專利名稱：：一種頂頭孢菌素及其制法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及從藥用才直4勿纟各石(7>ac/e/as7^nwwwyixs7w'"o/cfes(Lindl.)Lem.(Apocynaceae))根部內生菌頂頭孢(C'卬/wto印oWww固體發酵物中提取分離的一種頂頭孢菌素(cephalosol)及其制法與抗菌作用。
背景技術：
：雖然微生物的次生代謝產物已被廣泛研究，但特境微生物及其活性次生代謝產物還是沒有引起人們的重視。植物內生菌是一類分布廣泛、種類繁多、具有重要生理和生態功能的特境微生物，其活性次生代謝產物正成為目前天然產物化學領域的研究熱點。致病菌的擴散及其耐藥性的增強嚴重威脅著人類的健康和生命，抗菌藥物已作為常規用藥廣泛用于艾滋病、器官移植以及慢性消耗性疾病(如癌癥、糖尿病、尿毒癥等)的治療，雖然目前臨床上使用的抗菌藥劑(如酮康唑、阿米卡星、慶大霉素、活力康唑、伊曲康唑、特比萘芬、二性霉素、氟康挫等)對皮膚及淺表部位感染的療效較好，但這些抗菌藥物的蓄積毒性較強，常常引起肝腎損傷、消化道剌激、頭暈、過敏等，所以尋找作用機理獨特的新型抗菌藥物成為當今藥物研發的熱點之一。藥用植物內生菌具有豐富的生物多樣性和化學多樣性，能夠產生化學結構獨特、活性顯著的抗菌物質(參見ZhangHW,SongYC,TanRX./Voc/.2006,23:753;TanRX,ZouWX.Ato.2001，18:448)。到目前為止，尚未見從絡石內生菌頂頭孢(C印/za/o^on'wmacw附om'MW)分離到抗菌物質的報道。
發明內容本發明的目的在于1.提供一個具有抗菌活性的新骨架頂頭孢菌素；2.提供一種提取、分離該新骨架頂頭孢菌素的方法；3.提供一種本發明的新骨架頂頭孢菌素在制備抗菌藥物中的應用。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。新骨架頂頭孢菌素具有下述結構:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中l，2，3，5，7，8,9，10，11，12為碳原子序數編號。一種新骨架頂頭孢菌素的制備方法，其特征是，它包括下述步驟步驟1.將新鮮健康的絡石內生真菌頂頭孢(C印/zafo印on'wwacrewo"/ww/^S-五007)菌絲體塊接種到PDA培養基上，置搖床上，在140ipm、28。C條件下培養3天作為種子液；步驟2.種子液接種于固體培養基中，固體培養基組成為每瓶中含小米7.58,麩皮7.5g，酵母膏0.5g，FeS04'7H200.01g，酒石酸鈉0.1g，谷氨酸鈉0.1g，玉米油0.1mL，蒸餾水15mL，28。C條件下發酵30天；步驟3.將步驟2所得發酵物經混合溶劑氯仿/甲醇(體積比l:l)常溫浸提3次，料液比2:5(g/ml)，過濾低溫真空濃縮，得到黑色粗浸膏F;步驟4.將粗浸膏F溶于甲醇中，料液比7:10(g/mL)，加熱回流lh后，冷卻室溫并放入-18'C冰箱中，過夜，抽慮除去粗浸膏F中的蠟、油脂和鹽類物質，重復三次，得到浸膏Fl;步驟5.對浸膏Fl進行硅膠柱層析，依次用10倍色譜柱保留體積的氯仿、氯仿/甲醇(體積比100:1)、氯仿/甲醇(體積比100:2)、氯仿/甲醇(體積比100:4)洗脫，合并氯仿/甲醇(體積比100:4)洗脫的洗脫液，得到浸膏F2;步驟6.將浸膏F2再上硅膠柱層析分離，用氯仿/甲醇混合溶液洗脫，合并氯仿/甲醇(體積比100:2)洗脫的洗脫液，得浸膏F3;步驟7.利用葡聚糖凝膠SephadexLH-20對浸膏F3進行柱層析，洗脫溶劑為氯仿/甲醇(體積比l:l)，定量收集洗脫劑，TLC檢測含有亮藍色熒光的部分，合并洗脫劑后低溫真空除去洗脫劑，得到頂頭孢菌素。本發明得到的新骨架頂頭孢菌素對人類致病菌大腸桿菌(五wteWcW"co//)、熒光假單孢菌(i^wdowo"as/7Momsce"ce)、紅色毛癬菌(7Wcfey一o"ra6ran)禾口白色念珠菌(C朋cft(iaa/6f^n)有很強的抑制作用，所以頂頭孢菌素可作為具有抗菌作用的化合物，并有望在制備抗菌藥物中得到應用。