專利名稱：一種從菜豆中提取α-淀粉酶抑制劑的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取a-淀粉酶抑制劑的方法，特別涉及一種從菜豆中提 取a-淀粉酶抑制劑的方法。
背景技術：
肥胖已經成為全人類社會進步文明的一大障礙，同時是危害人類健康的一 類疾病。它不僅會誘發糖尿病、高血脂等癥狀的提前到來，而且還會給患者本 人帶來巨大的精神負擔。因此，預防和治療肥胖已成為全人類值得關注的問題 之一，探索新的預防和治療措施是科學研究的重點和難點之一。目前，預防和治療肥胖的方法有運動燃燒脂肪法、抽脂法、節食法和服用 保健品法等。運動法是目前最環保的一種方法，但由于其要么需要專業和昂貴 的運動器材，要么需要有合適的場地，都會給使用者帶來很大的不便；抽脂法 雖然是一種立竿見影的速效減肥方法，但它需要有專業的美體師去操作相應的 設備， 一般不可能自己完成，而且具有一定的風險性；節食法是一種比較科學的方法，但由于人們長期養成一些飲食習慣，要在短期內給予改變，需要付出無法衡量的艱辛，況且，如果沒有科學的節食計劃還會影響人體的健康；保健 品減肥目前成為人們預防和治療肥胖的一種較為理想的方法，但由于巿場上品 種繁多，而且有些保健品還含有激素物質，會嚴重影響到人體的代謝平衡，可 能會給人體的健康帶來一些不可恢復的問題，所以開發綠色、安全、高效的減 肥產品是預防和治療肥胖的一種行之有效的方法。(x-淀粉酶抑制劑是屬于糖(苷)水解酶抑制劑中的一種，它能有效地抑制 腸道內唾液及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖 分的攝取，降低了血糖和血脂含量水平，合食后不產生高血糖癥，從而胰島素 分泌減少，脂肪合成降低，體重減輕。此種酶抑制劑來源于綠色植物，是一種 蛋白類保健品，對人體沒有任何毒副作用，同時，沒有文獻資料顯示該抑制劑具有破壞酶系統的性質。因此，a-淀粉酶抑制劑可以作為以禾谷類食物為主的中國肥胖患者使用，符合中國的國情；同時也是世界糖尿病患者的一種安全的治療藥物，可以面向全球推廣。a-淀粉酶抑制劑都是些有機化合物，它們與酶形成酶抑制劑復合物而使酶 失活。在化學結構上，它們可以是蛋白質、多肽和碳水化合物。具有a-淀粉酶 抑制活性的蛋白質分布較廣，可以從小麥、大麥、小米、高梁、谷物、花生、 大豆、芋頭根等植物和一些微生物中分離得到，抑制劑分子量大小為 9000-63000Da。據Leiner等報道菜豆中的a-淀粉酶抑制劑與其它種類相比具 有高效價。因其含有幾種特殊類型的抑制劑(耐熱和不耐熱)而倍受國外內許 多研究工作者關注。據Lajolo等報道黑菜豆中含有兩種同效抑制劑，白菜豆中 一些抑制劑為一種糖蛋白，帶有一個相同妁肽或不同的多肽，能抑制哺乳動物和 昆蟲淀粉酶的活性。因此，目前，菜豆是提取天然高效a-淀粉酶抑制劑的唯 一植物源。美國專利(US 6340699 )公開了 一種釆用熱處理和/或使用溶劑的方法提取淀粉酶抑制劑的方法。然而，熱處理和/或使用溶劑法存在許多缺點。如高溫 提取容易降解淀粉酶抑制劑中的一些熱敏性物質，使淀粉酶抑制劑的穩定性和活性降低；溶劑法提取常因大量使用有機溶劑會導致環境污染和產品溶劑殘留 問題，存在環保和健康方面的顧慮。中國專利"純化淀粉酶抑制劑及用于獲得 該淀粉酶抑制劑的新穎方法"(CN 1665521A)公開了 一種利用超臨界二氧化碳 除去研磨豆子中的雜質，進一步純化淀粉酶抑制劑的方法。該方法首先研磨豆 子，接著在真空條件下，用超臨界二氧化碳浸提雜質，然后用加熱的去離子水 重復提取處理過的豆子2次，每次持續加熱2小時，并收集提取液，最后用熱 交換法濃縮和冷凍干燥得到產品。但是，超臨界萃取設備投資大，對生產條件 要求苛刻，且長時間加熱提取也會損壞淀粉酶抑制劑的活性。中國發明專利(ZL 200410041455.4 )公開了 一種雙水相萃取體系及應用此體系分離純化淀粉酶抑 制劑的方法。該方法主要在a-淀粉酶抑制劑粗提液中加入聚乙二醇和果糖-1， 6-二磷酸金屬鹽，它們是對生化產品的生物活性具有穩定與保護主要的成相 試劑，有利于淀粉酶抑制劑乳液快速進行相分離，提高膜分離技術的效率。