專利名稱：用二次諧波和雙光子激發(fā)熒光實(shí)現(xiàn)高空間分辨視網(wǎng)膜成像的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明將二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像以及雙光子激發(fā)熒光成像相結(jié)合，對視 網(wǎng)膜進(jìn)行高空間分辨成像，以實(shí)現(xiàn)眼底疾病的早期診斷。由于視網(wǎng)膜各細(xì)胞層在結(jié)構(gòu)及光學(xué) 性質(zhì)上各異，利用這種成像方法不僅能夠根據(jù)視網(wǎng)膜細(xì)胞層各自的特點(diǎn)采用相應(yīng)的成像手段， 而且能夠?qū)ν患?xì)胞層進(jìn)行多種成像方法的復(fù)合測量，從而獲得互補(bǔ)的功能信息。因此，本 發(fā)明將為各類視網(wǎng)膜疾病的早期診斷以及視覺科學(xué)的研究提供一種新型的具有三維高空間分 辨率的視網(wǎng)膜單細(xì)胞成像手段，對降低視網(wǎng)膜患者的失明風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。
背景技術(shù)：
視覺科學(xué)的研究以及眼科臨床上對各類視網(wǎng)膜疾病的早期診斷，要求發(fā)展新型的具有更 高空間分辨率、可三維成像、靈敏度高、能夠獲取視網(wǎng)膜組織功能信息的成像手段。將自適 應(yīng)光學(xué)技術(shù)與具有高空間分辨率并能夠提供更多新型功能對比信息的成像方法相結(jié)合是新一 代視網(wǎng)膜成像技術(shù)的發(fā)展方向，而發(fā)展一種能滿足視網(wǎng)膜成像特殊要求的具有高空間分辨率 的光學(xué)成像技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵。目前已在臨床獲得應(yīng)用或正在發(fā)展的視網(wǎng)膜成像手段包括激光掃描共焦成像、光學(xué)相干 層析成像以及眼底自體熒光成像等。雙光子激發(fā)熒光和二次諧波是近幾年來發(fā)展起來的并在 生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用的新型成像技術(shù)，具有高空間分辨率、靈敏度高、特異性好以及 對樣品損傷小等優(yōu)點(diǎn)，有望在新一代視網(wǎng)膜成像設(shè)備中獲得應(yīng)用。雙光子激發(fā)熒光可以顯著提高熒光成像的穿透深度，避免紫外光對視網(wǎng)膜的損傷。由于 雙光子激發(fā)的吸收譜很寬，利用單一光源可以激發(fā)視網(wǎng)膜內(nèi)不同的熒光團(tuán)，而且可以很好地 解決熒光探測中的光譜交疊問題。在色素上皮細(xì)胞層主要有兩種自體熒光團(tuán)，即脂褐素和黑 色脂褐素。研究表明，這些熒光團(tuán)在色素上皮細(xì)胞層的集聚和分布與年齡以及視網(wǎng)膜疾病有 關(guān)。因此采用雙光子激發(fā)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層的自體熒光成像可以為眼疾病的病理研究和 早期診斷提供方法和依據(jù)。二次諧波成像是近年迅速發(fā)展并引起生物醫(yī)學(xué)界關(guān)注的一種新型高分辨光學(xué)成像方法。 與雙光子激發(fā)熒光相同，二次諧波也是二階非線性過程，因此具有雙光子熒光成像的優(yōu)點(diǎn)。 但與雙光子熒光相比，二次諧波成像的獨(dú)特之處在于信號光的空間分布與微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)，并 且對分子排列敏感，具有很高的三維空間分辨能力。因此，二次諧波成像已經(jīng)被用于細(xì)胞膜、 細(xì)胞和組織等各類生物體系的活體觀察，如有絲分裂細(xì)胞中的紡錘體和微絲微管。對于成層 狀分布的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞陣列，二次諧波是一種很好的觀測手段，可以對感光細(xì)胞的細(xì)胞膜 成像，研究細(xì)胞的分布密度；借助于染料還可測量細(xì)胞膜的膜電位，進(jìn)行細(xì)胞的功能成像。 另外，二次諧波具有偏振敏感特性，對于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的成像具有重要的意義。當(dāng)偏振激發(fā) 光通過微絲狀的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突傳輸并反射回探測器時(shí)，其偏振態(tài)發(fā)生變化，改變的大小 取決于光所通過的微絲的數(shù)量，因此通過測量反射光的偏振態(tài)改變，就可以得到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 層的厚度，判定視神經(jīng)細(xì)胞的丟失多少。