專利名稱：：干細胞分化的制作方法
技術領域：
：本發明涉及調制干細胞分化的方法及所用抑制性RNA(RNAi)，所述方法包括將抑制性RNA(RNAi)導入干細胞以消除編碼與干細胞分化有關之多肽的mRNA。這些mRNA一般編碼分化的負調節物，除去這些mRNA能促使干細胞分化成特定的細胞類型。近年來，已開發出多種據稱能特異性消除基因和/或基因產物的技術。例如，使用反義核酸分子結合、近而阻斷或滅活靶mRNA分子不失為一種抑制基因產物產生的有效方法。在植物中，反義技術已產生多個顯著的表型特征，因此該方法對植物十分有效。然而，反義是可變的，因此需要篩選很多、有時為成百上千個攜帶一個或多個反義轉基因拷貝的轉基因生物體，以確保表型確實與反義轉基因表達相關聯。已將不必產生穩定轉染子的反義技術應用于培養物中的細胞，獲得了各不相同的結果。另外，經由同源重組破壞基因的能力為生物學家限定高等生物的發育路徑提供了至關重要的工具。使用小鼠基因“剔除”品系能仔細分析基因功能以及與缺失的小鼠基因相對應的人基因的適當功能(JordanandZant，1998)。特異性消除基因功能的最新技術是將雙鏈RNA，也稱抑制性RNA(RNAi)導入細胞，從而破壞與RNAi分子中包括的序列互補的mRNA。RNAi分子含有兩個彼此退火以形成雙鏈RNA分子的RNA互補鏈(有義鏈和反義鏈)。RNAi分子一般得自待消除基因的外顯或編碼序列。最新研究表明得自編碼序列的100-1000bpRNAi分子是有效的基因表達抑制劑。令人驚奇的是阻斷基因表達只需要幾種RNAi分子，這暗示著機理是催化性的。作用位點似乎是細胞核，因為在細胞質中好象檢測不到任何RNAi，這表明RNAi在mRNA合成或加工過程中發揮其作用。盡管有一些理論能解釋該現象，但仍不知道RNAi的精確作用機理。例如，所有生物已進化產生保護性機理來限制外源性基因表達的作用。例如，病毒經常對它所感染的生物體產生有害的作用。因此需要阻抑病毒基因表達和/或復制。另外，遺傳轉化的快速發展以及轉基因植物和動物的供應導致人們認識到轉基因也被認為是外源核酸，并會遇到多個被稱為消除(SingerandSelker，1995)，基因沉默(MatzkeandMatzke，1998)和共-抑制(Stametal.，2000)的現象。最初的使用RNAi的研究利用了線蟲Caenorhabditiselegans。將RNAi注射到蟲體，導致對應于含有RNAi分子的基因序列的多肽消失(Montgomeryetal.，1998；Fireetal.，1998)。最近，在多種真核生物中證實了RNAi抑制現象，所述生物包括例如，但不限于植物，錐蟲(Shietal.，2000)，果蠅(Drosophilaspp.)(KennerdellandCarthew，2000)。最新實驗已證實RNAi也可在高等真核生物中起作用。例如，已證實RNAi可消除小鼠卵母細胞中的c-mos以及小鼠植入前胚胎中的E-鈣粘著蛋白(WiannyandZernicka-Goetz，2000)。這表明可以對早期胚胎細胞的發育前景施加影響。在哺乳動物發育過程中，形成胚胎的一部分直至胚泡形成的細胞據稱是全能性的(例如每個細胞都具有發育形成完整胚胎以及支持所述胚胎生長和發育所需的所有細胞的潛能)。在形成胚泡的過程中，含有內細胞團的細胞據稱是多能性的(例如每個細胞具有發育形成多種組織的潛能)。原則上，胚胎干細胞(ES細胞，具有多能性)可得自兩種胚胎來源。分離自內細胞團的細胞被稱為胚胎干(ES)細胞。在實驗室小鼠中，類似的細胞可得自原生殖細胞培養物，所述原生殖細胞分離自交配后8.5-12.5天的胚胎的腸系膜或生殖嵴。這些細胞最終會分化成生殖細胞，可稱之為胚胎生殖細胞(EG細胞)。這些類型的多能細胞中的每一種都具有類似的、能分化成可變細胞類型的發育潛能，但行為(例如與印記有關)上可能出現的差異導致這些細胞與其它細胞區分開來。一般說來，ES/EG細胞培養物具有定義恰當的特征。這些特征包括但不限于i)當在成纖維細胞飼養層上維持時，可在培養物中維持至少20代；ii)在培養物中產生被稱為胚狀體的細胞群；iii)在單層培養物中能分化成多種細胞類型；iv)當與胚胎宿主混合時，可形成胚胎嵌合體；v)表達ES/EG細胞特異性標記。直至最近，體外培養人ES/EG細胞仍是不可能的。WO96/22362中首次說明可以測定在培養物中建立人ES/EG細胞所需的條件。該申請描述了細胞系和生長條件，所述條件能連續增殖靈長類動物的ES細胞，所述ES細胞表現出與具有多能性特征的干細胞有關的一系列特征或標記。最近，Thomson等(1998)公開了在培養物中建立人ES細胞所需的條件。人ES細胞系也顯示出靈長類動物ES細胞所顯示的上述特征。另外，人細胞系還顯示出高水平的端粒酶活性，和能以未分化狀態在培養物中持續分裂的細胞特征。另一研究小組(Reubinoff等，2000)也報道了從人胚泡中獲得人ES細胞。第三個小組(Shamblott等，1998)描述了EG細胞的獲得。在成纖維細胞飼養層的存在下，ES/EG細胞的特征是它們能將以未分化狀態分裂的能力保持幾代。如果除去飼養層，細胞就會分化。經常分化至神經元或肌肉細胞，但仍不清楚其精確的發生機理及其控制方式。除了ES/EG細胞外，多種成年組織含有具有干細胞特征的細胞。通常，盡管這些細胞保留了分化成不同細胞類型的能力，但它們不具有ES/EG細胞的多能性特征。例如，造血干細胞具有形成所有造血系統細胞(紅血細胞，巨噬細胞，嗜堿細胞，嗜酸性粒細胞等)的潛能。所有神經組織，皮膚和肌肉保留了具有干細胞潛能的細胞庫。因此，除了在發育生物學中能使用胚胎干細胞外，也有一些成年干細胞能用于測定控制細胞分化的因子。最新研究表明一些以前被認為只會定向分化成單個組織(例如神經元)的干細胞在某些情況下實際上具有相當大的多能性。最近已證實神經干細胞能與小鼠胚胎嵌合并形成寬范圍的非-神經組織(Clark等，2000)。另一組與發育生物學相關的細胞是畸胎瘤細胞(EC細胞)。這些細胞形成被稱為畸胎瘤的腫瘤，并具有很多與ES/EG細胞共同的特征。其中最重要的特征是多能性特征。畸胎瘤含有寬范圍的分化組織，數百年前，就已知人的畸胎瘤。它一般作為男性和女性的性腺腫瘤出現。一般相信這些腫瘤的性腺形式源自生殖細胞，據認為通常具有相同組織范圍的多余性腺形式是由胚胎發生過程中錯誤遷移的生殖細胞引起的。因此，一般將畸胎瘤歸類為包含多種不同類型癌癥的生殖細胞腫瘤。這些癌癥包括精原細胞瘤，胚胎瘤，卵黃囊瘤和絨毛膜瘤。已將EC細胞與ES/EG細胞類似的生物學用于研究細胞的發育方向以及鑒定EC細胞和ES/EG細胞共同表達的細胞標記。例如但不限于特異性細胞表面標記SSEA-3(+)，SSEA-4(+)，TRA-1-60(+)，TRA-1-81(+)(Shevinsky等1982；Kannagi等1983；Andrews等1984a；Thomson等，1995)；堿性磷酸酶(+)(Andrews等，1996)和Oct4(Scholer等，1989；Kraft等，1996；Reubinoff等，2000；Yeom等，1996)的表達。