專利名稱：Ang-2及其基因在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及Ang-2的用途，尤其涉及在制藥領域中的應用。
背景技術：
淋巴管的新生或再生是一種常見的病理改變，見于多種疾病，如慢性 淋巴水腫，組織創傷，器官移植及胂瘤生長和轉移。由于淋巴管的再生機 理至今不明，目前對于病理性淋巴管生長相關的病癥幾乎沒有治療和控制 手段。因此，闡明淋巴管的生長機理是臨床須待解決的難題。
血管生成素Angiopoietins (Ang-1和Ang-2)/Tie2是新近發現的生 長因子家族，它與VEGFs/VEGFRs家族共同調節血管的發育和再生。Tie2 受體分布在內皮細胞表面。Ang-l和Ang-2與Tie2受體酪氨酸激酶結合。 Ang-1是Tie2的激動劑， 一般情況下Ang-2是Tie2的阻抗劑，但是在某 些情況下(如VEGFs存在時)Ang2啟動血管再生，也參與新生血管的再 塑形(remodel ing )。
過去IO年來有關炎性血管生長的研究有大量的報道，包括炎癥誘導 血管生長的機理和可能的抑制手段。新近發現Ang-2在炎癥的發生中起 關鍵的催生作用，Ang-2增加血管內細胞(Blood Endothelial Cells, BECs) 對炎性因子的敏感性。與血管相鄰的淋巴管的生長與炎癥的關系卻沒有受
3到應有的關注，Ang-2在其中的作用更是空白。實際上淋巴系統參與了炎 癥發生發展的全過程，包括炎癥的啟動，水肺的消退，白細胞的游走等。 從這個意義上說，炎癥需要淋巴管生長。那些有淋巴管新生或再生等病理 改變的疾病，如慢性淋巴水腫，組織創傷以及腫瘤等都伴有不同程度的炎 癥。臨床上淋巴管擴張型淋巴水腫肢體多伴有頻發的組織感染，病程發展 快,致殘類高。炎癥通過何種機制誘導或激發淋巴管生長還不清楚。

發明內容
本發明的目的在于
(1) 提供Ang-2在制備治療或預防體內外炎性淋巴管生長疾病藥 物中的應用。
(2) 提供Ang-2基因在制備治療或預防體內外炎性淋巴管生長疾 病藥物中的應用。
(3) 提供Ang-2在制備治療或預防機體淋巴管及周圍組織炎癥疾 病藥物中的應用。
(4) 提供Ang-2基因在制備治療或預防機體淋巴管及周圍組織炎 癥疾病藥物中的應用。
本發明的目的是通過以下技術方法來實現的對慢性肢體淋巴水肺組 織作相關基因的檢測，發現在淋巴管增生型病變組織中Ang-2的mRNA異 常增高，原位雜交顯示Ang-2轉錄子在擴張淋巴管管腔表面大量表達。但 是Ang-l的表達則與正常組織無差異。Ang-2對病變組織中淋巴管的增生起作用，引發或促進了淋巴管的增生和擴張。
用人皮膚毛細淋巴管內皮細胞(LECs )和淋巴管缺損動物模型進行實 驗,發現Ang-2單獨作用時對LEC的增殖和體內淋巴管的生長并沒有直接 促進作用。Ang-2對淋巴管生長的影響是間接的，或者還有其他因素介入。
淋巴管擴張性病變與Ang-2的表達增高和組織中的炎癥之間可能存 在關聯，并用實驗進行驗證。結果如下細胞增殖實驗我們先單用炎性 因子處理人皮膚LECs和BECs，結果BECs的顯著增殖，LECs的生長卻受 到明顯抑制。隨之我們將Ang-2重組蛋白與炎性因子共同加入處理液，得 到結果LECs的增殖不僅未受抑制，反而顯著提高，而BECs的增長卻受 到抑制。以VEGF-C為對照的結果顯示，VEGF-C單獨使用時對LEC和BEC 的增殖均有明顯的促進，但是VEGF-C與炎性因子聯合使用則沒有增殖作 用。細胞遷移試驗Ang2單獨作用時對LECs遷移其沒有直接促進作用. 在炎性因子(TNFoc )介導下Ang2能夠促進LECs的遷移，VEGF-C對LECs 和BECs有明顯的促進遷移作用，而Ang2對其沒有直接促進遷移作用。在 炎性因子(TNFa )介導下Ang2促進LECs毛細管的形成的數量和速度。 體內研究發現在炎性因子存在時，Ang2基因能促i^j部淋巴管生長，數 目增多并擴張。
