專利名稱：：神經調節蛋白的新用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物化學、分子生物學和醫學領域。具體而言，本發明涉及神經調節蛋白在心血管疾病治療中的適應癥，包括抗心率失常、竇性心動過速和慢性心房纖顫。
背景技術：
：神經調節蛋白(neuregulin，NRG;heregulin，HRG)，又叫神經膠質生長因子(glialgrowthfactor,GGF)，neu分《七因子(newdifferentiationfactor,NDF)，為分子量在44KD左右的糖蛋白，它們在細胞間傳遞信號，是酪氨酸激酶受體ErbB家族的配體。神經調節蛋白家族含4個成員NRG1，NRG2，NRG3，NRG4。(Fallsetal"ExpCellRes.284:14-30，2003)對后三者的生物學功能相對來講知之甚少。NRG1在神經系統、心臟和乳腺中起著重要作用，還有證據顯示NRG1信號傳遞在其他一些器官系統的發育、功能以及人類疾病(包括精神分裂癥和乳腺癌)的發病機理中起作用。NRG1有很多異構體。對基因突變小鼠(基因敲除小鼠)的研究說明在N末端區或表皮生長因子(EGF)類似區不同的異構體，其在體功能也不一樣。本發明是以神經調節蛋白1(3(NRG1(3)為基礎的。神經調節蛋白l卩為一跨膜蛋白(Holmesetal.,Science256，1205-1210，1992)。膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白類似區(Ig-likedomain)和EGF類似區(EGF-likedomain),膜內部分是C末端。在細胞外基質的金屬蛋白酶作用下，神經調節蛋白的膜外部分可被酶切下來而呈游離狀態，從而有利于和周圍細胞表面的ErbB受體結合，激活相應的細胞信號傳遞。ErbB受體家族也分為四類，ErbBl、ErbB2、ErbB3和ErbB4，它們都是跨膜蛋白，分子量在180-185KD附近。除ErbB2外，它們在膜外的N末端都含配體結合區；除ErbB3外，它們在膜內的C末端都含蛋白酪氨酸激酶活性。其中ErbBl是表皮生長因子的受體，ErbB3和ErbB4都是神經調節蛋白的受體。在神經調節蛋白的受體中，只有ErbB2和ErbB4在心臟表達量較高。(Yardenetal.,NatRevMolCellBiol，2:127-137，2001)當神經調節蛋白與ErbB3或ErbB4的膜外部分結合時，將引起ErbB3、ErbB4與其他ErbB受體(常常包括ErbB2)形成異源二聚體，或ErbB4自身形成同源二聚體，然后導致受體的膜內部分被磷酸化(Yardenetal.,NatRevMolCellBiol,2:127-137,2001)。磷酸化的膜內部分可進一步與細胞內的多種信號傳遞蛋白結合，從而激活下游ERK或AKT信號通路，引起一系列細胞反應包括刺激或抑制細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移、細胞分化或細胞粘連。神經調節蛋白對心臟的發育尤其重要(WO0037095,CN1276381,WO03099300,W09426298,US6444642，WO9918976，WO0064400，Zhaoetal.，《/CTzew.273，10261—10269，1998)。在胚胎發育早期，神經調節蛋白的表達主要局限于心內膜，隨后通過旁分泌途徑釋放到周圍心肌細胞并與細胞膜上的蛋白酪氨酸激酶受體ErbB4膜外部分結合，ErbB4進而與ErbB2形成異源二聚體。ErbB4/ErbB2復合物的形成及激活對早期海綿樣心臟形成小梁是必須的。神經調節蛋白、ErbB4和ErbB2三個蛋白基因中的任何一個缺失都會使胚胎沒有小梁并在發育早期死于子宮。WO0037095顯示一定濃度的神經調節蛋白可持續激活ERK信號通路，促進心肌細胞在的生長及分化，引導心肌細胞和細胞粘連處肌節和細胞骨架的重建，改善心肌細胞的結構，增強心肌細胞的收縮。