上述公開文獻所描述的a-淀粉酶抑制劑大都是利用傳統的加熱溶劑浸提 法制備的。在提取過程中加熱，容易導致部分淀粉發生糊化，溶液粘度增大，給后續的過濾和離心分離操作帶來了困難，且長時間加熱提取會降低產品的生物活性；由于工藝的限制，原料不能粉碎過細，導致細胞壁的破碎度降低，不 利于細胞中的淀粉酶抑制劑完全釋放，需要消耗大量提取溶劑并進行長時間萃 取。因此，傳統的加熱溶劑浸提法在制備a-淀粉酶抑制劑時，具有能耗高、溶劑消耗大、生產周期長、環保壓力大、產品質量低、生產成本高等缺點。 發明內容本發明的目的是針對上述現有技術的不足，提供一種利用超聲波萃取技術從菜豆中提取a-淀粉酶抑制劑的方法，可快捷、安全、環保地制備高含量、 高活性的藥用a-淀粉酶抑制劑，并節省大量的提取溶劑(水)，簡化生產工藝， 降低產品成本。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是 一種從菜豆中提取a-淀粉 酶抑制劑的方法，其特征是包括以下步驟(1) 先將粉碎的菜豆加入到pH為2-10的緩沖溶液中，攪拌均勻后，置 于超聲波設備中進行萃取5-60分鐘，然后過濾，得到濾液；所述菜豆和緩沖溶 液的重量百分比為1 : 1-20;(2) 滅酶處理將步驟(1)中的濾液釆用常規加熱30分鐘，或微波輻 射1-10分鐘，使濾液中的菜豆酶失活；(3) 將步驟(2)中滅酶處理后的溶液離心分離30分鐘，保留上清液；(4) 將步驟(3)中的上清液用透析袋密封，置于去離子水中透析3小時；(5) 向透析后的上清液中加入有機醇溶劑得到沉淀物；所述上清液和有 機醇溶劑的體積比為5: 1;(6) 干燥沉淀物，即得到a-淀粉酶抑制劑。上述步驟(1)中所述菜豆為豆科菜豆屬的一種或多種植物的成熟籽實； 上述步驟(1)中所述超聲波設備功率為50 - 5000W,頻率為20-100KHz。 上述步驟(6)中所述干燥采用常壓烘干、減壓烘干、噴霧干燥和冷凍干 燥中的一種或幾種。本發明方法較現有技術提取a-淀粉酶抑制方法具有如下明顯的有益效 果(1)釆用超聲提取和微波滅酶等步驟，可以將a-淀粉酶抑制的生產周期 從20-28小時縮短到8 - 13小時，使得a -淀粉酶抑制的 一次提取產物含量達至U 80-95%,抑制活性為5000-50000 U/g,提高了生產效率；(2)該方法獲 得的a-淀粉酶抑制含量高，可減輕產品進一步純化的壓力，生產工藝更加簡 單，另外萃取劑需求量小，節水約50%，大大降低生產成本，具有快速高效、 節能、污染小的特點；(3)本發明所提取的a-淀粉酶抑制產品在藥物方面有 重要的應用價值，特別在治療肥胖、糖尿病、高血脂方面的表現了良好的應用 前景和經濟價值，為制藥工業提供了豐富的原料。


圖l是本發明的工藝流程圖；具體實施方式
以下結合附圖及實施例對本發明作進一步的詳細說明。 實施例1用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到100克pH為2.0的緩沖溶液中， 攪拌均勻，在功率為50W，頻率為20KHz的超聲波萃取設備中提取5分鐘后， 過濾得濾液，并利用熱交換法常規加熱30分鐘滅酶，離心分離30分鐘并取上 清液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉淀物， 所述提取液和有機醇的體積比為5:1,經常壓烘干后，得到蛋白質含量為 80.3%,生物活性為5000 U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。實施例2用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到500克pH為3.0的緩沖溶液中， 攪拌均勾，在功率為100W，頻率為40KHz的超聲波萃取設備中提取10分鐘 后，過濾得濾液，并利用熱交換法常規加熱30分鐘滅酶，離心分離30分鐘并 取上清液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉 淀物，所述提取液和有機醇的體積比為5:1，經減壓烘千后，得到蛋白質含量 為83.6%,生物活性為7192 U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。