關于Ang-2及其基因在制藥中的應用技術方案如下 Ang-2在制備治療或預防體內外炎性淋巴管生長疾病藥物中的應 用。所述的疾病是淋巴水腫或腫瘤淋巴道轉移或器官移植后的排斥性疾 病。Ang-2基因在制備治療或預防體內外炎性淋巴管生長疾病藥物中的應 用。所述的疾病是淋巴水肺或肺瘤淋巴道轉移或器官移植后的排斥性疾病。Ang-2在制備治療或預防機體淋巴管及周圍組織炎癥疾病藥物中的應 用。所述的疾病是淋巴循環障礙相關的感染或細菌，霉菌和其它微生物引 發的淋巴系統及周圍組織炎癥疾病。Ang-2基因在制備治療或預防機體淋 巴管及周圍組織炎癥疾病藥物中的應用。所述的疾病是淋巴循環障礙相關 的感染或細菌，霉菌和其它微生物引發的淋巴系統及周圍組織炎癥疾病。 本發明所公開Ang-2及其基因在制藥中的應用，其優點表現在
(1) 本發明對Ang-2發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。
(2) 本發明首次提出淋巴管生長不是單一因素決定，是多種因子綜 合作用的結果，VEGF-C, Ang-l和Ang-2都參與其中，但作用不同。首次 證實Ang-2與其它的生長因子(特別是VEFD-C)不同，它不是淋巴管內 皮細胞增殖和淋巴管生長的直接作用因子，而是間接的作用因子。首次證 實Ang-2能"激發"或"扭轉"LECs對炎性因子的反應，改變炎性因子 對LEC的抑制作用，轉而促其增殖。提出和驗證了 Ang-2是病理性炎性淋 巴管生長的關4定調節因子這一新論斷。
(3) 本發明中淋巴管生長是常見的病理表現，與多種重大疑難疾病， 如淋巴水腫，腫瘤淋巴道轉移，器官移植等密切相關，因此探明和調控淋 巴管的生長對于治療淋巴循環障礙疾病，減少肺瘤死亡率，降低器官移植 的排斥等重大醫學課題均有不可估量的影響。Ang-2作為病理性淋巴生長 的重要調控因子在淋巴管生長相關疾病的發生和發展中起關鍵的調節作 用。根據此理論，用任何手段(抗體，拮抗劑，短鏈RM，多肽制劑等) 降低或抑制Ang-2的表ii/人而達到減輕或控制由淋巴循環障礙相關的感
6染或細菌，霉菌和其它微生物引發的淋巴系統及周圍組織炎癥；控制和調 節與炎癥相關的淋巴管生長，如淋巴水腫，腫瘤淋巴道轉移，器官移植后 的排斥；治療淋巴管缺損性病變，促進淋巴管生長，減輕或消除淋巴性水 肺。因此，其社會效益和經濟效益是巨大的。


圖1顯示RT-PCR檢測淋巴管擴張型肢體淋巴水胂皮膚病理組織和 正常人皮膚組織中Ang2和VEGF-C的表達。淋巴管擴張型肢體淋巴水胂 皮膚病理組織中Ang2和VEGF-C的表達較正常人皮膚組織明顯增高，統計 學檢驗有顯著差異(* p<0. 05 )。
圖2顯示Western Blot檢測人皮膚組織中Ang2和VEGF-C蛋白的 表達。淋巴管擴張型病人的病變皮膚組織表達Ang2和VEGF-C較正常人下 肢皮膚組織明顯增高。1, 2:淋巴管擴張型病人的病變皮膚組織；3, 4: 正常人下肢皮膚組織。
圖3顯示細胞增殖實驗(MTT)顯示不同的因子對LECs的增殖具 有不同的作用。其中FGF、 VEGFs和PDGFbb具有顯著的促LECs增殖作用， 而缺氧條件和Ang2對LECs沒有促增殖作用。
圖4顯示小鼠尾部慢性阻塞性淋巴水肺模型手術方法建立。
圖5顯示轉基因治療鼠尾淋巴水腫后質粒注射部位皮膚組織免疫 組化結果。各個實驗小鼠尾部的質粒注射部位皮膚組織切片后進行免疫組 化染色，以淋巴管內皮細胞特異性標志LYVE-1來標記淋巴管。A， B， C, D, E (x100)分別4、表生理鹽水組、轉EGFP組、轉VEGF-C組、轉Ang2組和Ang2+VEGF-C共轉組。轉VEGF-C組和Ang2+VEGF-C共轉組的切片中 淋巴管的數目較陰性對照組明顯增加，而且還可以觀察到為數不少的細小 新生淋巴管，有些新生的淋巴管在高倍顯孩t鏡-見野下呈現單細胞結構(F， x400 )。轉Ang2組的組織切片中淋巴管的數目與陰性對照組無明顯差別， 也觀察不到新生的細小淋巴管。G顯示了不同基因治療對緩解尾部水腫效 果的差別。