WO0037095及WO03099300還指出神經調節蛋白可用于檢測、診斷和治療各種心血管疾病。下面列舉了與本發明有關的一些現有技術文獻1、cardiacmusclefunctionandmanipulation;WO00370952、生長因子神經調節蛋白及其類似物的新應用；CN12763813、neuregulinbasedmethodsandcompositionsfortreatingcardiovasculardiseases;WO030993004、You-yangZhao,DouglasR.Sawyer,RagavendraR.Baliga,DouglasJ.Opel,XinqiangHan,MarkA.Marchionni,andRalphA.NeuregulinsPromoteSurvivalandGrowthofCardiacMyocytes.KellyJ.Biol.Chem.273,10261—10269(1998)5、Methodsfortreatingmusclediseasesanddisorders;W094262986、Methodsofincreasingmyotubeformationorsurvivalormusclecellmitogenesis,differentiationorsurvivalusinganeuregulin;US64446427、Therapeuticmethodscomprisinguseofaneuregulin;WO99189768、Methodsfortreatingcongestiveheartfailure;WO00644009、WilliamE.Holmes,MarkX.Sliwkowski，RobertW.Akita,WilliamJ.Henzel，JamesLee，JohnW.Park,DanielYansura,NasrinAbadi,HelgaRaab,GailD.Lewis,H.MichaelShepard，Wun-JingKuang，WilliamI.Wood,DavidV.Goeddel,RichardL.Wandlen.Identificationofheregulin,aspecificactivatorofp185(erbB2).Science256,1205-1210(1992)10、DouglasLFalls.Neuregulins:functions,forms,andsignalingstrategies.ExperimentalCellResearch284,14-30(2003)11、YosefYarden,MarkX.Sliwkowski.UntanglingtheErbBsignallingNetwork.NatureReviews:MolecularCellBiology2127-137(2001)。現有技術沒有關于神經調節蛋白對于心率調節的作用，也沒有關于神經調節蛋白對于迷走神經活性的影響。本發明發現給予哺乳動物神經調節蛋白，其心電圖PR間期延長，心率減慢。神經調節蛋白減慢心率的效應可用于抗心率失常，它對迷走神經活性的慢性效應可治療竇性心動過速和慢性心房纖顫。發明概述神經調節蛋白可與心肌細胞表面的ErbB受體結合，持續激活細胞內的ERK信號通路，改變心肌細胞的結構，從而提高心肌的收縮力，因此被用于治療心力衰竭。而在給成年雜種犬靜脈注射神經調節蛋白后，對其心電圖研究表明神經調節蛋白能延長心電圖的PR間期并降低心率，該效應具有劑量依賴性。這可能與迷走神經調節的張力增加有關。神經調節蛋白減慢心率的效應可用于抗心率失常。在傳導性疾病，包括1度或2度房室傳導阻滯或病態竇房節綜合癥中，利用該蛋白增強迷走活性的慢效應時可能導致心動過緩或長時間停搏，這時需要采取適當的干預措施。神經調節蛋白增強迷走活性的慢效應提示它還可用于其他適應癥竇性心動過速和慢性心房纖顫。具體而言，本發明包括如下方面在第一個實施方案中，應用神經調節蛋白來延長心電圖的PR間期并降低心率。