我們積累了表達研究，所述研究已鑒定出多個據認為參與決定干細胞、特別是胚胎干細胞的發育方向的基因。通過Northern印跡，我們鑒定出兩個信號傳導途徑的人同系物的表達，據信所述途徑對于決定細胞命運而言是至關重要的。已闡明Notch和Wingless信號傳導級聯系統的配體，受體和下游組分的表達。我們使用模型系統NTERA2/D1胚胎瘤細胞，記錄細胞分化時一些組分表達的變化。記住這些級聯系統在動物界胚胎發育過程中所起的作用，這些變化表明Wingless和Notch信號傳導途徑對干細胞分化起著顯著作用。另外，一些基因的活性是沿特定途徑發生分化所必需的，例如肌源基因MyoD1。其它基因具有抑制沿特定途徑的細胞分化的活性。我們設想通過下列方法調節干細胞分化以產生特定的細胞類型(i)抑制某些通常能促進沿特定途徑分化的基因；因此促進分化以改變細胞表型；(ii)抑制防止分化成特定細胞類型的基因活性；和(iii)(i)和(ii)的組合，見圖1胚胎發生，成年組織更新和創傷修復過程中的干細胞分化受到很嚴格的調節該調節過程的畸變會導致形成發育過程中的新生缺陷，并被認為可以導致成年人形成癌癥。一般說來，人們設想使這種干細胞處于正調節和負調節之下，從而使對細胞增殖和細胞分化過程的控制達到精細的水平在損害細胞分化的情況下過度增殖可導致形成組織腫塊-癌癥-而在損害增殖的情況下過度分化可導致損失干細胞并長期產生極小的分化組織，尤其會喪失再生潛能。已鑒定出某些基因對防止干細胞分化具有負作用。所述基因與Notch家族中的基因一樣，當經突變獲得活性時，可以抑制分化；所述突變基因作為癌基因起作用。相反，這種基因抑制功能的喪失會導致干細胞分化。我們建議使用EC細胞作為我們的模型細胞系統以跟蹤RNAi對細胞命運的作用。根據本發明的第一方面，提供了調制干細胞分化狀態的方法，所述方法包括(i)使干細胞與至少一種抑制性RNA(RNAi)分子接觸，所述分子含有能介導所述細胞分化的至少一個步驟的基因序列或其有效部分；(ii)提供有助于上述(i)中處理的細胞生長和分化的條件；和任選地(iii)維持和/或儲存分化狀態的細胞。上述(i)中的干細胞可以是畸胎瘤細胞。在本發明的優選方法中，所述條件是體外細胞培養條件。在本發明的優選方法中，所述干細胞選自多能性干細胞，如胚胎干細胞或胚胎生殖細胞；和譜系受限的干細胞，例如但不限于造血干細胞，肌肉干細胞，神經干細胞，皮膚真皮鞘干細胞。顯然，該方法可提供中間定型的干細胞。例如，胚胎干細胞可按程序分化成具有有限定型的造血干細胞。或者，中間定型的分化細胞或干細胞能重新按程序進入更加多能的狀態，由此可獲得其它分化的細胞譜系。在本發明另一個優選的方法中，所述干細胞是胚胎干細胞或胚胎生殖細胞。在本發明另一個優選的方法中，所述基因編碼干細胞表達的細胞表面受體。在本發明另一個優選的方法中，所述細胞表面受體選自人Notch1(hNotch1)；hNotch2；hNotch3；hNotch4；TLE-1；TLE-2；TLE-3；TLE-4；TCF7；TCF7L1；TCFFL2；TCF3；TCF19；TCF1；mFringe；1Fringe；rFringe；sel1；Numb；Numblike；LNX；FZD1；FZD2；FZD3；FZD4；FZD5；FZD6；FZD7；FZD8；FZD9；FZD10；FRZB。在本發明另一個優選的方法中，所述基因編碼配體。通常，配體是與相關受體結合以誘導或抑制細胞內或細胞間反應的多肽。配體可以是可溶性的或與膜結合的。在本發明另一個優選的方法中，所述配體選自D11-1；D113；D114；Dlk-1；Jagged1；Jagged2；Wnt1；Wnt2；Wnt2b；Wnt3；Wnt3a；Wnt5a；Wnt6；Wnt7a；Wnt7b；Wnt8a；Wnt8b；Wnt10b；Wnt11；Wnt14；Wnt15。或者，所述基因選自SFRP1；SFRP2；SFRP4；SFRP5；SK；DKK3；CER1；WIF-1；DVL1；DVL2；DVL3；DVL1L1；mFringe；1Fringe；rFringe；sel11；Numb；LNXOct4；NeuroD1；NeuroD2；NeuroD3；Brachyury；MDFI。在本發明另一個優選的方法中，所述序列含有至少一個列入本文作為參考的表4中鑒定的序列。在本發明另一個優選的方法中，所述基因選自DLK1；Oct4；hNotch1；hNotch2；RBPJk和CIR。在本發明另一個優選的方法中，所述基因是DLK1。優選DLK1RNAi分子得自含有圖2a所示序列的核酸序列。在本發明另一個優選的方法中，所述基因是Oct4。優選Oct4RNAi分子得自含有圖2b所示序列的核酸序列。在本發明另一個優選的方法中，所述基因是hNotch1。優選所述hNotch1RNAi分子得自含有圖2c所示序列的核酸序列。在本發明另一個優選的方法中，所述基因是hNotch2。優選所述hNotch2RNAi分子得自含有圖2d所示序列的核酸序列。在本發明另一個優選的方法中，所述基因是RBPJk。優選所述RBPJkRNAi分子得自含有圖2e所示序列的核酸序列。RBPJk也被稱為CBF-1。在本發明另一個優選的方法中，所述基因是CIR。優選所述CIRRNAi分子得自含有圖2f所示序列的核酸序列。最近30年來，已開發出很多種便于將核酸導入細胞的方法，所述方法是本領域眾所周知的，并可用于RNAi。將核酸導入細胞的方法一般包括使用化學試劑，陽離子脂質或物理方法。便于細胞攝入DNA的化學方法包括使用DEAE-Dextran(VaheriandPaganoScience175p434)。DEAE-dextran是帶負電的陽離子，它與核酸結合并將核酸導入細胞。磷酸鈣也是常用的化學試劑，當與核酸共沉淀時，可將核酸導入細胞(Graham等，Virology(1973)52p456)。使用陽離子脂質(例如脂質體(Felgner(1987)Proc.Natl.Acad.SciUSA，84p7413))已成為一種普通的方法。脂質的陽離子頭與待導入的帶負電的核酸骨架結合。脂質/核酸復合物與細胞膜結合并與細胞融合以將結合的核酸導入細胞。與現有的方法相比，脂質體介導的核酸轉移具有幾個優點。例如，使用脂質體介導的轉移能更加容易地轉染對傳統的化學方法不適應的細胞。最近，導入核酸的物理方法已成為可再現地轉染細胞的有效方法。直接進行微量注射就是這樣一種方法，它可以將核酸直接傳遞至細胞核(Capecchi(1980)Cell，22p479)。該方法允許分析單個細胞轉染子。所謂的“biolistic”法使用顆粒槍將核酸物理射入細胞和/或細胞器(Neumann(1982)EMBOJ，1p841)。電穿孔是可論證的、最常用于轉染核酸的方法。該方法包括使用高壓電荷瞬間穿透細胞膜，使它們能透過大分子復合物。最近，一種被稱為免疫穿孔的方法已成為公認的、用于將核酸導入細胞的技術，參見Bildirici等，Nature(2000)405，p298。