專利名稱：：具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白、提取方法及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物領(lǐng)域，涉及來源于高級真菌經(jīng)發(fā)酵后提取的蛋白產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
：真菌作為藥物來源已有多年歷史，以真菌為材料所生產(chǎn)的藥齊U在我國很早就應(yīng)用于臨床。香菇是世界名貴的食用兼藥用真菌之一,具有很高的營養(yǎng)及藥用價(jià)值。香菇化學(xué)成分復(fù)雜、藥理活性強(qiáng)、臨床應(yīng)用范圍廣，其抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等功能引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注(景軍，等.中國食品衛(wèi)生雜志.2001:13(2):46-47;ChiharaG，etal.CancerRes.1970:30:2776)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，多糖類作為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRM)在香燕的抗腫瘤活性中起主要作用，香恭多糖的分離純化,結(jié)構(gòu)及藥理作用都得到了深入的研究，并用于臨床腫瘤的治療，其療效得到廣泛的肯定。香菇多糖是通過刺激免疫細(xì)胞成熟、分化和增殖，改善宿主機(jī)體平衡從而使免疫狀態(tài)由低下恢復(fù)到接近于正常能力，使腫瘤受抑制來實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤的功能，但其無直接的抗腫瘤作用[RuanZheng,etal.InternationalI咖unopharaacology5(2005)811_820]。除多糖外，香菇中含有大量蛋白質(zhì)、氨基酸和多種微量元素。對香菇中其他生物學(xué)活性物質(zhì)的研究水平去發(fā)掘其抗腫瘤活性的本質(zhì)卻鮮有報(bào)道。黃敏等在研究香菇C91一3菌株發(fā)酵液的抗腫瘤活性中，首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了香菇的菌絲體發(fā)酵液具有體內(nèi)抑制腫瘤生長作用，同時(shí)還具有顯著的體外直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，提示除了香菇多糖外還有其他重要的直接抗腫瘤活性物質(zhì)，國內(nèi)外還未見報(bào)道(黃敏，等.中國微生態(tài)學(xué)雜志.1996年8(3):38-40)。香菇菌株發(fā)酵后的抗腫瘤的成分尤其是蛋白亦未見報(bào)道，黃敏等在繼續(xù)研究中又發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了香菇的菌絲體發(fā)酵液提取的蛋白具有體內(nèi)抑制腫瘤生長作用還具有顯著的體外直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用(戴兵，黃敏等.浙江醫(yī)學(xué),2004年26(9):656-658)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白、提取方法及其在抗腫瘤中的應(yīng)用的制劑。本發(fā)明公開的具抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白是以香菇C91-3菌株為發(fā)酵原料，采用深層發(fā)酵的技術(shù)，過濾后再經(jīng)鹽析、透析等一系列技術(shù)加工而成。本發(fā)明的香菇發(fā)酵提取蛋白的制備方法包括以下述步驟l.香菇發(fā)酵液的制備(1)香菇發(fā)酵液培養(yǎng)基的制備由如下重量份原料構(gòu)成的培養(yǎng)基<table><row><column>葡萄糖</column><column>0.515</column><column>新鮮啤酒酵母</column><column>116</column></row><row><column></column><column>蔗糖</column><column>0.515</column><column>全脂奶粉</column><column>0.510</column></row><row><column></column><column>蛋白胨</column><column>0.510</column><column>磷酸二氫鉀</column><column>0.15</column></row><row><column></column><column>維生素B1</column><column>0.001－1</column><column>維生素B2</column><column>0.001－1</column></row><table>將上述物品加到1000重量份蒸餾水中，混合后放入2060°C水浴中，使其完全溶解，調(diào)節(jié)pH5.08.0，分裝至300ml三角燒瓶中，每瓶250ml，用4層紗布外蓋一層牛皮紙封口，消毒滅菌1520分鐘，冷卻后備用。