作為選擇，可以將一定量的神經調節蛋白多次給予哺乳動物。在第二個實施方案中，將第一個實施方案中的神經調節蛋白降低心率的效應用于治療心率失常。在第三個實施方案中，應用神經調節蛋白來增強迷走活性。作為選擇，可以將一定量的神經調節蛋白多次給予哺乳動物。在第四個實施方案中，將第三個實施方案中的神經調節蛋白增強迷走活性的慢效應用于治療竇性心動過速和慢性心房纖顫。在第五個實施方案中，多次給予哺乳動物一定量的神經調節蛋白能延長其心電圖的PR間期并降低心率，也能增強迷走活性的慢效應用于治療竇性心動過速和慢性心房纖顫。附圖簡述圖l、圖2、圖3分別顯示了用89.58U/kg(蛋白/體重)高劑量神經調節蛋白給藥5天時，在3只犬中獲得的心電圖數據，包括第6天再次給藥10分鐘后記錄的心電圖數據，記錄了反映對照、急性和慢性效應的心電圖。發明詳述本發明擴展了神經調節蛋白在心血管疾病中可能的適應癥，包括竇性心動過速和慢性心房纖顫。當把神經調節蛋白通過靜脈注射給成年雜種犬時，發現其心電圖PR間期延長，心率減慢。神經調節蛋白減慢心率的效應可用于抗心率失常，它對迷走神經活性的慢性效應可治療竇性心動過速和慢性心房纖顫。神經調節蛋白是具有重要生物學功能的糖蛋白。本發明提供了神經調節蛋白在治療和預防心血管疾病中的新用途，本發明也描述了神經調節蛋白在實現所述新用途中的作用原理。但是，本發明并不受限于所述原理闡述。在本發明中，所有術語均具有本領域的技術人員普遍已知的含義。術語"神經調節蛋白"是指能夠激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異二聯蛋白酪氨酸激酶的分子，包括神經調節蛋白異構體、神經調節蛋白中的EGF區域、神經調節蛋白突變體，和任何能激活上述受體的神經調節蛋白類的基因產物。作為例子，但非限制性地，本發明的神經調節蛋白是神經調節蛋白P2異構體的一個片段，即177-237位氨基酸片段，其中包含了受體結合區EGF類似區。該片段的氨基酸序列為SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ。應該理解的是，本發明的神經蛋白包括完整蛋白、其片段和各種突變體、等價物、模擬體等等，也包括上述物質與它種物質的融合體、偶聯體或者結合物，包括上述物質的變性或者未變性形式，包括上述物質的各種各樣修飾物。在不背離本發明的基礎上，對神經調節蛋白進行截短、氨基酸替換或添加等等變化都是在本發明的范圍之內。術語"活力單位"或"1U"是指能誘導最大激活的一半時的神經調節蛋白劑量。具體說來，我們定義與神經調節蛋白EC50(pg/ml)等量的樣品為一個活力單位。本發明所用神經調節蛋白的一個活力單位為0.067嗎，即l昭為14.93U。蛋白樣品EC50的測定是一種基本技術，已為該領域的人熟知。術語"心電圖"是指，利用心電圖機從體表記錄心臟每一心動周期所產生電活動變化的曲線圖形。術語"PR間期"是指，從P波起點至QRS波群起點，代表心房開始除極至心室開始除極的時間。術語"心率"是指每分鐘的心搏次數。術語"竇性心動過速"的定義是，心電圖符合竇性心律的特征，成人竇性心律的頻率超過100次/分，為竇性心動過速。術語"心房纖顫"是指由心房主導折返環引起許多小折返環導致的房律紊亂。可分為急性心房纖顫和慢性心房纖顫。其中，導致"心率失常"、"竇性心動過速"和"心房纖顫"的疾病、臨床表現及包括心電圖特征的臨床檢查特征，包含在本領域技術人員的已知范圍內。在第一個實施方案中，多次給予哺乳動物一定量的神經調節蛋白能延長其心電圖的PR間期并降低心率。在第二個實施方案中，將第一個實施方案中的神經調節蛋白降低心率的效應用于治療心率失常。在第三個實施方案中，多次給予哺乳動物一定量的神經調節蛋白可增強迷走活性的慢效應。在第四個實施方案中，將第三個實施方案中的神經調節蛋白增強迷走活性的慢效應用于治療竇性心動過速和慢性心房纖顫。在第五個實施方案中，多次給予哺乳動物一定量的神經調節蛋白能延長其心電圖的PR間期并降低心率，也能增強迷走活性的慢效應用于治療竇性心動過速和慢性心房纖顫。