本發(fā)明是一種用二次諧波和雙光子激發(fā)熒光實(shí)現(xiàn)高空間分辨視網(wǎng)膜成像的新方法，有望 在視網(wǎng)膜疾病的早期診斷以及視覺科學(xué)研究中發(fā)揮巨大作用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過光路系統(tǒng)、機(jī)械系統(tǒng)以及電子學(xué)系統(tǒng)的特殊設(shè)計(jì)，將超短脈沖激光器和激光 掃描共焦檢眼鏡相耦合，利用檢眼鏡對人眼視網(wǎng)膜檢査的同時(shí)，獲取二次諧波信號、偏振敏 感二次諧波信號以及雙光子激發(fā)熒光信號。采用計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng)得到視網(wǎng)膜各細(xì)胞層圖像，并與激光掃描共焦檢眼鏡產(chǎn)生的視網(wǎng)膜反射圖像形成對比信息。本發(fā)明主要針對視網(wǎng)膜三個(gè)重要功能的細(xì)胞層色素上皮細(xì)胞層、感光細(xì)胞層以及神經(jīng) 節(jié)細(xì)胞層，分別進(jìn)行雙光子激發(fā)熒光成像、二次諧波成像以及偏振敏感二次諧波成像，通過 計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng)得到視網(wǎng)膜三個(gè)重要功能細(xì)胞層的圖像。本發(fā)明可對視網(wǎng)膜三個(gè)重要功能細(xì)胞層的各細(xì)胞層，進(jìn)行二次諧波成像、偏振敏感二次 諧波成像、雙光子激發(fā)熒光成像的復(fù)合測量。通過計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng)得到視網(wǎng)膜三個(gè)重 要功能細(xì)胞層的各細(xì)胞層的二次諧波與雙光子激發(fā)熒光的合成圖像或偏振敏感二次諧波與雙 光子激發(fā)熒光的合成圖像或二次諧波與偏振敏感二次諧該的合成圖像或二次諧波、偏振敏感 二次諧波與雙光子激發(fā)熒光的合成圖像，從而獲得同一細(xì)胞層的互補(bǔ)功能信息。本發(fā)明將超短脈沖光源與激光掃描共焦檢眼鏡相耦合，利用單通道法實(shí)現(xiàn)二次諧波和雙 光子激發(fā)熒光視網(wǎng)膜高空間分辨成像原理及系統(tǒng)的舉例說明如圖1所示。系統(tǒng)主要由高重復(fù)頻 率超短脈沖激光器101、半波片102、功率衰減器103、激光掃描共焦檢眼鏡105、雙色鏡107、 窄帶濾光片112、帶通或高通濾光片IIO、檢偏器U3、光電倍增管114以及計(jì)算機(jī)處理與控制 系統(tǒng)117等組成。本發(fā)明將超短脈沖光源與激光掃描共焦檢眼鏡相耦合，利用雙通道法實(shí)現(xiàn)二次諧波和雙 光子激發(fā)熒光視網(wǎng)膜高空間分辨成像原理及系統(tǒng)的舉例說明如圖2所示。系統(tǒng)主要由高重復(fù)頻 率超短脈沖激光器201、半波片202、功率衰減器203、激光掃描共焦檢眼鏡205、雙色鏡207、 窄帶濾光片212、帶通或高通濾光片210、偏振分光棱鏡213、光電倍增管214以及計(jì)算機(jī)處理 與控制系統(tǒng)216等組成。本發(fā)明采用高重復(fù)頻率超短脈激光器，如鈦寶石鎖模飛秒激光器或其它高重復(fù)頻率飛秒 或皮秒激光器或超快鎖模激光器作為雙光子激發(fā)測量系統(tǒng)的激發(fā)光源。其波長可調(diào)且允許變 化范圍700-1000nm。根據(jù)視網(wǎng)膜不同細(xì)胞層特點(diǎn)選擇合適波長進(jìn)行檢測。本發(fā)明在高重復(fù)頻率超短脈沖激光器如飛秒激光器光路中采用了功率衰減器，衰減從高 重復(fù)頻率超短脈沖激光器如鈦寶石激光器輸出的功率，使輸入到眼睛的光功率滿足關(guān)于激光 安全應(yīng)用的美國國家標(biāo)準(zhǔn)ANSI 。本發(fā)明利用半波片改變激光的偏振方向，使之能夠在相互垂直的兩個(gè)方向進(jìn)行切換。本發(fā)明利用雙色鏡使視網(wǎng)膜二次諧波信號和雙光子激發(fā)熒光信號從視網(wǎng)膜反射光信號中 分離，實(shí)現(xiàn)二次諧波和雙光子激發(fā)熒光與視網(wǎng)膜反射光的對比成像。本發(fā)明利用帶通或高通濾光片，有效避開二次諧波的峰值波長，挑選出雙光子激發(fā)熒光，號B本發(fā)明利用窄帶濾光片，挑選出二次諧波信號，過濾熒光信號和一次諧波信號。 本發(fā)明利用檢偏器，透過平行與垂直于激發(fā)光偏振方向的二次諧波信號。 