實施例3用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到1000克pH為4.0的緩沖溶液中， 攪拌均句，在功率為200W，頻率為60KHz的超聲波萃取設備中提取30分鐘 后，過濾得濾液，并利用熱交換法常規加熱30分鐘滅酶，離心分離30分鐘并取上清液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉淀物，所述提取液和有機醇的體積比為5: i，經常壓烘干后，得到蛋白質含量為89.1%,生物活性為8931 U/g的a -淀粉酶抑制劑產品。 實施例4用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到1500克pH為6.0的緩沖溶液中， 攪拌均勻，在功率為IOOOW，頻率為40KHz的超聲波萃取設備中提取40分 鐘后，過濾得濾液，并利用熱交換法常規加熱30分鐘滅酶，離心分離30分鐘 并取上清液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到 沉淀物，所述提取液和有機醇的體積比為5: 1，經常壓烘干后，得到蛋白質含 量為92.4%,生物活性為25390 U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。實施例5用天平稱量IOO克粉碎的菜豆粉加入到1000克pH為8.0的緩沖溶液中， 攪拌均勻，在功率為3000W，頻率為80KHz的超聲波萃取設備中提取35分 鐘后，過濾得濾液，并利用熱交換法常規加熱30分鐘滅酶，離心分離30分鐘 并取上清液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到 沉淀物，所述提取液和有機醇的體積比為5 : 1,得到蛋白質含量為82.9%,生 物活性為10843 U/g的a -淀粉酶抑制劑產品。實施例6用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到400克pH為9.0的緩沖溶液中， 攪拌均勻，在功率為4000W,頻率為20KHz的超聲波萃取設備中提取60分 鐘后，過濾得濾液，并利用熱交換法常規加熱30分鐘滅酶，離心分離30分鐘 并取上清液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到 沉淀物，所述提取液和有機醇的體積比為5: 1，經減壓烘干后，得到蛋白質含 量為80%，生物活性為5124U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。實施例7用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到2000克pH為10.0的緩沖溶液中， 攪拌均勻，在功率為5000W,頻率為20KHz的超聲波萃取設備中提取45分 鐘后，過濾得濾液，并利用熱交換法常規加熱30分鐘滅酶，離心分離30分鐘 并取上清液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到 沉淀物，所述提取液和有機醇的體積比為5: 1，經常壓烘干后，得到蛋白質含量為93.8%，生物活性為43819 U/g的a -淀粉酶抑制劑產品。 實施例8用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到100克pH為5.0的緩沖溶液中， 攪拌均勻，在功率為3000W,頻率為60KHz的超聲波萃取設備中提取60分 鐘后，過濾得濾液，并利用微波輻射1分鐘滅酶，離心分離30分鐘并取上清 液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉淀物， 所述提取液和有機醇的體積比為5:1，經減壓烘干后，得到蛋白質含量為 81.7% ，生物活性為6528 U/g的a -淀粉酶抑制劑產品。