該技術包括使用被針對特異性受體的抗體包被的珠。轉染混合物包括核酸，抗體包被的珠和表達特異性細胞表面受體的細胞。包被的珠結合細胞表面受體，當將剪切力應用于細胞時，珠會從細胞表面剝離。在除去珠的過程中會產生瞬時的小洞，籍此核酸和/或其它生物分子能進入細胞。根據所用核酸的不同，可獲得40-50％的轉染效率。另外，通過使RNAi與特異性抗體，配體或受體結合或連接，可以增強RNAi的細胞傳遞特異性。根據本發明的另一方面，提供了RNAi分子，其特征在于它含有至少一種基因的編碼序列，所述基因介導干細胞分化中的至少一個步驟。在優選的實施方案中，所述編碼序列是外顯子。或者，所述RNAi分子得自內含子序列或5’和/或3’-非編碼序列，所述序列側翼于介導干細胞分化的基因的編碼/外顯子序列。在本發明另一個優選的實施方案中，RNAi分子的長度為100bp-1000bp之間。更優選RNAi的長度選自100bp；200bp；300bp；400bp；500bp；600bp；700bp；800bp；900bp；或1000bp。更優選所述RNAi至少為1000bp。在本發明另一個優選的實施方案中，RNAi分子的長度為15bp和25bp之間，優選所述分子為21bp。在本發明另一個優選的實施方案中，所述RNAi分子含有列入本文作為參考的表4中鑒定的序列。在本發明的優選實施方案中，所述RNAi分子得自選自下列的基因DLK1；Oct4；hNotch1；hNotch2；RBPJk和CIR。優選所述RNAi分子含有選自圖2a-2f所示核酸序列的核酸序列。在本發明另一個優選的實施方案中，所述RNAi分子含有經修飾的核糖核苷酸堿基。本領域技術人員清楚地知道包含經修飾的堿基，以及天然堿基胞嘧啶，尿嘧啶，腺苷和鳥苷可賦予含有所述經修飾堿基的RNAi分子以有利特性。例如，經修飾的堿基可增加RNAi分子的穩定性，從而減少產生所需效果所需的量。根據本發明的另一方面，提供了分離的DNA分子，其含有如表4中鑒定的DNA登記號所示的基因序列，所述基因介導干細胞分化中的至少一個步驟，其特征在于所述DNA與至少一種能促進與其連接的所述DNA轉錄的其它DNA分子(“啟動子”)可操作連接。在本發明的優選實施方案中，所述基因選自DLK1；Oct4；hNotch1；hNotch2；RBPJk和CIR。優選所述DNA含有選自圖2a-2f所示序列的序列。在本發明的另一個優選實施方案中，所述基因與至少兩種啟動子一起被提供，其特征在于所述啟動子的定向使得含有所述DNA分子的兩條DNA鏈被轉錄成RNA。本領域技術人員清楚地知道通過提供包括與啟動子序列可操作連接的靶基因或靶基因片段的載體，可以合成形成RNAi的RNA分子。通常，啟動子序列是噬菌體RNA聚合酶啟動子(例如T7，T3，SP6)。提供具有多克隆位點的載體是有利的，因為可將基因或基因片段亞克隆至所述位點。通常需改造載體，使得噬菌體啟動子側翼于含有所需基因的多克隆位點。噬菌體啟動子的定向使得一個啟動子合成有義RNA，另一個噬菌體啟動子合成反義RNA。因此，能方便地合成RNAi。或者，可通過經由寡-合成技術產生嵌合啟動子/基因融合物，而將靶基因或靶基因片段直接與噬菌體啟動子融合。通過聚合酶鏈反應能容易地擴增所產生的構建體，從而為制備含有RNAi的RNA分子提供模板。根據本發明的另一方面，提供了包含本發明的DNA分子的載體。根據本發明的另一方面，提供了制備RNAi分子的方法，所述方法包括(i)提供根據本發明的DNA分子或載體；(ii)提供能合成含有所述RNAi分子的每條RNA鏈的試劑和條件；和(iii)提供使每條RNA鏈至少在部分長度上，或者至少在對應于編碼所述干細胞基因的核酸序列的部分能夠結合的條件，所述基因介導干細胞分化。優選所述基因或基因片段選自表4所示的基因。RNA的體外轉錄是已建立的方法學。試劑盒可以商購，其中提供了便于產生RNA的載體，核糖核苷三磷酸，緩沖液，RNase抑制劑，RNA聚合酶(如噬菌體T7，T3，SP6)。根據本發明的另一方面，提供了促進干細胞分化的體內法，所述方法包括給動物施用有效量的、足以影響靶干細胞分化的根據本發明的RNAi。優選所述方法促進內源性干細胞的體內分化以原位修復組織損害。本領域技術人員清楚地知道RNAi依靠靶基因RNA和RNAi分子之間的同源性。這會在靶向干細胞時賦予RNAi分子顯著水平的特異性。例如，在骨髓中發現造血干細胞，可通過直接注射至骨髓組織而將RNAi分子施用給動物。可將RNAi分子裹入脂質體膠囊中，以提供免受動物免疫系統和/或動物血清中存在的核酸酶破壞的保護作用。脂質體是脂質基載體，它將選定的治療劑裹入膠囊中，然后導入患者。通常，可由純的磷脂或磷脂和磷酸甘油酯的混合物制備脂質體。一般情況下，所制備的脂質體的直徑小于200nm，這樣可以使其被注射至靜脈內，并能穿過肺毛細血管床。另外，脂質體的生物化學特性賦予其穿透血管膜的穿透性，從而能進入選定組織。脂質體還具有相對較短的半壽期。已開發出所謂的STEALTH脂質體，它含有包被在聚乙二醇(PEG)中的脂質體。當靜脈內給藥于患者時，經PEG處理的脂質體具有顯著增加的半壽期。另外，STEALTH脂質體顯示出減少的網狀內皮系統攝入和增強的選定組織積累。另外，已開發出所謂的免疫-脂質體，該脂質體將脂質基載體與一種或多種抗體混合，用于增加RNAi分子傳遞至選定細胞/組織的特異性。US5580575和US5542935中描述了脂質體作為傳遞工具的用途。本領域技術人員清楚地知道可以以口或鼻噴霧劑，氣霧劑，懸浮劑，乳劑和/或滴眼液的方式提供RNAi分子。或者也可以以片劑的形式提供RNAi分子。或者，傳遞方式包括吸入或噴霧。根據本發明的另一方面，提供了治療組合物，其含有至少一種本發明的RNAi分子。優選所述RNAi分子用于制備藥劑，所述藥劑可用于促進干細胞分化以提供分化的細胞/組織用以治療疾病，其中細胞/組織被所述疾病破壞。所述疾病一般包括惡性貧血；中風，神經變性疾病，如帕金森病，早老性癡呆；冠狀心臟病；肝硬化；糖尿病。顯然，可以使用分化的干細胞替換因為例如替換脊髓組織而損害的神經。在本發明的另一個優選實施方案中，所述治療性組合物還含有稀釋劑，載體或賦形劑。根據本發明的另一方面，提供了治療性的細胞組合物，其含有通過導入本發明的RNAi分子或組合物而產生的分化細胞。根據本發明的另一方面，提供了可通過本發明的方法獲得的細胞。在本發明的優選實施方案中，所述細胞選自神經細胞；間充質細胞；肌肉細胞(心肌細胞)；肝細胞；腎細胞；血液細胞(如紅細胞，CD4+淋巴細胞，CD8+淋巴細胞)；胰腺β細胞；上皮細胞(如肺，胃)；和內皮細胞。根據本發明的另一方面，提供了可通過本發明的方法獲得的細胞培養物。根據本發明的另一方面，提供了至少一種含有至少一種本發明的細胞的器官。以下將參照下列附圖和表，僅通過實施例描述本發明的實施方案。