本發(fā)明利用偏振分光棱鏡，將二次諧波信號分成平行與垂直于激發(fā)光偏振方向的兩個(gè)偏 振正交信號。本發(fā)明采用高靈敏度的光電倍增管作為二次諧波、偏振敏感二次諧波、雙光子激發(fā)熒光 以及視網(wǎng)膜反射光的探測裝置，將探測結(jié)果輸入到計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)成像。本發(fā)明采用一個(gè)通道依次記錄平行與垂直于激發(fā)光偏振方向的兩種偏振態(tài)信號，不必對 系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，提高精度。本發(fā)明利用二次諧波、偏振敏感二次諧波、雙光子激發(fā)熒光與反射光同時(shí)成像的方法， 將反射圖像中視網(wǎng)膜血管網(wǎng)狀分布與二次諧波、偏振敏感二次諧波、雙光子激發(fā)熒光所成圖 像對應(yīng)，用以校正眼底檢査過程中由于眼球微動(dòng)而造成的誤差。


圖1超短脈沖光源耦合激光掃描共焦檢眼鏡單通道測量方法及其裝置示意圖。 圖2超短脈沖光源耦合激光掃描共焦檢眼鏡雙通道測量方法及其裝置示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對技術(shù)方案的實(shí)施作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
如圖1所示，由高重復(fù)頻率超短脈沖激光器如鈦寶石鎖模飛秒激光器101，輸出的近紅 外超短脈沖經(jīng)半波片102、功率衰減器103后，以光纖104輸入激光掃描共焦檢眼鏡105的 掃描頭，逐點(diǎn)掃描人眼106的視網(wǎng)膜三個(gè)重要功能細(xì)胞層，并將計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng)117 和激光掃描共焦檢眼鏡105的掃描控制單元120相連，實(shí)現(xiàn)同步掃描。此時(shí)，光脈沖到達(dá)角 膜的最大輻射能量小于允許的最大曝光量。從激光掃描共焦檢眼鏡105輸出的光信號，通過 雙色鏡107分光后，將二次諧波信號和熒光信號與反射光信號分離。反射光信號被光電倍增 管108收集并用于隨后的反射光成像119; 二次諧波信號和熒光信號經(jīng)分束鏡109，分成兩束 光。 一束光經(jīng)帶通或高通濾光片110，挑選出雙光子激發(fā)熒光信號，通過高靈敏度的光電倍 增管lll探測，實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光成像118;另一束光經(jīng)窄帶濾光片112，挑選出二次諧波 信號，通過高靈敏度的光電倍增管114探測，實(shí)現(xiàn)二次諧波成像115。根據(jù)視網(wǎng)膜各細(xì)胞層 的特點(diǎn)，在窄帶濾光片112和光電倍增管114之間插入檢偏器113，將檢偏器113的透光軸依 次旋轉(zhuǎn)到平行、垂直于激發(fā)光的偏振方向，通過同一光電倍增管114接收探測，得到兩個(gè)相 互垂直的偏振光分量的二次諧波圖像；切換半波片102，使激發(fā)光的偏振方向與原激發(fā)光的 偏振方向垂直，再次得到兩個(gè)相互垂直的偏振光分量的二次諧波圖像，通過計(jì)算機(jī)處理與控 制系統(tǒng)對這四幅二次諧波圖像進(jìn)行處理，提取出二次諧波的各向異性度信息，實(shí)現(xiàn)偏振敏感 二次諧波成像116。
為補(bǔ)償眼球在光照時(shí)微動(dòng)造成的成像偏差，采用二次諧波、偏振敏感二次諧波、雙光子 激發(fā)熒光與視網(wǎng)膜反射光同時(shí)成像，并以反射圖像中視網(wǎng)膜血管網(wǎng)狀分布為標(biāo)準(zhǔn)與二次諧波、 偏振敏感二次諧波、雙光子激發(fā)熒光所成圖像結(jié)果對應(yīng)，即在記錄反射光成像時(shí)，眼球移動(dòng) 的位移矢量被計(jì)算機(jī)117計(jì)算并用于成像過程的校準(zhǔn)。用這種方法，計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng) 117每次記錄將校正為眼球發(fā)生移動(dòng)前的原始狀態(tài)。