實施例9用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到500克pH為7.0的緩沖溶液中， 攪拌均匈，在功率為100W,頻率為lOOKHz的超聲波萃取設備中提取15分 鐘后，過濾得濾液，并利用微波輻射4分鐘滅酶，離心分離30分鐘并取上清 液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉淀物， 所述提取液和有機醇的體積比為5:1,經減壓烘干后，得到蛋白質含量為 86.9% ，生物活性為42839 U/g的a -淀粉酶抑制劑產品。實施例10用天平稱量IOO克粉碎的菜豆粉加入到1000克pH為6.0的緩沖溶液中， 攪拌均勻，在功率為2000W,頻率為80KHz的超聲波萃取設備中提取5分鐘 后，過濾得濾液，并利用微波輻射5分鐘滅酶，離心分離30分鐘并取上清液， 在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉淀物，所述 提取液和有機醇的體積比為5 : 1，經常壓烘干后，得到蛋白質含量為92.7%, 生物活性為24381U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。實施例11用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到600克pH為8.0的緩沖溶液中， 攪拌均勻，在功率為200W,頻率為lOOKHz的超聲波萃取設備中提取50分 鐘后，過濾得濾液，并利用微波輻射10分鐘滅酶，離心分離30分鐘并取上清 液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉淀物， 所述提取液和有機醇的體積比為5:1,經噴霧干燥后，得到蛋白質含量為 90.2%，生物活性為17391U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。實施例12用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到1300克pH為2.0的緩沖溶液中， 攪拌均勾，在功率為4000W,頻率為40KHz的超聲波萃取設備中提取55分 鐘后，過濾得濾液，并利用微波輻射8分鐘滅酶，離心分離30分鐘并取上清 液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉淀物， 所述提取液和有機醇的體積比為5:1，經噴霧干燥后，得到蛋白質含量為 85.1%,生物活性為5627U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。實施例13用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到2000克pH為4.0的緩沖溶液中， 攪拌均勻，在功率為5000W,頻率為20KHz的超聲波萃取設備中提取15分 鐘后，過濾得濾液，并利用微波輻射8分鐘滅酶，離心分離30分鐘并取上清 液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉淀物， 所述提取液和有機醇的體積比為5:1，經冷凍干燥后，得到蛋白質含量為 91.9%，生物活性為50000U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。實施例14用天平稱量IOO克粉碎的菜豆粉加入到l卯O克pH為IO.O的緩沖溶液中， 攪拌均句，在功率為2000W，頻率為lOOKHz的超聲波萃取設備中提取60分 鐘后，過濾得濾液，并利用微波輻射10分鐘滅酶，離心分離30分鐘并取上清 液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉淀物， 所述提取液和有機醇的體積比為5:1,經冷凍干燥后，得到蛋白質含量為 95.0%,生物活性為8219U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。