(2)取710天生長良好的香菇C91-3的菌絲體，接種到上述的培養(yǎng)基中，每瓶接種菌絲體0.515g。(3)置室溫?fù)u床上培養(yǎng)，前兩天50100轉(zhuǎn)/分，第三天開始逐漸加轉(zhuǎn)速至100150轉(zhuǎn)/分。每天觀察生長情況，無菌取少量培養(yǎng)物觀察孢子數(shù)，如果孢子數(shù)達(dá)到1051010/ml時(shí)停止培養(yǎng)，即可收集發(fā)酵液備用。(4)將發(fā)酵液在08°C、3，000g/min離心10min，收集上清液，然后以單層濾紙過濾上清液(08°C)除去其中懸浮的雜質(zhì)，并將所得的上清液放入08'C的環(huán)境中保存。該上清液為不透明的淡褐色或土黃色的液體，pH5.08.0，其中主要含有18種氨基酸和人體所必需的8種氨基酸，其中天門冬氨酸ASP>40mg/ml，蘇氨酸THR>20mg/ml，絲氨酸SER>20mg/ml，谷氨酸GLU>100mg/ml，甘氨酸GLY>50mg/ml，丙氨酸ALA>30mg/ml，胱氨酸CYS>lmg/ml，纈氨酸VAL>30mg/ml，蛋氨酸MET>5mg/ml，異亮氨酸ILE>20mg/ml，亮氨酸LEU>40mg/ml，酪氨酸TYR>40mg/ml,苯丙氨酸PHE>20mg/ml，賴氨酸LYS>30mg/ml，氨NH3〉3mg/ml，組氨酸HIS>9mg/ml，精氨酸ARG>20mg/ml，脯氨酸PRO>40mg/mI，色氨酸TRP>lmg/ml;多糖>50mg/ml2.香菇發(fā)酵粗蛋白的制備(1)在08℃緩慢鹽析發(fā)酵液，同時(shí)以磁力攪拌器攪拌，直到過飽和時(shí)停止。靜置20min后，低溫離心機(jī)(2，0006，000g/min，08℃)離心30min。棄去上清液，收集沉淀。(2)將上述所得的沉淀置于透析袋中，以去離子水作為透析緩沖液，08℃下透析。每30min更換一次緩沖液，直至除去全部的鹽。(3)將脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液于-20℃冰箱保存(4)將脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過真空冷凍干燥機(jī)濃縮凍干得香菇C91-3發(fā)酵液的固體凍干原粉，并于一208℃冰箱保存。此凍干原粉為淡褐色或土黃色的粉末，可溶于水，有特定的香味，含有多種蛋白質(zhì)，分子量為1KD90KD。3.香菇發(fā)酵粗蛋白制劑的制備(2)稱取凍干原粉與賦形劑按比例制成各種口服劑型如速溶顆粒劑、片劑、膠囊及口服液等。①香菇發(fā)酵粗蛋白膠囊的制備取香菇粗蛋白凍干原粉100g，低聚糖或乳糖400600g，硬脂酸鈣或硬脂酸鎂1030g，經(jīng)充分混捏、混合均勻后分裝口服用膠囊，每膠囊含香菇粗蛋白凍干原粉0.10.5mg.。②香菇發(fā)酵粗蛋白速溶顆粒的制備取香菇粗蛋白凍干原粉100g，低聚糖或乳糖100300g，糊精3001000g，混合均勻后造粒、裝袋，每袋含香菇粗蛋白凍干原粉0.10.5mg③香菇發(fā)酵粗蛋白片劑的制備取香菇粗蛋白凍干原粉100g，淀粉10000g，硬脂酸鈣或硬脂酸鎂1030g，低聚糖或乳糖400600g,混合均勻后壓片，每片含香菇粗蛋白凍干原粉0.10.5mg。④香菇發(fā)酵粗蛋白口服液的制備由原料香菇粗蛋白凍干原粉100g，吐溫一8025g,甘露醇510g，加無菌水?dāng)嚢柘♂屩料愎酱值鞍缀繛?.10.5mg/ml。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明在體外抗腫瘤試驗(yàn)中，香菇C91-3發(fā)酵粗蛋白對H22(小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株)、U14(小鼠腹水型宮頸癌細(xì)胞株)及S180(小鼠腹水型肉瘤細(xì)胞株)有明顯的抑殺作用，其作用強(qiáng)度依賴于其濃度和時(shí)間。表明該菌株發(fā)酵粗蛋白具有有較強(qiáng)的直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。在體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)中，香菇C91-3發(fā)酵粗蛋白有治療腫瘤作用。對H22、U14荷瘤鼠能明顯延長荷瘤小鼠的生存期，并對H22實(shí)體腫瘤有明顯抑制作用。動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)急性毒性實(shí)驗(yàn)和長期毒性實(shí)驗(yàn)證明無毒副作用，安全可靠。以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。