如圖2所示，由高重復(fù)頻率超短脈沖激光器如鈦寶石鎖模飛秒激光器201，輸出的近紅 外超短脈沖經(jīng)半波片202、功率衰減器203后，以光纖204輸入激光掃描共焦檢眼鏡205的 掃描頭，逐點(diǎn)掃描人眼206的視網(wǎng)膜三個(gè)重要功能細(xì)胞層，并將計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng)216 和激光掃描共焦檢眼鏡205的掃描控制單元223相連，實(shí)現(xiàn)同步掃描。從激光掃描共焦檢眼 鏡205輸出的光信號，通過雙色鏡207分光后，將二次諧波信號和熒光信號與反射光信號分 離，反射光信號被光電倍增管208收集并用于隨后的反射光成像222; 二次諧波信號和熒光 信號經(jīng)分束鏡209，分成兩束光。 一束光經(jīng)帶通或高通濾光片210，挑選出雙光子激發(fā)熒光信 號，通過高靈敏度的光電倍增管211探測，實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光成像221;另一束光經(jīng)窄帶 濾光片212，挑選出二次諧波信號，經(jīng)偏振分光棱鏡213后，偏振方向與213的光軸平行的 二次諧波分量透射，與之垂直的二次諧波分量反射。這兩個(gè)分量分別由對應(yīng)的光電倍增管214、 215探測，得到兩個(gè)相互垂直的偏振光分量的二次諧波圖像219、 220。此時(shí)，偏振分光棱鏡 213光軸與激發(fā)光偏振方向平行；切換半波片，使激發(fā)光的偏振方向與原激發(fā)光的偏振方向垂直，再次得到兩個(gè)相互垂直的偏振光分量的二次諧波圖像，通過計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng)216
對這四幅二次諧波圖像進(jìn)行處理，實(shí)現(xiàn)偏振敏感二次諧波成像218和二次諧波成像217。
綜上所述，本發(fā)明將二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像以及雙光子激發(fā)熒光成像相 結(jié)合，對視網(wǎng)膜進(jìn)行高空間分辨成像。為目前多種視網(wǎng)膜疾病，如糖尿病視網(wǎng)膜病、青光眼 和老年黃斑變性等疾病的病理研究和早期診斷提供了新方法和依據(jù)。因此，本發(fā)明對各類視 網(wǎng)膜疾病的早期診斷，降低視網(wǎng)膜患者的失明風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義，可廣泛用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域 及臨床醫(yī)學(xué)診斷方面。
權(quán)利要求
1. 一種利用超短脈沖激光器，實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜成像的方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，超短脈沖激光器既可以是鈦寶石鎖模飛秒激光器，也可以是 各類光纖激光器。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，飛秒激光器用于激發(fā)視網(wǎng)膜的不同層的細(xì)胞和組織，通 過非線性的效應(yīng)，產(chǎn)生二次諧波信號或雙光子激發(fā)熒光信號，作為對比度，對視網(wǎng)膜進(jìn) 行高空間分辨的成像方法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是將二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像以及雙光 子激發(fā)熒光成像相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜的復(fù)合測量的方法。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，視網(wǎng)膜的成像系統(tǒng)是將高重復(fù)頻率超短脈沖激光器、功率衰 減器、激光掃描共焦檢眼鏡以及計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng)等組成的成像系統(tǒng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，該成像對視網(wǎng)膜三個(gè)重要的功能細(xì)胞層色素上皮細(xì)胞層、 感光細(xì)胞層以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，分別進(jìn)行雙光子激發(fā)熒光成像、二次諧波成像以及偏振 敏感二次諧波成像，獲得視網(wǎng)膜三個(gè)重要功能細(xì)胞層的圖像。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，對測量結(jié)果，通過計(jì)算機(jī)處理與控制系統(tǒng)得到視網(wǎng)膜三個(gè)重 要功能細(xì)胞層的各細(xì)胞層的二次諧波與雙光子激發(fā)熒光的合成圖像或偏振敏感二次諧波 與雙光子激發(fā)熒光的合成圖像或二次諧波與偏振敏感二次諧波的合成圖像或二次諧波、 偏振敏感二次諧波與雙光子激發(fā)熒光的合成圖像，從而獲得同一細(xì)胞層的互補(bǔ)功能信息。