. 所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗腺病毒抗體，至6 周時，抗體仍維持在較高水平；
3. 所有受試犬免疫后3 4周時，其血清中均可檢出狂犬病中和 抗體，抗體消長規律與腺病毒抗體一致；
4. 受試犬能抵抗犬I型與II型腺病毒強毒的攻擊，存活率為95%;
5. 受試犬能抵抗狂犬病強毒的攻擊，存活率為90%; 結論
4株不同重組疫苗均可誘導機體產生針對犬腺病毒和狂犬病病毒 的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染具有保護作用。 實施例6:以纖突展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活
載體重組疫苗的免疫效果 實驗動物
狂犬病病毒和腺病毒抗體陰性的4 5月齡犬20條，隨機分為2 組，每組10條。 動物免疫
分別以TCID5Q為10"的重組疫苗CAV2/Fiber-GAP對2組犬進行 免疫。其中肌肉注射10條，lml/條；口月艮10條，2ml/條。 免疫檢測
免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN檢測受試犬狂犬病病毒中和抗體水平。 攻毒試驗
免疫6周后，每組隨機抽取5條犬，以100LDso狂犬病標準強毒 株CVS-24接種；其余犬以100 LDso犬I型和II型腺病毒強毒混合物 接種。隔離觀察各犬至接種后40天，詳細記錄各組犬的發病及死亡 情況。
結果
1. 所有受試犬的免疫前血清內檢不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒 的特異性抗體；
2. 所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗腺病毒抗體，至6 周時，抗體仍維持在較高水平；
3. 所有受試犬免疫后3 4周時，其i清中均可檢出狂犬病中和 抗體，抗體消長規律與腺病毒抗體一致；
4. 受試犬能抵抗犬I型與II型腺病毒強毒的攻擊，存活率為95%;
5. 受試犬能抵抗狂犬病強毒的攻擊，存活率為90%; 結論
重組疫苗CAV2/Fiber-GAP可誘導機體產生針對犬腺病毒和狂犬 病病毒的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保護作 用。
實施例7:以IX蛋白展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒 活載體重組疫苗的免疫效果 實驗動物
狂犬病病毒和腺病毒抗體陰性的4 5月齡犬20條，隨機分為2 組，每組10條。 動物免疫
分別以TCID5。為1065的重組疫苗CAV2/IX-G'對2組犬進行免疫。 其中肌肉注射10條，lml/條；口月艮10條，2ml/條。 免疫檢測
免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN 檢測受試犬狂犬病病毒中和抗體水平。 攻毒試驗
免疫6周后，每組隨機抽取5條犬，以100LD5。狂犬病標準強毒 株CVS-24接種；其余犬以100 LDs。犬I型和II型腺病毒強毒混合物接種。隔離觀察各犬至接種后40天，詳細記錄各組犬的發病及死亡 情況。 結果
1. 所有受試犬的免疫前血清內檢不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒 的特異性抗體；
2. 所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗腺病毒抗體，至6 周時，抗體仍維持在較高水平；
3. 所有受試犬免疫后3 4周時，其血清中均可檢出狂犬病中和 抗體，抗體消長規律與腺病毒抗體一致；
4. 受試犬能抵抗犬I型與II型腺病毒強毒的攻擊，存活率為95%;
5. 受試犬能抵抗狂犬病強毒的攻擊，存活率為90%; 結論
重組疫苗CAV2/IX-G'可誘導機體產生針對犬腺病毒和狂犬病病 毒的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保護作用。
附改造后犬II型腺病毒結構蛋白基因序列 1.改造后犬II型腺病毒結構蛋白六鄰粒基因序列 重組疫苗CAV2/HVR1-GAP中六鄰粒基因序列<formula>formula see original document page 20</formula>CCTAA
加框<formula>formula see original document page 22</formula>CCACCTAA
,序列為狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位基因序列
重組疫苗CAV2/HVR3-GAP中六鄰粒基因序列:
ATGGCAGCCTAGCAGAGCTGGGGGATGCGTCTGGCCGTGCCCT
CCAAGTGCCAGAGGGTCAGGTTACAGGGGTGCAAGGGCTGGG<formula>formula see original document page 24</formula>加框序列為狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位基因序列
重組疫苗CAV2/HVR4-GAP中六鄰粒基因序列
ATGGCAGCCTAGCAGAGCTGGGGGATGCGTCTGGCCGTGCCCT
CTGGTGCACCAAGTGCCAGAGGGTCAGGTTACAGGGGTGCAA<formula>formula see original document page 26</formula>ACCACCTAA
加框序列為狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位基因序列
2.重組疫苗CAV2/Fiber-GAP中纖突基因序列
ACTTAGACTTATGGACGGAACATGGGGGCCCAGTAATGAGACCCTCTAAAAGCATTGTTTACATTAGGGTGATTATTAACAACGTCAG
CATACTCA
加框序列分別為Sal I、 Xma I和Pac I位點，下劃線部分是狂犬
病病毒中和抗原表位序列,
3.重組疫苗CAV2/IX-G'中IX蛋白序列GGGAAGGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAA
GCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACG
CGTAAT
加框