圖1為各組的實(shí)體瘤的大小，由上往下是NS、CY、LFP91-3I、LFP91-3II、LFP91-3III圖-2為生理鹽水組圖3為可見染色質(zhì)邊集圖-4可見凋亡小體圖-5可見細(xì)胞壞死具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:香菇發(fā)酵粗蛋白的制備l.香菇發(fā)酵液的制備(1)香菇發(fā)酵液培養(yǎng)基的制備葡萄糖lg新鮮啤酒酵母8g蔗糖6g全脂奶粉lg蛋白胨lg磷酸二氫鉀0.3g維生素B1O.Olg維生素B2O.Olg將上述物品加到1000ml蒸餾水中，混合后放入50。C水中水浴，使其完全溶解，調(diào)節(jié)PH7.5，分裝至300ml三角燒瓶中，每瓶250ml，用4層紗布外蓋一層牛皮紙封口，消毒滅菌15分鐘，冷卻后備用。(2)取第7天生長良好的香菇C91-3的菌絲體，接種到上述的培養(yǎng)基中，每瓶接種菌絲體lg。(3)置室溫?fù)u床上培養(yǎng)，前兩天75轉(zhuǎn)/分，第三天開始逐漸加轉(zhuǎn)速至100轉(zhuǎn)/分。每天觀察生長情況,無菌取少量培養(yǎng)物觀察孢子數(shù)，如果孢子數(shù)達(dá)到107/ml時(shí)停止培養(yǎng)，收集發(fā)酵液備用。(4)將發(fā)酵液在40℃、3，000g/min離心10min，收集上清液，然后以單層濾紙過濾上清液(4'C)除去其中懸浮的雜質(zhì)，并將所得的上清液放入4℃的環(huán)境中保存。2.香菇發(fā)酵粗蛋白的制備(1)在4'C向發(fā)酵液中緩慢加入硫酸銨粉末，同時(shí)以磁力攪拌器攪拌，直到硫酸銨過飽和時(shí)停止加入。靜置20min后，低溫離心機(jī)(5,000g/min，4°C)離心30min。棄去上清液，收集沉淀。(2)將上述所得的沉淀置于透析袋中，以去離子水作為透析緩沖液，4℃下透析除去殘留的硫酸銨。納氏試劑檢驗(yàn)是否有NH4+殘留，加入納氏試劑后溶液呈黃色則有NH4+殘留，反之無色。每30min更換一次緩沖液，直至除去全部NH4+。(3)將脫鹽后的蛋白質(zhì)(即粗蛋白)溶液于-20'C冰箱保存3.香燕發(fā)酵粗蛋白凍干原粉的制備將上清液經(jīng)過真空冷凍干燥機(jī)濃縮、凍干即得香菇C91-3發(fā)酵粗蛋白的凍干原粉，并于-20℃冰箱保存。此凍干原粉為土黃色粉末，可溶于水，有特定的香味，含有多種蛋白質(zhì)，分子量為1KD90KD。實(shí)施例2:香菇發(fā)酵粗蛋白膠囊的制備取香菇粗蛋白凍干原粉100g，低聚糖或乳糖400g，硬脂酸鈣或硬脂酸鎂30g，經(jīng)充分混捏、混合均勻后分裝口服用膠囊，每膠囊含香菇粗蛋白凍干原粉0.5mg.。實(shí)施例3:..香菇發(fā)酵粗蛋白速溶顆粒的制備取香菇粗蛋白凍干原粉100g，低聚糖或乳糖300g，糊精1000g，混合均勻后造粒、裝袋，每袋含菇粗蛋白凍干原粉0.5mg實(shí)施例4:香燕發(fā)酵粗蛋白片劑的制備取香菇粗蛋白凍干原粉100g，淀粉10000g，硬脂酸鈣或硬脂酸鎂30g，低聚糖或乳糖400g，混合均勻后壓片，每片含香菇粗蛋白凍干原粉0.5mg。實(shí)施例5:香菇發(fā)酵粗蛋白口服液的制備由原料香菇粗蛋白凍干原粉lOOg,吐溫一805g,甘露醇10g，加無菌水?dāng)嚢柘♂屩料愎酱值鞍缀繛?.5mg/ml。實(shí)施例6:香菇發(fā)酵粗蛋白對腹水型荷瘤小鼠生存期的影響H22、U14腫瘤細(xì)胞分別連續(xù)在BALB/C小鼠腹腔傳代兩代以上，選傳代后67天的小鼠，腹腔抽取腹水瘤細(xì)胞，Hank's液洗兩次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2.5X107/ml，0.2ml/只于小鼠腹腔接種腫瘤細(xì)胞，各造模50只。分別于24小時(shí)后隨機(jī)分成5組NS對照組、CY組、LFP91-3I組、LFP91-3II組、LFP91-3III組。NS對照組每次腹腔注射無菌生理鹽水lml/只，每日一次，連續(xù)5日；CY組予環(huán)磷酰胺0.4mg/只；LFP91-3I組予LFP91-350ug/只；LFP91-3II組予LFP91-3100ug/只；LFP91-3III組予LFP91-3150ug/只，劑量、途徑、方法、次數(shù)同NS組。分別觀察H22、U14荷瘤小鼠各組別的生存期，其結(jié)果見表l。表-1香菇發(fā)酵粗蛋白對H22、U14腹水型荷瘤小鼠生存期的影響<table>seeoriginaltablepage9</column></row><table>☆與NS組比較P〈0.05★與CY組比較P〈0.05結(jié)果表明LFP91-3各組和CY組均能顯著延長由H22和U14腫瘤細(xì)胞所致腹水型荷瘤小鼠的存活時(shí)間，與NS組比較P0.05。實(shí)驗(yàn)組對兩種腫瘤細(xì)胞所致的荷瘤小鼠生存期的影響表現(xiàn)出相似的結(jié)果。