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是用高重復(fù)頻率超短脈沖激光器，如鈦寶石鎖模飛秒 激光器或其它高重復(fù)頻率飛秒或皮秒激光器或超快鎖模激光器作為視網(wǎng)膜雙光子激發(fā)光 源。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是激光器的光譜范圍既可是固定波長也可是可調(diào)波 長，波長允許變化范圍700-1000nm，其脈沖重復(fù)頻率既可是固定，也可在一定的范圍內(nèi) 改變，但每一次工作頻率穩(wěn)定，重復(fù)頻率變化范圍50MHz-500MHz。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在高重復(fù)頻率激光器光路中采用功率衰減器，將 高重復(fù)頻率激光器輸出的超短脈沖的功率衰減到ANSI安全標(biāo)準(zhǔn)以下。
11. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是利用半波片改變激光的偏振方向，使之能夠在相 互垂直的兩個(gè)方向進(jìn)行切換。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是進(jìn)入激光掃描共焦檢眼鏡掃描頭的光脈沖經(jīng)過瞄 準(zhǔn)儀聚焦后由光纖輸入。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l， 2和3所述的方法，其特征是利用雙色鏡將二次諧波信號和雙光子激發(fā) 熒光信號從視網(wǎng)膜反射光信號中分離出來。
14. 根據(jù)權(quán)利要求3和6所述的方法，其特征是利用窄帶濾光片和帶通或高通濾光片，分別 挑選出二次諧波信號和雙光子激發(fā)熒光信號。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l， 3，和7所述的方法，其特征是根據(jù)視網(wǎng)膜各細(xì)胞層的特點(diǎn)插入檢偏器， 透過二次諧波信號平行與垂直于激發(fā)光偏振方向的信號；或利用偏振分光棱鏡，將二次 諧波信號分成平行與垂直于激發(fā)光偏振方向的信號。
16. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是視網(wǎng)膜同一位置的反射光與二次諧波和雙光子激發(fā) 熒光分別成像，在記錄反射光成像時(shí)，眼球移動(dòng)的位移矢量被計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄 并用于成像過程的校準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明將二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像以及雙光子激發(fā)熒光成像相結(jié)合，對視網(wǎng)膜進(jìn)行高空間分辨成像，以實(shí)現(xiàn)眼底疾病的早期診斷。通過激光掃描共焦檢眼鏡與超短脈沖激光器相耦合，主要對視網(wǎng)膜三個(gè)重要功能的細(xì)胞層色素上皮細(xì)胞層、感光細(xì)胞層以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，分別進(jìn)行雙光子激發(fā)熒光成像、二次諧波成像以及偏振敏感二次諧波成像，并對同一細(xì)胞層進(jìn)行二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像、雙光子激發(fā)熒光成像的復(fù)合成像，通過計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)得到各細(xì)胞層圖像和同一細(xì)胞層的合成圖像，從而獲得各細(xì)胞層的功能信息。本發(fā)明將為各類視網(wǎng)膜疾病，如糖尿病視網(wǎng)膜病、青光眼和老年黃斑變性等疾病的病理研究和早期診斷以及視覺科學(xué)的研究提供一種新型的具有三維高空間分辨率的視網(wǎng)膜單細(xì)胞成像手段，對降低視網(wǎng)膜患者的失明風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。
文檔編號A61B3/14GK101254091SQ200710085330
公開日2008年9月3日 申請日期2007年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月28日
發(fā)明者孫怡雯, 屈軍樂, 牛憨笨, 許改霞, 趙羚伶 申請人:深圳大學(xué)