表1描述了用于監測干細胞分化的抗體的選擇；表2描述了用于評價干細胞分化的mRNA標記的核酸探針；表3描述了干細胞分化的蛋白質標記；表4描述了用于產生基因特異性抑制所用的RNAi的特異性引物和具有DNA數據庫登記號的基因序列；表5簡要描述了圖3所示的FACS數據；圖1闡明干細胞分化受正和負調節物的控制(A)。所獲得的特定細胞表型是激活或抑制特定分化事件的正和負調節物的直接結果。可以使用RNAi控制干細胞最初的分化(A)，并通過阻抑一般會促進特定細胞命運的正激活物來控制分化細胞D1和D2最終的命運；圖2a描述了用于擴增δ-樣1(DLK1)的正向和反向引物以及擴增的序列；圖2b描述了用于擴增Oct4的正向和反向引物以及擴增的序列；圖2c描述了用于擴增Notch1的正向和反向引物以及擴增的序列；圖2d描述了用于擴增Notch2的正向和反向引物以及擴增的序列；圖2e描述了用于擴增RBPJK的正向和反向引物以及擴增的序列；和圖2f描述了用于擴增CIR的正向和反向引物以及擴增的序列；圖3描述了用針對Notch(A)，RBPJk(B)，Oct4(C)的RNAi和對照RNAi(D)轉染之后，監測NTERA2c1D1人EC細胞的SSEA3表達的FACS掃描圖。用針對a)Notch1和Notch2；b)RBPJk；c)Oct4的RNAi；和d)對照RNAi轉染4天之后，通過流式細胞熒光測定分析NTERA2c1D1人EC細胞的SSEA3表達。每組顯示出兩個在用單克隆抗體MC631(抗SSEA3)，接著用經FITC標記的山羊抗-小鼠IgM染色細胞之后，細胞數目對log熒光強度(任意單位)的直方圖。在每組中，一個直方圖得自用除RNAi以外的所有相關試劑處理的“模擬”轉染細胞；每組中的第二個直方圖得自用針對上述基因套的RNAi處理過的細胞。注意在描述SSEA3+和SSEA3-群體(分別被標記為M1和M2的區域)的所有情況下，細胞表現出兩種形式的直方圖。注意在用針對Notch1和Notch2(A組)和Oct4(C組)的RNAi處理之后，SSEA3+群體的熒光強度明顯下移，這顯示出干細胞分化的證據。在用RBPJk處理的細胞(B組)中，也能明顯看到向下的較小變化。如果這些基因產物在維持未分化的EC細胞表型中起作用，并且如果用針對導致這些關鍵性的調節蛋白下調的相應mRNA的RNAi處理的話，這種結果就是預期的結果。相反，用對照RNAi(D組)處理不會導致SSEA3的任何下調。SSEA3的表達似乎是未分化的EC干細胞表型的非常敏感的標記，并且是通過分化而消失的最快速的標記之一(Fenderson等，1987；Andrews等，1996)。類似地，人ES細胞也表達SSEA3(Thomson等，1998)，通過其分化也可快速消失(PWAndrews和JSDraper，結果未公開)；圖4描述了(A)闡明Notch和Wnt信號傳導途徑的圖。圖中顯示了Notch和Wnt信號傳導途徑。δ/Serrate/Lag(DSL)家族的配體結合Notch受體，導致激活Hairless(Su-H)/CBF1/RBPJk的抑制基因，并使靶基因的轉錄增強。(B)通過Northern印跡分析NTERA2EC細胞中DLS配體Dlk和Notch靶基因TLE1的表達。將TLE1鑒定為NTERA2EC細胞中Notch途徑的靶基因。在視黃酸誘導的分化過程中，TLE1顯示出與DSL配體Dlk1高度類似的表達模式。用RA處理3天(RA3)后，兩個基因顯著下調。在隨后的時間點，可觀察到表達在漸進恢復，一直到RA處理21天(RA21)后。TLE1下調表明細胞已進入分化途徑。(C)對經RNAi處理的ES細胞中的TLE1和HASH1進行RTPCR分析。用dsRNA處理3天后，對TLE1和HASH1進行RT-PCR。泳道1水；泳道2未經處理的ES細胞；泳道3模擬轉染；泳道4Notch1&2dsRNA；泳道5Dlk1dsRNA；泳道6RBPJkdsRNA；泳道7CIRdsRNA；泳道8Oct4dsRNA；泳道9對照dsRNA。注意泳道5和6中的TLE1表達特異性降低，在所述泳道對應的樣品中，Notch信號傳導途徑的組分已被dsRNA靶向。還注意到泳道5中出現HASH1。這些數據表明細胞開始運行神經分化程序(delaPompa等，ConservationoftheNotchsignallingpathwayinmammalianneurogenesis，Development124，1139-1148(1997))。Notch1&2dsRNA無法導致類似效果的原因是受體系統的功能過多，或與其它途徑組分相關的受體過度豐富。圖5描述了人ES細胞的RNAi，其中使用了得自不同的、與干細胞分化有關的基因的RNAi分子，并使用RTPCR監測mRNA的穩態水平。用dsRNA處理3天后，通過RTPCR分析人胚胎干細胞中靶轉錄物的豐度。泳道1水；泳道2未經處理的ES細胞；泳道3模擬轉染；泳道4Notch1&2dsRNA；泳道5Dlk1dsRNA；泳道6RBPJk(CBF1)dsRNA；泳道7CIRdsRNA；泳道8Oct4dsRNA；泳道9對照dsRNA。注意用dsRNA處理之后，靶轉錄物豐度的特異性降低至少持續3天。在用Notch1&2，RBPJk(CBF1)和Oct4dsRNA處理的細胞中，這種效果尤其明顯。將β肌動蛋白PCR用作PCR的模板上樣對照。圖6描述了NTERA2/D1的RNAi，其中使用了得自不同的、與干細胞分化有關的基因的RNAi分子，并使用RTPCR監測mRNA的穩態水平。用dsRNA處理17小時后，通過RTPCR分析人胚胎瘤細胞系NTERA2中靶轉錄物的豐度。泳道1水；泳道2未經處理的EC細胞；泳道3Oct4dsRNA；泳道4對照dsRNA；泳道5RBPJkdsRNA；泳道6Notch1&2dsRNA；泳道7模擬轉染。注意靶轉錄物豐度的特異性降低至少持續3天。在用Notch1&2，RBPJk(CBF1)和Oct4dsRNA處理的細胞中，這種效果尤其明顯。將β肌動蛋白PCR用作PCR的模板上樣對照。材料和方法細胞培養在含10％CO2的潮濕氣氛中，在添加有10％v/v胎牛血清(GIBCOBRL)的DMEM(高葡萄糖配方)(DMEM)(GIBCOBRL)內，按文獻(Andrews等，1982，1984b)所述，以高細胞密度維持NTERA2和2102Ep人EC細胞系。合成雙鏈RNA針對所需mRNA序列設計PCR引物以使產物大小為500bp左右。在每個引物的5’末端添加T7RNA聚合酶啟動子，其含有下列序列之一TAATACGACTCACTATAGGG；AATTATAATACGACTCACTATA。使用這些引物對適當的cDNA來源(例如得自欲靶向的細胞類型)進行PCR，克隆產物，對其進行測序以證實其同一性。使用經測序的克隆為模板，按需要再次進行PCR以產生RNA合成所用的模板DNA。在每種情況下，通過瓊脂糖電泳少量PCR產物以證實產物大小和豐度，而通過堿性苯酚/氯仿提取純化其余PCR產物。根據廠商提供的方法，使用Megascript試劑盒(Ambion公司)合成RNA，并用酸性苯酚/氯仿提取所述RNA。在單個反應中同時合成RNA互補鏈使得對退火步驟的需求不復存在。