LFP91-3I組與CY組存活時(shí)間比較均無顯著差異(P>0.05),LFP91-3II組和LFP91-3III組存活時(shí)間均長于CY組(P0.05)，且荷瘤小鼠的存活時(shí)間隨LFP91-3濃度的增大而延長，均存在一定的劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例7香菇發(fā)酵粗蛋白對荷瘤小鼠實(shí)體腫瘤生長的影響將H22腫瘤細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2.5X107/ml，0.2ml/只右腋皮下注射小鼠50只，24小時(shí)后隨機(jī)分成5組。NS組予無菌生理鹽水lml/只；CY組予環(huán)磷酰胺0.4mg/只；LFP91-3I組予LFP91-350ug/只；LFP91-3II組予LFP91-3100ug/只；LFP91-3lII組予LFP91-3150ug/只，用藥途徑為右腋皮下注射，每日一次，連續(xù)十日。于接種腫瘤細(xì)胞后第13日處死小鼠，解剖剝離瘤體，稱瘤重計(jì)算抑瘤率，其結(jié)果見表-2和圖-l。抑瘤率=(l-T/C)X100%T=實(shí)驗(yàn)組平均瘤重C-對照組平均瘤重。表-2香菇發(fā)酵粗蛋白對荷瘤小鼠實(shí)體腫瘤的抑瘤率<table><row><column>組別</column><column>動(dòng)物數(shù)量</column><column>瘤重</column><column>抑瘤率</column></row><row><column></column><column>NS</column><column>10</column><column>2.01±0.27</column><column>/</column></row><row><column></column><column>CY</column><column>10</column><column>1.22土0.28☆★</column><column>39.55</column></row><row><column></column><column>LFP91-3I</column><column>10</column><column>1.00土0.29☆★</column><column>50.37</column></row><row><column></column><column>LFP91-3II</column><column>10</column><column>0.91±0.28☆★</column><column>54.58</column></row><row><column></column><column>LFP91-3III</column><column>10</column><column>0.52士0.28☆★</column><column>74.13</column></row><table>☆與NS組比較P〈0.05★與CY組比較P〈0.05結(jié)果表明香菇發(fā)酵粗蛋白各組與CY組均能抑制腫瘤生長，其抑瘤率分別為39.55%、50.37%、、54.58%、74.13%，LFP91-3各組與CY組小鼠瘤重均顯著低于NS組(P〈0.05);LFP91-3各組與CY組比較(P<0.05)，說明香菇發(fā)酵粗蛋白組抑瘤效果強(qiáng)于CY組。隨香菇提取蛋白濃度的加大抑瘤作用也更加明顯，存在一定的濃度依賴關(guān)系。實(shí)施例8香菇發(fā)酵粗蛋白體外對腫瘤細(xì)胞的作用(1)腫瘤細(xì)胞的制備體外培養(yǎng)的H22、U14、S180細(xì)胞經(jīng)腹腔分別接種于46周齡的BALB/C小鼠，68天后取腹水中的腫瘤細(xì)胞，離心洗滌后用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)供實(shí)驗(yàn)使用。(2)對H22、U14、S180細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(MTT法)選取對數(shù)生長期的H22、U14、S180細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至lX105/ml，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100ul,加入無菌生理鹽水100ul作為對照組；分別加入不同濃度的菇發(fā)酵粗蛋白(5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml)100ul作為實(shí)驗(yàn)組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37°C、5。/。C02孵箱中培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后，加入MTT(lmg/ml)100ul,再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，離心棄上清，每孔加100ul溶解液，震蕩器震蕩，至甲臢顆粒完全溶解，用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值，(檢測波長570nm，參考波長630nm)計(jì)算抑瘤率，其結(jié)果見表-3。