與現有技術相比，本發明具有下述突出優點1.本發明的頂頭孢菌素是全新碳骨架化合物，可以作為具有抗菌作用的新藥物或先導化合物；2.本發明的頂頭孢菌素可以利用微生物進行液體發酵生產，操作工藝簡便，周期短，成本低，來源有保證；3.本發明利用生物法合成頂頭孢菌素對環境無污染。具體實施例方式通過下面給出的具體實施例可以進一步了解本發明。但它們不是對本發明的限定。實施例1:植物內生菌頂頭包(CepAa《ospohwmacr^nom'in/F5-￡007)的分離與純化取新鮮健康的絡石根，裝入保鮮袋中密封標記，并快速將樣品拿到實驗室中(20°C),5h內進行內生菌分離。絡石根用清水洗凈，切成lcm左右的小段后依次浸泡于75。/。酒精lmin、1%次氯酸鈉溶液(含游離氯>2.5%)10min、75%酒精1min，再用含有雙抗(200IU/mL青霉素和150IU/ml鏈霉素)的WA培養基(20g瓊脂、蒸餾水1000mL)平板培養。待菌落從切口處長出后,轉接至PCA培養基(20g馬玲薯、20g胡蘿卜、20g瓊脂、蒸餾水1000mL)進行內生真菌的分離，經菌落形態學觀察、孢子形態和18SrDNA分子鑒定為頂頭孢，C印/a/o印on'wwac^TOm'wm/FS-￡007，保藏單位；中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏日期2008年7月15日，保藏號為CGMCCN0.2595。實施例2:植物內生菌頂頭孢(C印/za/cwpon'wwflcwwom'ww/^S-￡007)的固體發酵活化植物內生菌頂頭孢(Ce;^Zo5pon'wmacremom'wm/FS-￡007)，將新鮮的菌絲體塊接種到1000mL錐形瓶中，每瓶含有400mL的PDA培養基，在140rpm、28。C條件下培養3天作為種子液；將20mL種子液接種于含有固體培養基的廣口瓶中，28。C條件下發酵30天，其中固體培養基的組成為每瓶中含小米7.5g，麩皮7.5g，酵母膏0.5g，FeSO47H2O0.01g，酒石酸鈉O.lg,谷氨酸鈉0.1g，玉米油O.lmL,蒸餾水15mL。實施例3:頂頭孢菌素的提取與分離將實施例2中所得發酵物用氯仿/甲醇(體積比l:l)常溫浸提3次，料液比2:5(g/ml),過濾低溫真空濃縮，得到黑色粗浸膏F;將粗浸膏F溶于甲醇中，料液比7:10(g/mL)，加熱回流lh后，冷卻室溫并放入-18X:冰箱中，過夜，抽慮除去粗浸膏F中的蠟、油脂和鹽類物質，重復三次，得到浸膏F1;對浸膏F1進行硅膠柱層析，依次用IO倍色譜柱保留體積的氯仿、氯仿/甲醇(體積比100:1)、氯仿/甲醇(體積比100:2)、氯仿/甲醇(體積比100:4)洗脫，合并氯仿/甲醇(體積比100:4)洗脫的洗脫液，得到浸膏F2;將浸膏F2再上硅膠柱層析分離，用氯仿/甲醇混合溶液洗脫，合并氯仿/甲醇(體積比100:2)洗脫的洗脫液，得浸膏F3;利用葡聚糖凝膠SephadexLH-20對浸膏F3進行柱層析，洗脫溶劑為氯仿/甲醇(體積比1:1)，定量收集洗脫劑，TLC檢測含有亮藍色熒光的部分，合并洗脫劑后低溫真空除去洗脫劑，得到頂頭孢菌素。實施例4:頂頭孢菌素的結構鑒定頂頭孢菌素的結構是基于它們的質譜、核磁共振譜、紅外、紫外、旋光測定和物理化學計算而確定的。光譜學數據如下頂頭孢菌素淺黃色粉末，mp206-208。C;[a]-96,2。(c0.165,CHC13);IR(film)v:3523.2,1778.8,1727.4,1698.8,1618.0,1567.3,1513.7，1468.4,1431.2,1365.8，1224.8，1011.1cm";UV(CHC13):255nm(logs=4.9);)HNMR(500MHz,CDC13)and13C(125MHz,CDC13),見表l;HR-EIMS[Mf附/z334.0690(C16H1408,calcd334.0689)。表l.頂頭孢菌素&譜、UC譜和HMBC數據(溶劑CDC13)C/Hno.