然而，通過瓊脂糖凝膠電泳進一步證實合成RNA的品質和雙鏈化，所需產物的遷移方式與所預期的相同長度的雙鏈DNA的遷移方式相同。用dsRNA處理人細胞以產生RNAi下列方法描述了6孔培養板中所培養細胞的RNAi。針對較大或較小的培養容器，可以適當調節體積和細胞數目的規模。在處理前一天，以每孔500,000個細胞的密度接種細胞，并在其普通培養基中培養細胞。針對待處理的每個孔，用300μl150mMNaCl稀釋9.5μg所需雙鏈RNA。在稀釋的RNA溶液中加入21μlExGen500(MBIFermentas)，渦旋混合。室溫下保溫dsRNA/ExGen500混合物10分鐘。然后加入3ml新鮮的細胞生長培養基，產生RNAi處理培養基。從培養容器中吸出生長培養基，每孔替代以3mlRNAi處理培養基。然后以280g離心培養容器5分鐘，再將培養容器放回溫箱中。12-18小時之后，用普通生長培養基替換RNAi處理培養基，按需維持細胞。產生Oct4RNAi針對所需的Oct4mRNA序列設計PCR引物以使產物大小為500bp左右。在每個引物的5’末端添加T7RNA聚合酶啟動子，其含有下列序列taatacgactcactataggg。使用這些引物對適當的cDNA來源(例如得自欲靶向的細胞類型)進行PCR，克隆產物，對其進行測序以證實其同一性。使用經測序的克隆為模板，按需要再次進行PCR以產生RNA合成所用的模板Oct4DNA。在每種情況下，通過瓊脂糖電泳少量PCR產物以證實產物大小和豐度，而通過堿性苯酚/氯仿提取純化其余PCR產物。根據廠商提供的方法，使用Megascript試劑盒(Ambion公司)合成RNA，并用酸性苯酚/氯仿提取所述RNA。在單個反應中同時合成RNA互補鏈使得對退火步驟的需求不復存在。然而，通過瓊脂糖凝膠電泳進一步證實合成RNA的品質和雙鏈化，所需產物的遷移方式與所預期的相同長度的雙鏈DNA的遷移方式相同。用Oct4dsRNA處理人EC細胞以產生RNAi下列方法描述了6孔培養板中所培養細胞的Oct4RNAi。針對較大或較小的培養容器，可以適當調節體積和細胞數目的規模。在處理前一天，以每孔500,000個細胞的密度接種細胞，并在其普通培養基中培養細胞。在處理的當天，在待處理的每個孔中的100μlOptimem(GibcoBRL)內加入每份為15μl的Lipofectin(GibcoBRL)等分試樣。同時，在待處理的每個孔中的300μlOptimem內加入6μgOct4dsRNA。室溫下保溫Lipofectin-Optimem和dsRNA-Optimem溶液40分鐘，然后混合產生每孔總體積約為415μl的RNAi處理培養基。使用前在室溫下將處理培養基保溫10分鐘。屆時，從細胞中吸出生長培養基，并用3mlPBS沖洗每個孔。然后用RNAi處理培養基代替PBS進行沖洗，每孔再添加0.5mlOptimem。將培養容器放回溫箱中達6.5小時，然后吸出處理培養基，替代以普通生長培養基。處理3天后，通過PCR檢測靶mRNA抑制作用。將RNAi導入細胞系在6孔培養板中的3cm3Dulbecco改進的Eagles培養基內，以2×105個細胞/孔的密度接種人EC干細胞，放置3小時。在培養基中加入6μgRNAi，室溫下振蕩細胞30分鐘。在培養基中加入胎牛血清(GIBCOBRL)至濃度為10％，培養細胞。產生總RNA抽吸生長中的細胞培養物以除去DME和胎牛血清。通過用磷酸緩沖鹽水沖洗除去極少量的胎牛血清。在細胞中加入新鮮的PBS，使用酸洗玻璃珠從培養容器中取出細胞。以300xg離心所得細胞懸浮液。從沉淀物中吸出PBS。以1ml/107個細胞的量加入Tri試劑(Sigma，USA)，室溫下放置10分鐘。于4℃，以12000xg將該反應的裂解物離心15分鐘。將所得水相轉移至新容器中，加入0.5ml異丙醇/mltrizol以沉淀RNA。于4℃，以12000xg離心10分鐘以沉淀RNA。除去上清液，用70％乙醇洗滌沉淀物。將經洗滌的RNA溶解于經DEPC處理的雙蒸水中。分析因暴露于RNAi而導致的EC干細胞分化暴露于對應于特定的關鍵性調節基因的RNAi之后，用多種方法監測EC細胞隨后的分化。一種方法是監測干細胞表型典型標記的消失；另一種方法是監測與所導致的特定譜系有關的標記的出現。相關標記包括表面抗原，mRNA類和特定的蛋白質。通過抗體染色和FACS分析轉染子用胰蛋白酶(0.25％v/v)將細胞處理5分鐘以分散細胞；洗滌并重新懸浮細胞至2×105個細胞/ml。于4℃，在旋轉振蕩器上，在96孔培養板內，將該細胞懸浮液與50μl第一抗體保溫1小時。將骨髓瘤細胞系P3X63Ag8的上清液用作陰性對照。以100rpm離心96孔培養板3分鐘。用含有5％胎牛血清的PBS將培養板洗滌3次以除去未結合的抗體。然后于4℃，將細胞與50μl適當的FITC-綴合的第二抗體保溫1小時。用PBS+5％胎牛血清將細胞洗滌3次，并使用EPICSeliteESP流式細胞計數器(Coultereletronics，U.K.)進行分析(Andrews等，1982)。對RNA進行Northern印跡分析RNA分離所依賴0的原理一般與標準DNA相同，但不同的是RNA傾向于與其自身或其它RNA分子雜交。在凝膠基質中使用甲醛以與RNA的胺基反應并形成Schiff堿。對純化的RNA進行標準的瓊脂糖凝膠電泳。對大多數RNA而言，1％瓊脂糖凝膠就足夠了。在1XMOPS緩沖液中制備瓊脂糖，并加入0.66M甲醛。重建干燥的RNA樣品，在RNA上樣緩沖液中變性，并上樣于凝膠中。電泳凝膠約3小時(直至染料到達凝膠的3/4處)。獲得RNA的清晰印跡的主要問題是存在甲醛。將電泳過的凝膠浸泡在蒸餾水中20分鐘，并且換4次水，以從基質中除去甲醛。轉移部件的裝配方式與DNA(Southern)印跡的完全相同。但是所用轉移緩沖液是10XSSPE。將凝膠轉移過夜。將膜浸泡在2XSSPE中以從轉移部件中除去任何瓊脂糖，將RNA固定在膜上。使用短-波(254nM)UV光進行固定。將固定的膜烘1-2小時以驅除任何殘留的甲醛。在含甲酰胺的水相中進行雜交以降低給定探針的雜交溫度。在Northern預雜交溶液中使RNA印跡預雜交2-4小時。于95℃將經標記的DNA探針變性5分鐘，并加入印跡中。所有雜交步驟都在溫箱的搖瓶中進行。在預雜交溶液中，使探針雜交過夜至少16小時。使用一套標準的洗滌溶液。通過使用含有洗滌緩沖液的較低濃度的鹽獲得洗滌嚴緊度。下列為洗滌程序2XSSPE15分鐘室溫2XSSPE15分鐘室溫2XSSPE/0.1％SDS45分鐘65℃2XSSPE/0.1％SDS45分鐘65℃0.1XSSPE15分鐘室溫制備經放射性標記的DNA探針使用Feinberg和Vogelstein的方法(Feinberg和Vogelstein，1983)對DNA進行放射性標記。簡單地說，該方法使用隨機序列六核苷酸，在變性DNA模板的多個位點處引發使用KlenowDNA聚合酶I片段的DNA合成。使用預先形成的試劑盒將有助于結果的一致性。