抑瘤率=(l-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)X100%表-3香菇發(fā)酵粗蛋白對不同腫瘤細(xì)胞在不同時(shí)間抑瘤率的比較<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(3)對腫瘤細(xì)胞周期的作用選取對數(shù)生長期的H22、U14細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5X10S/ml，在培養(yǎng)液中加入無菌生理鹽水作為對照組，實(shí)驗(yàn)組加入香菇發(fā)酵粗蛋白至終濃度為100ug/ml，分別培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后收集細(xì)胞，生理鹽水洗滌三次，收集細(xì)胞，每份樣品細(xì)胞數(shù)l2Xl(^/ml,4。C、70-75%乙醇固定4小時(shí)以上，然后進(jìn)行PI染色，上流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析，結(jié)果見表-4。表-4香菇發(fā)酵粗蛋白作用不同時(shí)間對U14、H22凋亡及細(xì)胞周期的影響<table>complextableseeorginaldocumentpage9</column></row><table>(4)形態(tài)學(xué)觀察選對數(shù)生長期的H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5X105/ml。在培養(yǎng)液中加入無菌生理鹽水作為對照，實(shí)驗(yàn)組加入LFP91-3至終濃度為150ug/ml，培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后收集細(xì)胞，用PBS洗滌一次，2.5%戊二醛固定，按電鏡制片的常規(guī)方法脫水、包埋、超薄切片、染色，并拍照記錄，結(jié)果見圖-2、圖-3、圖-4和圖-5。結(jié)果表明香菇發(fā)酵粗蛋白可以抑制H22、U14、S180細(xì)胞的生長，其作用強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間的依賴性。H22、U14細(xì)胞在香菇發(fā)酵粗蛋白作用下隨時(shí)間的延長，兩株細(xì)胞G0/G1期比率逐漸下降，S期比率逐漸升高，均形成S期細(xì)胞的堆積，且存在時(shí)間依賴性。提示香菇發(fā)酵粗蛋白作用后凋亡的發(fā)生可能與周期阻滯有關(guān)，通過細(xì)胞周期阻滯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能是香菇發(fā)酵粗蛋白抗腫瘤作用的機(jī)制之一。電鏡下可見NS組的腫瘤細(xì)胞體積較大，染色質(zhì)均勻，有微絨毛。經(jīng)LFP91-3作用后72h動(dòng)態(tài)觀察可見:微絨毛消失，細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)濃集并靠近核膜，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞核染色質(zhì)進(jìn)一步固縮并可裂解為一個(gè)或多個(gè)致密小體，與一定的細(xì)胞器形成具有完整膜結(jié)構(gòu)的凋亡小體。實(shí)施例9:動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)(1)急性毒性實(shí)驗(yàn)取昆明小鼠40只(雌雄各半)，體重2022g，于24小時(shí)內(nèi)灌胃3次，使累計(jì)的服用量為上述用藥的225倍，連續(xù)觀察小鼠14天，無死亡現(xiàn)象及不良反應(yīng)，說明此制劑無毒副作用。(2)長期毒性實(shí)驗(yàn)取體重適宜的大鼠40只(雌雄各半)，隨機(jī)分為兩組，一組為香菇發(fā)酵粗蛋白實(shí)驗(yàn)組，以上述實(shí)驗(yàn)劑量的IOO倍連續(xù)灌胃60天；另一組為加等量蒸餾水對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此期間兩組動(dòng)物均無死亡及不良反應(yīng)，兩組動(dòng)物食欲、大小便及體重在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無顯著性差異(p>0.05);血液白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板等血常規(guī)指標(biāo)兩組間無顯著性差異(p>0.05);兩組動(dòng)物臟器解剖病理觀察均無異常病理現(xiàn)象，說明此制劑長期服用安全可靠。權(quán)利要求1.具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白，是以香菇C91-3的菌絲體經(jīng)發(fā)酵、鹽析、透析、干燥而得；為淡褐色或土黃色的粉末，可溶于水，有特定的香味，水溶液pH5.0～8.0，分子量為1KD～90KD，含有18種氨基酸和多種蛋白質(zhì)。