(5H(mult,JinHz)_^_HMBC23.02(d，闊42.61，3,lib,123.19(d,16.0)42.61，3，lib,12382.65162.85a140.4<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例5:頂頭抱菌素抗菌活性抗菌活性實驗是采用濃度稀釋的方法，每次測定重復三次，測試病原菌有大腸桿菌(Esc/zen'cWaco/f)、熒光假單孢菌(i^'ew(iow70"as^/7M。msce"ce)、紅色毛癬菌(7Wc/iqp&;vtown/6raw)和白色念珠菌(G3wAWaa/Z/ra"),菌液濃度為105+/mL。頂頭孢菌素cephalosol起始濃度為500嗎/mL(5X二甲基亞砜DMSO)，梯度稀釋至0.9ng/mL，等量體積的菌液和測試樣品混合培養在96孔板中，細菌和真菌培養溫度分別為37'C和28°C，培養時間24h后觀察，若發現沒有菌落形成時為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。該實驗陽性對照為硫酸阿米卡星和酮康唑，頂頭孢菌素抗菌結果見表3。表3.頂頭孢菌素抗菌MIC值(ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上結果提示，頂頭孢菌素具有很強的抗菌活性，尤其是其抑制白色念珠菌強于陽性對照酮康唑，因此本發明的頂頭孢菌素有望被用于制備新型抗菌藥物。權利要求1、頂頭孢菌素，其特征是具有下述結構式2、一種權利要求1所述的頂頭孢菌素的制備方法，其特征是它包括下述步驟-步驟1.將新鮮健康的絡石內生真菌頂頭孢(C叩/w^^on'wwacremo"/iwi^^-￡(07)菌絲體塊接種到PDA培養基上，置搖床上，在140rpm、28'C條件下培養3天作為種子液；步驟2.種子液接種于固體培養基中，固體培養基組成為每瓶中含小米7.5g，麩皮7.5g，酵母膏0.5g，FeS04.7H200.01g，酒石酸鈉0.1g，谷氨酸鈉0.1g，玉米油0.1mL，蒸餾水15mL，28'C條件下發酵30天；步驟3.將歩驟2所得發酵物經混合溶劑氯仿/甲醇(體積比l:l)常溫浸提3次，料液比2:5(g/ml)，過濾低溫真空濃縮，得到黑色粗浸膏F;步驟4.將粗浸膏F溶于甲醇中，料液比7:10(g/mL)，加熱回流lh后，冷卻室溫并放入-18'C冰箱中，過夜，抽慮除去粗浸膏F中的蠟、油脂和鹽類物質，重復三次，得到浸膏Fl;步驟5.對浸膏Fl進行硅膠柱層析，依次用10倍色譜柱保留體積的氯仿、氯仿/甲醇(體積比100:1)、氯仿/甲醇(體積比100:2)、氯仿/甲醇(體積比100:4)洗脫，合并氯仿/甲醇(體積比100:4)洗脫的洗脫液，得到浸膏F2;步驟6.將浸膏F2再上硅膠柱層析分離，用氯仿/甲醇混合溶液洗脫，合并氯仿/甲醇(體積比100:2)洗脫的洗脫液，得浸膏F3;步驟7.利用葡聚糖凝膠SephadexLH-20對浸膏F3進行柱層析，洗脫溶劑為氯仿/甲醇(體積比l:l)，定量收集洗脫劑，TLC檢測含有亮藍色熒光的部分，合并洗脫劑后低溫真空除去洗脫劑，得到頂頭孢菌素。3、根據權利要求1所述的頂頭孢菌素在制備抗菌藥物中的應用。全文摘要本發明提供一種新骨架頂頭孢菌素，它具有如右結構式以及提供新骨架頂頭孢菌素的制備方法。該新骨架頂頭孢菌素具有很強的抑制大腸桿菌(Escherichiacoli)、熒光假單孢菌(Pseudomonasfluorescence)、紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)和白色念珠菌(Candidaalbican)作用，因此頂頭孢菌素可作為具有抗菌的化合物，并有望在制備相關新型藥物中得到應用。文檔編號A61P31/00GK101429202SQ20081002099公開日2009年5月13日申請日期2008年8月5日優先權日2008年8月5日發明者章華偉,謝代前,譚仁祥,陳菁蓉,黃午陽申請人:南京大學