在水中制備5-100ngDNA片段(得自PCR或限制性消化的凝膠純化產物)，于95℃與隨機的六聚體一起變性5分鐘。在冰上淬滅冷卻混合物，加入下列組分5μl[α-32P]dATP3000Ci/mmol1μlKlenowDNA聚合酶(4U)然后在37℃保溫反應1小時。用自旋柱(NucleonBiosciences)除去未摻入的核苷酸。產生cDNA使用被寡(dT)和(dN)引物引發的、重組Moloney-鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉錄酶的3’至5’聚合酶活性，使RNA酶促轉變為單鏈cDNA。使用單鏈cDNA進行逆轉錄-聚合酶鏈反應。由1μgpoly(A)+RNA合成cDNA，或者使總RNA與下列組分保溫1.0μM寡(dT)引物(針對總RNA)或隨機六聚體(針對mRNA)0.5mM10mMdNTP混合物1U/μlRNA酶抑制劑(Promega)1.0U/μl溶于廠商提供的緩沖液的M-MLV逆轉錄酶(Promega)于42℃將反應保溫2-3小時。熒光自動測序為了檢查用于產生RNAi生產所用模板的PCR引物的特異性，使用經棱鏡熒光標記的鏈終止測序試劑盒(Perkin-Elmer)進行自動測序(Prober等，1987)。在8μl棱鏡預混合物中加入適當量的模板(200ng質粒，100ngPCR產物)，10μM測序引物(一般為50％G-C含量的20聚體)，使總反應體積達到20μl。進行24輪PCR(94℃10秒，50℃10秒，60℃4分鐘)。熱循環之后，通過加入2μl3M醋酸鈉和50μl100％乙醇沉淀產物。以13000rpm將DNA沉淀至Eppendorf微量離心管中，用70％乙醇洗滌1次，真空干燥。通過機構內部的測序服務(Krebs研究所)分析樣品。將干燥的樣品重新懸浮于4μl甲酰胺上樣緩沖液中，變性并上樣于ABI373自動測序儀。收集粗序列，使用ABI棱鏡軟件進行分析，所提供的結果為分析的直方圖形式。通過SDS-PAGE和Western印跡檢測特異性蛋白質靶為了得到細胞裂解物，用添加有2mMCaCl2的冰冷的PBS將細胞單層沖洗3次。于4℃，將細胞與1ml/75cm2燒瓶裂解緩沖液(1％v/vNP40，1％v/vDOC，0.1mMPMSF，溶于PBS)保溫15分鐘。將細胞裂解物轉移至eppendorf管中，并流經21號針頭以剪切DNA。接著進行凍融，再進行離心(30分鐘，4℃，15000g)以除去不溶性物質。使用商購的蛋白質檢測法(Biorad)測定上清液的蛋白質濃度，將濃度調節為1.3mg/ml。通過加入4倍Laemmli電泳樣品緩沖液并煮沸5分鐘來制備SDS-PAGE樣品。用16μg蛋白質在10％聚丙烯酰胺凝膠(Laennli，1970)上電泳之后，將蛋白質轉移至孔徑為0.45μm的硝酸-纖維素膜上。用PBS和0.05％吐溫(PBS-T)洗滌印跡。用含5％奶粉的PBS-T封閉印跡(60分鐘，室溫)。將印跡與適當的第一抗體保溫。使用經辣根過氧化物酶標記的第二抗體，通過ECL(Amersham，Bucks.，UK)觀察抗體結合。除非另有說明，SDS-PAGE和Western印跡所用的材料得自Biorad(California，USA)。表1用于檢測干細胞分化的抗體表2用于評價分化的mRNA標記的探針表3通過Western印跡和/或免疫熒光檢測的分化蛋白質標記通過適當的商購抗體檢測下列抗體表4用于產生基因特異性抑制所用dsRNA的特異性引物所有序列以5’至3’方向書寫表5如圖中所述，用dsRNA處理的NTERA2細胞亞群SSEA-3(+)和SSEA-3(-)(M1和M2)的平均熒光強度參考文獻AndrewsP.W.，GoodfellowP.N.，ShevinskyL.，BronsonD.L.andKnowlesB.B.1982.CellsurfaceantigensofaclonalhumanembryonalcarcinomacelllineMorphologicalandantigenicdifferentiationinculture.Int.J.Cancer.29523-531.AndrewsP.W.，BantingG.S.，DamjanovI.，AmaudD.andAvnerP.1984a.Threemonoclonalantibodiesdefiningdistinctdifferentiationantigensassociatedwithdifferenthighmolecularweightpolypeptidesonthesurfaceofhumanembryonalcarcinomacells.Hybridoma.3347-361.AndrewsP.W.，DamjanovI.，SimonD.，BantingG.，CarlinC.，DracopoliN.C.andFoghJ.1984b.PluripotentembryonalcarcinomaclonesderivedfromthehumanteratocarcinomacelllineTera-2Differentiationinvivoandinvitro.Lab.Invest.50147-162.AndrewsP.W.，NudelmanE.，HakomoriS.-i.andFendersonB.A.1990.DifferentpatternsofglycolipidantigensareexpressedfollowingdifferentiationofTERA-2humanembryonalcarcinomacellsinducedbyretinoicacid，hexamethylenebisacetamide(HMBA)orbromodeoxyuridine(BUdR).Differentiation.43131-138.FendersonB.A.，AndrewsP.W.，NudelmanE.，ClausenH.andHakomoriS.-i.1987.Glycolipidcorestructureswitchingfromglobo-tolacto-andganglio-seriesduringretinoicacid-induceddifferentiationofTERA-2-derivedhumanembryonalcarcinomacells.Dev.Biol.12221-34.Kannagi，R.，Levery，S.B.，Ishigami，F.，Hakomori，S.，Shevinsky，L.H.，Knowles，B.B.andSolter，D.(1983)NewgloboseriesglycosphingolipidsinhumanteratocarcinomareactivewiththemonoclonaIantibodydirectedtoadevelopmentallyregulatedantigen，stage-specificembryonicantigen3.J.Biol.Chem.258，8934-8942.Shevinsky，L.H.