在本發明的第一個實施方案和第三個實施方案中，所述哺乳動物包括但不限于人類及犬。在本發明的第一個實施方案和第三個實施方案中，所述給予方法包括本領域中已知的任何方法，包括但不限于靜脈注射方法。在本發明的第一個實施方案和第三個實施方案中，所述一定量是44.79U/kg至89.58U/kg蛋白/體重，優選44.79U/kg蛋白/體重、89.58U/kg蛋白/體重。本發明是基于發現了神經調節蛋白具有干預心臟活動的新活性，從而將神經調節蛋白用于治療心率失常，竇性心動過速和慢性心房纖顫。實施例實驗方法1.動物實驗方法將重組人神經調節蛋白(NRG1P2之177-237氨基酸片段，澤生科技開發有限公司，批號200503002)慢性靜脈給藥至成年雜種犬，共3只，即11=3，每日劑量44.79U/kg(蛋白/體重)，給藥6天。應用動物心電圖儀在O，1，2，4，5，6天記錄12導聯心電圖(ECG)。用89.58U/kg的劑量重復以上操作。以賦形劑(10mMNa2HPO4-NaH2PO4，150mMNaCl，0.2。/。HSA(人血清白蛋白)，5%甘露醇，pH6.0，劑量為4ml/kg鼠體重)(對應于89.58U/kg神經調節蛋白)處理的兩只犬作對照。每次給藥24小時后檢測神經調節蛋白的慢性效應。末次給藥10分鐘后監測急性效應。2.實驗結果1)44.79U/kg神經調節蛋白的作用表1-4列出了用44.79U/kg神經調節蛋白給藥5天時，在3只犬中獲得的心電圖參數(慢性效應)和第6天再次給藥10分鐘后記錄的心電圖數據(急性效應)。表1展示了三只犬ECG的統計數據，表2-4分別列出了每只犬心電圖的數據。44.79U/kg神經調節蛋白慢性給藥導致RR間期非顯著增加(約100mSec)及PR間期顯著增加(13.3mSec)。而QT、QTc間期或T波幅度則無顯著變化，T波極性也未改變。第6天末次44.79U/kg神經調節蛋白靜脈注射10分鐘后3只犬的心電圖也沒有進一步變化。表1、低劑量(44.79U/kg)神經調節蛋白對ECG(n-3)的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2、低劑量(44.79U/kg)神經調節蛋白對第一只犬ECG的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3、低劑量(44，79U/kg)神經調節蛋白對第二只犬ECG的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4、低劑量(44.79U/kg)神經調節蛋白對第三只犬ECG的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2)89.58U/kg神經調節蛋白的作用圖1-3和表5-9顯示用、9.58U/kg高劑量神經調節蛋白給藥5天時，在3只犬中獲得的心電圖及相應數據，包括第6天再次給藥10分鐘后記錄的心電圖數據。表6的統計數據顯示高劑量慢性給藥后RR和PR間期均顯著增加(RR從491士143mSec到706士143mSec，PR從106士4mSec到130士14mSec)，QT間期也顯著增加(大約25mSec)，而QTc小幅減小。慢性給藥后仍未觀察到T波幅度或極性的改變。第6天末次給藥10分鐘后發現心電圖進一步變化RR間期進一步小幅、非顯著增加，QT間期進一步延長，主要是T波的明顯變化在所有3只犬的II、ni和aVF導聯都出現負性T波，在其中2只犬的心前導聯出現負性T波；在所有導聯都出現T波幅度的顯著下降并伴有或不伴有T波倒置(圖1-3)。在慢性研究的第1天，1只犬的T波首次在急性階段發生改變，第2天則2只犬的T波發生改變。值得注意的是T波改變在注射神經調節蛋白后幾乎立刻開始，大約IO分鐘后達到峰值并在2小時內完全消退。慢性給藥后QT間期增加，而QTc則不變。2號犬顯示了便于Tpeak-Tend(復極化的跨壁離差指數)分析的突出T波。在心前導聯中Tpeak-Tend減少了15mSec。