是犬II型腺病毒IX蛋白序列，下劃線部分是狂犬病病
毒糖蛋白膜外區序列，陰影部分是SV40poly(A)/
權利要求
1、一種展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，其特征在于以犬II型腺病毒為載體，在其結構蛋白基因的疏水性位點插入狂犬病病毒保護性抗原基因或表達抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結構蛋白融合表達。
2、 根據權利要求1所述的重組疫苗，其特征在于所述的疏水 性位點位于犬II型腺病毒結構蛋白六鄰粒、纖突或IX蛋白。
3、 根據權利要求1或2所述的重組疫苗，其特征在于利用重 疊PCR分別在犬II型腺病毒全基因組六鄰粒基因超變區的4個位點， 按六鄰粒的轉錄閱讀框分別插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使 其與六鄰粒在腺病毒顆粒外表面融合表達。
4、 根據權利要求1或2所述的重組疫苗，其特征在于在犬II型腺病毒全基因組28106 bp處引入一段人工合成的核酸序列，人工 合成的核酸序列含XmaI酶切位點，在XmaI酶切位點處，按纖突的 轉錄閱讀框插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其與纖突在腺病 毒顆粒外表面融合表達。
5、 根據權利要求1或2所述的重組疫苗，其特征在于利用犬 II型腺病毒IX蛋白基因內的限制性內切酶Ase I位點，在IX蛋白轉 錄終止密碼子處插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區基因和SV40病毒多聚 A轉錄終止信號，使IX蛋白與外源抗原利用同一轉錄閱讀框在腺病 毒顆粒外表面融合表達。
6、 根據權利要求3所述的重組疫苗，其特征在于利用含犬II 型腺病毒全基因組質粒pP0LYII-CAV2中兩個單一酶切位點得到含 六鄰粒基因的大片段，將其克隆入pET-28a載體，獲得重組質粒pET-LH。再利用pET-LH中大片段的兩個單一酶切位點得到含六鄰 粒基因的小片段，將其克隆入pET-28a載體，獲得重組質粒pET-SH， 通過重疊PCR將狂犬病病毒中和抗原表位分別插入六鄰體超變區內 的4個不同位點，其位點分別在犬II型腺病毒全基因組的17378 bp、 17450 bp、 17623 bp和18084 bp處，并將PCR產物克隆入pMD18-T 載體，進行序列測定，測序正確后，利用六鄰粒中兩個單一酶切位點 將改造后的六鄰粒基因克隆入pET-SH，最后，按照上述路線返向克隆，獲得重組犬n型腺病毒全基因組。
7、 根據權利要求4所述的重組疫苗，其特征在于利用pBluescriptn KS(十/一)中的酶切位點Sac I和Kpn I，插入人工合成序列Linker SK(依次含SalI、 Xmal、 Spe I和Pac I多個酶切位點)，獲得重組質粒 pBS-SKI。按纖突基因序列，人工合成犬II型腺病毒全基因組序列 28050 bp 28106 bp區段，并插入Linker SK中Sal I Xma I之間， 利用PCR獲得犬II型腺病毒全基因組中30182 bp 29358 bp序列， 將兩片段插入Linker SK中Spe I Pac I之間，獲得重組質粒 pBS-SKII，再將狂犬病病毒中和抗原表位按纖突基因的轉錄閱讀框插 入pBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位點之間，獲得改造后的 纖突基因，最后，通過Linker SK中兩端的酶切位點Sal I和Pac I， 將改造的纖突基因插入pPOLYII-CAV2中，得到重組犬II型腺病毒全 基因組。
8、 根據權利要求5所述的重組疫苗，其特征在于利用 pPOLYII-CAV2中兩個單一酶切位點得到含IX蛋白基因的大片段， 將其克隆入？811^0^111&8(+/—)載體，獲得重組質粒pBS-LIX，再利用pBS-LIX中大片段的兩個單一酶切位點得到含IX蛋白基因的小片段，將其克隆入pEGFP-Cl載體，獲得重組質粒pEGFP-SIX，然后，在IX蛋白終止密碼子處，利用其自身的酶切位點插入狂犬病病毒糖 蛋白膜外區基因與SV40多聚A轉錄終止序列，實現IX蛋白與糖蛋 白膜外區融合表達，最后，按照上述路線，返向克隆獲得重組犬II 型腺病毒全基因組。
9、根據權利要求1所述的重組疫苗，其特征在于所述的狂犬病病毒保護性抗原基因為狂犬病病毒糖蛋白膜外區序列為GGCCCAAATTCCCTATTTACACGATACCAGACACACTTGGTCTTGGTTGTGGAGGATGAAGGATGCACCAACCTGTCAGGGTTCTGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCTCTACACAGTCTTGTGATATTTTTACTAATAGTAGAGGGAAGAGAGCATCCAAGGGGAGCAAGACCTGTGGCTTTGTAGATGAAAGGGGCCTATATAACAAGACCTTGATGGAGGCTGAAGCTCACTACAAGTCAGTCAGGGTCTCAGGGGTTGACCTGGGTCTCCCGAACTGGGGGAAG 。
10、根據權利要求1所述的重組疫苗，其特征在于所述的表達 抗原表位的核苷酸序列為TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAG 或AGCATCTTGTTGTAGAGGAGGCTAGC 。
全文摘要
一種展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，涉及利用犬II型腺病毒不同結構蛋白的特性，分別展示狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位的重組疫苗，在其結構蛋白基因的疏水性位點插入狂犬病病毒保護性抗原基因或表達抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結構蛋白融合表達。本發明重組疫苗攻毒后對試驗動物進行封閉隔離飼養，觀察并記錄試驗動物的采食和發病情況，結果顯示，口服和肌肉注射任何一種重組疫苗的犬均可抵抗強毒的攻擊，存活率在90％以上。
文檔編號A61K39/205GK101406698SQ20071005598
公開日2009年4月15日 申請日期2007年8月22日 優先權日2007年8月22日
發明者曄 劉, 張守峰, 扈榮良, 忠 李 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所