，Knowles，B.B.，Damjanov，I.andSolter，D.(1982)Monoclonalantibodytomurineembryosdefinesastage-specificembryonicantigenexpressedonmouseembryosandhumanteratocarcinomacells.Cell30，697-705.Solter，D.andKnowles，B.B.(1978)Monoclonalantibodydefiningastage-specificmouseembryonicantigen(SSEA-1).Proc.natl.Acad.Sci.USA75，5565-5569.RecentprogressinidentifyinggenesregulatinghematopoieticstemcellfunctionandfateCraigTJordan，GaryVanZantCurrentOpinioninCellBiology1998，10716-720.SingerMJ，SelkerEU.GeneticandepigeneticinactivationofrepetitivesequencesinNeurosporacrassaRIP，DNAmethylation，andquelling.CurrTopMicrobiolImmunol.1995；197165-77.MatzkeMA，MatzkeAJ.Genesilencinginplantsrelevanceforgenomeevolutionandtheacquisitionofgenomicmethylationpatterns.NovartisFoundSymp.1998；214168-80；discussion181-6.Review.StamM，deBruinR，vanBloklandR，vanderHoornRA，MolJN，KooterJM.Distinctfeaturesofpost-transcriptionalgenesilencingbyantisensetransgenesinsinglecopyandinvertedT-DNArepeatloci.PlantJ.2000Jan；21(1)27-42.MontgomeryKK，XuS，FireA.RNAasatargetofdouble-strandedRNA-mediatedgeneticinterferenceinCaenorhabditiselegans.ProcNatlAcadSciUSA.1998Dec22；95(26)15502-7.FireA，XuS，MontgomeryMK，KostasSA，DriverSE，MelloCC.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature.1998Feb19；391(6669)806-11KennerdellJR，CarthewRW.HeritablegenesilencinginDrosophilausingdouble-strandedRNA.NatBiotechnol.2000Aug；18(8)896-898.ShiH，DjikengA，MarkT，WirtzE，TschudiC，UlluE.GeneticinterferenceinTrypanosomabruceibyheritableandinducibledouble-strandedRNA.RNA.2000Jul；6(7)1069-76.WiannyF，Zernicka-GoetzM.Specificinterferencewithgenefunctionbydouble-strandedRNAinearlymousedevelopment.NatCellBiol.2000Feb；2(2)70-5ThomsonJA，Itakovitz-EldorJ，ShapiroSS，WaknitzMA，SwiergielJJ，MarshallVS，JonesJM.Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science.1998Nov6；282(5391)1145-7.ThomsonJA，KalishmanJ，GolosTG，DurningM，HarrisCP，BeckerRA，HearnJP.Isolationofaprimateembryonicstemcellline.ProcNatlAcadSciUSA.1995Aug15；92(17)7844-8.ProberJM，TrainorGL，DamRJ，HobbsFW，RobertsonCW，ZagurskyRJ，CocuzzaAJ，JensenMA，BaumeisterK.AsystemforrapidDNAsequencingwithfluorescentchain-terminatingdideoxynucleotides.Science.1987Oct16；238(4825)336-41.FeinbergAP，VogelsteinB.AtechniqueforradiolabelingDNArestrictionendonucleasefragmentstohighspecificactivity.AnalBiochem.1983Jul1；132(1)6-13.MullisKB，FaloonaFA.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction.MethodsEnzymol.1987；155335-50.ScholerHR，HatzopoulosAK，BallingR，SuzukiN，GrussP.Afamilyofoctamer-specificproteinspresentduringmouseembryogenesisevidenceforgermline-specificexpressionofanOctfactor.EMBOJ.1989Sep；8(9)2543-50.KraftHJ，MosselmanS，SmitsHA，HohensteinP，PiekE，ChenQ，ArtztK，vanZoelenEJ.Oct-4regulatesalternativeplatelet-derivedgrowthfactoralphareceptorgenepromoterinhumanembryonalcarcinomacells.JBiolChem.1996May31；271(22)12873-8.ReubinoffBE，PeraMF，FongCY，TrounsonA，BongsoA.Embryonicstemcelllinesfromhumanblastocystssomaticdifferentiationinvitro.NatBiotechnol.2000Apr；18(4)399-404.ShamblottMJ，AxelmanJ，WangS，BuggEM，LittlefieldJW，DonovanPJ，BlumenthalPD，HugginsGR，GearhartJD.Derivationofpluripotentstemcellsfromculturedhumanprimordialgermcells.ProcNatlAcadSciUSA.1998Nov10；95(23)13726-31.ClarkeDL，JohanssonCB，WilbertzJ，VeressB，NilssonE，KarlstromH，LendahlU，FrisenJ.Generalizedpotentialofadultneuralstemcells.Science.2000Jun2；288(5471)1660.