89.58U/kg神經調節蛋白慢性給藥引起明顯心動過緩以及PR間隔延長；第6天末次給藥后15分鐘內出現了藥物的急性效應，包括下壁導聯的T波倒置和心前導聯的T波倒置或T波幅度的顯著減小。QTc只在右心前導聯(V1—V3)顯著延長(17mSec)。末次給藥2小時后的再次記錄沒有觀察到神經調節蛋白的這些急性效應。表5、神經調節蛋白(89.58U/kg)對Tpeak-Tend(復極化的跨壁離差)的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表6、高劑量(89.58U/kg)神經調節蛋白對ECG(n=3)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表7、髙劑量(89.58U/kg)神經調節蛋白對第一只犬ECG的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表8、高劑量(89.58U/kg)神經調節蛋白對第二只犬ECG的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表9、高劑量(89.58U/kg)神經調節蛋白對第三只犬ECG的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3)賦形劑(對應于89.58U/kg神經調節蛋白)的作用表10-12(來自2只犬的統計數據和每只犬的數據)顯示了用賦形劑處理6天的2個動物的心電圖測量。與神經調節蛋白一樣，在第5次給藥24小時后記錄賦形劑的慢性效應，于第6天末次給藥10分鐘后記錄急性效應。所有測量的參數都沒有顯著變化。表IO、賦形劑(對應于89.58U/kg神經調節蛋白)對ECG(n=2)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表ll、賦形劑(對應于89.58U/kg神經調節蛋白)對第一只犬ECG的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表12、賦形劑(對應于89.58U/kg神經調節蛋白)對第二只犬ECG的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>對本發明可以進行許多修改和變化，而不背離其精神和范圍，這對本領域的技術人員將是顯而易見的。這里所述的具體實施方案僅通過實施例加以提供，本發明僅由所附權利要求以及與之等效的全部范疇所限定。此處引用的全部出版物和專利文獻在此并入參考文獻，這與指明每一出版物和專利文獻特異的和分別地并入參考文獻相同。權利要求1.神經調節蛋白的制藥用途，所述藥物是被用于延長哺乳動物心電圖的PR間期并降低其心率。2.權利要求1所述的用途，其中所述藥物是被用于治療哺乳動物的心率失常。3.神經調節蛋白的制藥用途，所述藥物是被用于增強迷走活性。4.權利要求3所述的用途，其中所述藥物是被用于治療哺乳動物的竇性心動過速或慢性心房纖顫。5.神經調節蛋白的制藥用途，所述藥物是被用于延長哺乳動物心電圖的PR間期并且降低其心率，同時增強迷走活性。6.權利要求5所述的用途，其中所述藥物是被用于治療哺乳動物的心率失常和竇性心動過速或慢性心房纖顫。7.權利要求1-6中任何一項所述的用途，其中所述神經調節蛋白可為NRG1，NRG2，NRG3，NRG4的功能氨基酸片段，即含EGF類似區的任何氨基酸片段。全文摘要本發明擴展了神經調節蛋白在心血管疾病中的適應癥，包括竇性心動過速和慢性心房纖顫。當把神經調節蛋白給予哺乳動物時，發現其心電圖PR間期延長，心率減慢。神經調節蛋白減慢心率的效應可用于抗心率失常，它對迷走神經活性的慢性效應可治療竇性心動過速和慢性心房纖顫。文檔編號A61P9/06GK101310766SQ20071009383公開日2008年11月26日申請日期2007年5月25日優先權日2007年5月25日發明者周明東申請人:上海澤生科技開發有限公司