2、具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白的提取方法，其特征在于工藝步驟為I.香燕發(fā)酵液的制備(1)將含有以下重量分的原料葡萄糖0.515、蔗糖0.515、蛋白胨0.510、VB10.0011、新鮮啤酒酵母116、全脂奶粉O.510、磷酸二氫鉀0.15、VB20.0011和1000重量份蒸餾水中混合在206(TC水浴中，使其完全溶解，調(diào)節(jié)pH5.08.0，分裝至300ml三角燒瓶中，每瓶250ml，用4層紗布外蓋一層牛皮紙封口，消毒滅菌1520min，冷卻后備用；(2)取710天生長良好的香菇C91-3的菌絲體，接種到上述的培養(yǎng)基中，每瓶接種菌絲體0.515g;(3)置室溫?fù)u床上培養(yǎng)，前兩天50100轉(zhuǎn)/分，第三天開始逐漸加轉(zhuǎn)速至100150轉(zhuǎn)/分。每天觀察生長情況，無菌取少量培養(yǎng)物觀察孢子數(shù)，如果孢子數(shù)達(dá)到105101Q/ml時(shí)停止培養(yǎng)，收集發(fā)酵液備用；(4)將發(fā)酵液在08'C、3，000g/min離心10min，收集上清液，然后在08'C下以單層濾紙過濾上清液除去其中懸浮的雜質(zhì)，并將所得的上清液為不透明的淡褐色或土黃色，在08'C的下保存；n.香菇發(fā)酵粗蛋白的制備(1)在08'C緩慢鹽析發(fā)酵液，攪拌下直到過飽和時(shí)為止，靜置20min后，08'C下離心30min，收集沉淀；(2)將沉淀置于透析袋中，以去離子水作為透析緩沖液，08'C下透析，每30min更換一次緩沖液，直至除去全部的鹽，于-20'C冰箱保存；(3)將脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過真空冷凍干燥機(jī)濃縮凍干得香菇發(fā)酵粗蛋白固體原粉。3、具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白制劑，其特征在于將香菇發(fā)酵粗蛋白凍干原粉與賦形劑按比例制成成各種口服劑型。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白制劑，其特征在于是口服膠囊，由香菇發(fā)酵粗蛋白凍干原粉100g，低聚糖或乳糖400600g，硬脂酸鈣或硬脂酸鎂1030g，經(jīng)充分混捏、混合均勻后分裝口服用膠囊，每膠囊含香菇粗蛋白凍干原粉(U0.5mg.。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白制劑，其特征在于是速溶顆粒，由香菇發(fā)酵粗蛋白凍干原粉100g，低聚糖或乳糖100300g，糊精3001000g，混合均勻后造粒、裝袋，每袋含香菇粗蛋白凍干原粉0.10.5mg。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白制劑，其特征在于是片劑，，由香菇發(fā)酵粗蛋白凍干原粉100g，淀粉10000g，硬脂酸鈣或硬脂酸鎂1030g，低聚糖或乳糖400600g，混合均勻后壓片，每片含香菇粗蛋白凍干原粉0.10.5mg。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白制劑，其特征在于是口服液，由香菇發(fā)酵粗蛋白凍干原粉100g，吐溫一8025g，甘露醇510g，加無菌水?dāng)嚢柘♂屩料愎酱值鞍缀繛?.10.5mg/ml。全文摘要具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵粗蛋白、提取方法及其制劑。是以香菇C91-3的菌絲體經(jīng)發(fā)酵、鹽析、透析、干燥而得；為淡褐色或土黃色粉末，溶于水，有特定香味，水溶液pH5.0～8.0，分子量為1KD～90KD，含有18種氨基酸和多種蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明體外抗腫瘤試驗(yàn)中，對H22、U14及S180有明顯的抑殺作用，其作用強(qiáng)度依賴于其濃度和時(shí)間。表明該菌株發(fā)酵粗蛋白具有較強(qiáng)的直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。在體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)中，香菇C91-3發(fā)酵粗蛋白有治療腫瘤作用。對H22、U14荷瘤鼠能明顯延長荷瘤小鼠的生存期，并對H22實(shí)體腫瘤有明顯抑制作用。動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)和長期毒性實(shí)驗(yàn)證明無毒副作用，安全可靠。文檔編號(hào)A61P35/00GK101343652SQ200810013120公開日2009年1月14日申請日期2008年9月8日優(yōu)先權(quán)日2008年9月8日發(fā)明者寧安紅,李星云,王曉麗,越趙,鐘民濤,敏黃申請人:大連醫(yī)科大學(xué)