權利要求1.RNAi分子，其特征在于所述分子得自至少一種Notch/Wnt信號途徑基因或其有效部分。2.根據權利要求1的RNAi分子，其中所述RNAi分子得自外顯子。3.根據權利要求1或2的RNAi分子，其中所述RNAi分子的長度為100bp-1000bp。4.根據權利要求3的RNAi分子，其中所述RNAi分子的長度選自100bp；200bp；300bp；400bp；500bp；600bp；700bp；800bp；900bp；和1000bp。5.根據權利要求1或2的RNAi分子，其中所述RNAi分子的長度至少為1000bp。6.根據權利要求1或2的RNAi分子，其中所述分子的長度為15bp到25bp。7.根據權利要求6的RNAi分子，其中所述分子的長度為21bp。8.根據權利要求1中的RNAi分子，其中所述分子得自選自DII-1；DII3；DII4；DLK-1；Jagged1；Jagged2；Notch1；Notch2；Notch3；Notch4；TLE-1；TLE-2；TLE-3；TLE-4；TCF7；TCFFL2；TCF3；TCF19；TCF1；mfringe；lfringe；rFringe；Sell；Numb；LNX；Wnt1；Wnt2；Wnt2B；Wnt5A；Wnt6；Wnt7A；Wnt8B；Wnt10B；Wnt11；Wnt14；Wnt15；Wnt16；FZD1；FZD2；FZD3；FZD4；FZD5；FZD6；FZD7；FZD8；FZD9；FZD10；FRZB；SFRP1；SFRP2；SFRP4；SFRP5；SK；CER1；WIF-1；DVL1；DVL2；DVL3；Oct4；Brachyury；NeuroD1；NeuroD2；NeuroD3；MyoD；MDFI；及REST的DNA數據庫登錄號定義的序列。9.根據權利要求8的RNAi分子，其中所述RNAi得自選自下列的基因DLK1；Oct4；hNotch1；hNotch2；RBPJk和CIR。10.根據權利要求9的RNAi分子，其中所述RNAi分子得自選自SEQIDNO3、SEQIDNO6、SEQIDNO9、SEQIDNO12、SEQIDNO15和SEQIDNO18所示核酸序列的核酸序列。11.根據權利要求1、2、4、7、8、9、10中任一項的RNAi分子，其中所述分子含有經修飾的核糖核苷酸堿基。12.制備RNAi分子的方法，所述方法包括(i)提供至少一種Notch/Wnt信號途徑基因或其有效部分的分離的DNA分子或含有所述DNA分子的載體；(ii)提供能合成包含所述RNAi分子的每條RNA鏈的試劑和條件；和(iii)提供條件，所述條件使每條RNA鏈能夠結合其長度的至少一部分、或者對應于編碼所述干細胞基因的核酸序列的其至少一部分，所述基因介導干細胞分化。13.根據權利要求12的方法，其中所述基因選自DII-1；DII3；DII4；DLK-1；Jagged1；Jagged2；Notch1；Notch2；Notch3；Notch4；TLE-1；TLE-2；TLE-3；TLE-4；TCF7；TCFFL2；TCF3；TCF19；TCF1；mfringe；lfringe；rFringe；Sell；Numb；LNX；Wnt1；Wnt2；Wnt2B；Wnt5A；Wnt6；Wnt7A；Wnt8B；Wnt10B；Wnt11；Wnt14；Wnt15；Wnt16；FZD1；FZD2；FZD3；FZD4；FZD5；FZD6；FZD7；FZD8；FZD9；FZD10；FRZB；SFRP1；SFRP2；SFRP4；SFRP5；SK；CER1；WIF-1；DVL1；DVL2；DVL3；Oct4；Brachyury；NeuroD1；NeuroD2；NeuroD3；MyoD；MDFI；及REST的DNA數據庫登記號鑒定的基因。14.治療性組合物，其含有至少一種根據權利要求1-11中任一項的RNAi分子。15.根據權利要求14的治療性組合物，其進一步含有稀釋劑，載體或賦形劑。16.權利要求1-11中任一項的至少一種RNAi分子在制備藥劑中的用途，所述藥劑用于促進干細胞分化以提供分化的細胞/組織用以治療疾病，其中所述細胞/組織被所述疾病破壞。17.根據權利要求16的用途，其中所述疾病選自惡性貧血；中風，神經變性疾病，如帕金森病，早老性癡呆；冠狀心臟病；肝硬化；和糖尿病。18.根據權利要求16或17的用途，所述藥劑進一步含有稀釋劑，載體或賦形劑。19.治療性的細胞組合物，其含有通過導入權利要求1-11中任一項的RNAi分子而產生的分化細胞。20.通過體外調制選自胚胎干細胞，胚胎生殖細胞或畸胎瘤細胞的多能性干細胞的分化狀態的方法獲得的細胞，所述方法包括(i)使所述干細胞與與權利要求1-11中任一項的至少一種RNAi分子接觸；(ii)提供有助于上述(i)中處理的細胞生長和分化的條件；和任選地(iii)維持和/或儲存分化狀態的細胞。21.根據權利要求20的細胞，其選自神經細胞；肌肉細胞；肝細胞；腎細胞；血液細胞；胰腺β細胞；和上皮細胞。22.根據權利要求21的細胞，其中所述血液細胞選自紅細胞、CD4+細胞和CD8+細胞；所述上皮細胞選自肺上皮細胞、胃上皮細胞和腸上皮細胞。23.通過體外調制選自胚胎干細胞，胚胎生殖細胞或畸胎瘤細胞的多能性干細胞的分化狀態的方法獲得的細胞培養物，所述方法包括(i)使所述干細胞與權利要求1-11中任一項的至少一種RNAi分子接觸；(ii)提供有助于上述(i)中處理的細胞生長和分化的條件；和任選地(iii)維持和/或儲存分化狀態的細胞。全文摘要本發明涉及調制干細胞分化的方法及其中所用的抑制性RNA(RNAi)，所述方法包括將RNAi導入干細胞以消除編碼與干細胞分化有關的多肽的mRNA；本發明還涉及編碼所述RNAi分子的DNA分子；和通過所述方法獲得的細胞。文檔編號A61P1/16GK101078012SQ200710079528公開日2007年11月28日申請日期2001年8月17日優先權日2000年8月19日發明者彼得·安德魯斯,詹姆斯·沃爾什,保羅·戈卡萊申請人:愛克斯澳迪亞有限公司