實施例15用天平稱量100克粉碎的菜豆粉加入到100克pH為6.0的緩沖溶液中， 攪拌均勾，在功率為4000W，頻率為40KHz的超聲波萃取設備中提取55分 鐘后，過濾得濾液，并利用傳統熱交換加熱30分鐘滅酶，離心分離30分鐘并 取上清液，在去離子水中透析3小時，向透析后的提取液中加入有機醇得到沉 淀物，所述提取液和有機醇的體積比為5: 1,經冷凍干燥后，得到蛋白質含量 為94.2%,生物活性為36184U/g的a-淀粉酶抑制劑產品。上述實施例所用超聲設備可以為超聲清洗機、探頭式超聲粉碎機和循環超 聲提取機中的任意一種。a-淀粉酶抑制劑產品的質量檢測方法
1、 蛋白含量檢測釆用Lowry法；
2、 a-淀粉酶抑制劑的抑制活性測定采用Bernfeld法利用淀粉水解液中的還原糖與3, 5-DNS結合顏色變化，且還原糖在一定 濃度內，于540nm處的吸光值和還原糖的量呈線性關系的特點，根據淀粉酶抑 制劑加入前后a-淀粉酶分解淀粉產生的還原糖量的差值即可計算出抑制劑的 活性。取適量用0.12 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.10)制備的a-淀粉酶儲備液， 37。C保溫15min，加入100 uL濃度為10 g/L的可溶性淀粉，準確反應5 min。 反應完成后加入500uL3， 5-DNS,并沸水洛加熱10 min,取出反應液冰浴冷 卻15 min，并在540 nm處測定吸光度值(A54()nm )。調整抑制劑溶液及a-淀 粉酶溶液的濃度或用量使A54(( iim的值處于0.4~0.7范圍內為宜。a-淀粉酶抑制劑活性的定義l個抑制活力單位(U)為在上述條件下，抑制率為50%時抑制劑的用量； a —淀粉酶抑制率(％ ) = (AE540 - AI540 ) /AE540 其中AEs4o為只加淀粉酶時，水解產物在540nm處的吸光度值； AI，為加入抑制劑后，水解產物在540nm處的吸光度值。
權利要求
1. 一種從菜豆中提取α-淀粉酶抑制劑的方法，其特征是包括以下步驟(1)先將粉碎的菜豆加入到pH為2-10的緩沖溶液中，攪拌均勻后，置于超聲波設備中進行萃取5-60分鐘，然后過濾，得到濾液；所述菜豆和緩沖溶液的重量百分比為1∶1-20；(2)滅酶處理將步驟(1)中的濾液采用常規加熱30分鐘，或微波輻射1-10分鐘，使濾液中的菜豆酶失活；(3)將步驟(2)中滅酶處理后的溶液離心分離30分鐘，保留上清液；(4)將步驟(3)中的上清液用透析袋密封，置于去離子水中透析3小時；(5)向透析后的上清液中加入有機醇溶劑得到沉淀物；所述上清液和有機醇溶劑的體積比為5∶1；(6)干燥沉淀物，即得到α-淀粉酶抑制劑。
2. 根據權利要求1所述的一種從菜豆中提取a-淀粉酶抑制劑的方法，其 特征是步驟(1)中所述菜豆為豆科菜豆屬的一種或多種植物的成熟籽實；
3. 根據權利要求1所述的一種從菜豆中提取a-淀粉酶抑制劑的方法，其 特征是步驟(l)中所述超聲波設備功率為50-5000W，頻率為20-100KHz。
4. 根據權利要求l所述的一種從菜豆中提取a-淀粉酶抑制劑的方法，其 特征是步驟(6)中所述干燥采用常壓烘干、減壓烘干、噴霧干燥和冷凍千燥 中的一種或幾種。
全文摘要
本發明公開了一種從菜豆中提取α-淀粉酶抑制劑的方法，該方法是先將粉碎的菜豆用一定酸堿度的緩沖溶液分散，接著轉入超聲波設備中進行超聲提取，然后經滅酶、離心分離、透析、醇沉，最后干燥得到α-淀粉酶抑制劑。本發明從菜豆中提取的α-淀粉酶抑制劑為白色固體粉末，其蛋白質含量達80-95％，抑制活性為5000-50000U/g。本發明與傳統的浸提法相比具有快速高效、節能、污染小的特點，一次提取α-淀粉酶抑制劑含量高、活性強，避免了循環提取消耗大量的水和能源，是一種綠色環保、具有廣泛應用前景的新工藝。
文檔編號A61K36/185GK101269111SQ200810018158
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月9日 優先權日2008年5月9日
發明者周雯麗, 程全賢, 賈光鋒, 賈榮博 申請人:陜西卓瑞生物技術有限公司