圖6顯示轉基因治療鼠尾淋巴水腫后尾部皮膚組織切片中淋巴管 計數的結果。轉Ang2組與陰性對照組無顯著差別，轉VEGF-C組和 Ang2+VEGF-C共轉組的鼠尾皮膚組織切片中淋巴管的數目較陰性對照組 明顯增多，統計學4企-瞼有顯著差別(n=3， *p<0. 05 )。
圖7顯示Ang-2對LEC和BEC的增殖均無促進作用；炎性因子抑制 LEC生長，促進BEC生長；Ang-2與炎性因子共同作用明顯促進LECs增殖， 對BECs生g作用不明顯。(n>6, *p<0. 05)。
圖8顯示Ang2能夠在炎性因子(TNFct )介導下促進LECs的遷移， VEGF-C對LECs和BECs有明顯的促進遷移作用，而Ang2對其沒有直接促 進遷移作用。(n=5， **)。
圖9顯示棵鼠注射及電穿孔電極安置。
圖10顯示EGFP - pcDNA3. 1質粒注射2W。
圖11顯示淋巴管LYVE1 - DAB顯色(2W取材)A為EGFP質粒對照 組；C為單純Ang2質粒注射組；Ang2和炎性因子(TNFa )作用下淋巴管 數目和管徑增大(B ); D為TNF a單純注射組。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述。 實施例1
對慢性肢體淋巴水腫組織作相關基因的檢測 材料和方法
1.人慢性淋巴水肺組織中Ang-2mRNA和蛋白質的表達 (1) Ang-2mRNA提取和檢測方法采取人慢性淋巴水腫下肢皮膚組織約 50毫克，加入Trizollml, 4。C下剪碎，勻漿機研磨，收集液體至1. 5ml 離心管中。加入氯仿400jul，充分混勻，離心；加入等體積的異丙醇， 離心后加入含O. Ol仰EPC的75。/。乙醇lml洗滌，離心，棄上清，濾紙吸干 管口，室溫風干5分鐘后，加入0. 01°/。DEPC水20ju 1溶解RNA;核酸分析 儀檢測OD^/OD28。比值，確定濃度和純度。 -逆轉錄反應(RT ):'
配制20jdl反應體系25mM MgCh 4ju 1, 10 x逆轉錄緩沖液2 jn 1 ， lOmM dNTP 2 |i 1， 40U/ ju 1 RNase抑制劑0. 5 |a 1, 5U/ ja 1 AMV逆轉錄酶 lpl, 200ng/|i 1 01 igo dT-Adaptor Primer 1 ju 1，隨2jng，力口無RNase 水至20iul。反應條件為30°C 10分鐘，42°C 60分鐘，99°C 5分鐘，5 °C 5分鐘。反應產物cDNA置-2(TC保存。 -聚合絲式反應(PCR):
PCR反應體系為ddH20 12. 25 jlU, 25mM MgCl2 1. 6 ja 1， lOx逆轉錄 緩沖液2 1， lOmM dNTP 0. 5 |u 1， 5U/ ja 1 Taq酶0. 25 m 1，細胞RT反應產物2. 5 jli 1， 20pmol/|i 1人Ang2或人VEGF-C特異的上下游引物
Ang2: sence: 5' -GCCAGCAACACTACCACA-3 ' antisence: 5'
-ACATTCACAGGCACATTTT-3' (400bp);
VEGF-C: sence: 5' -TAAACATCCCAGTCCACC-3' antisence: 5'
-TCTTGCTTTGGTCCGTTA-3，(250bp).]各0. 3 y 1。 20pmol/jLil人p-actin
上下游引物各O. 15|a 1。反應條件為95°C 4min變性；95°C 30s、55。C(人
Ang2)或58°C (人VEGF-C ) 30s、 72°C 30s為一個循環，共35個循環；
72。C延伸lOmin。
-Western blot才企觀'J (1 )樣品制備
分別取肢體淋巴水腫病人皮膚組織2例和正常肢體皮膚組織2例各 lOOmg,剪碎置三去污劑裂解緩沖液，冰箱內澎潤過夜，lO，OOOg勻漿1 分鐘x2-5次，10, 000gx5分鐘，4。C離心，取上清液，并加入等體積2 x SDS Loading buffer, P -石克基乙醇2ul (100 |a 1) ， 100。C沸水浴變性10 分鐘，瞬時離心2秒鐘，冷至室溫。 (2)電泳和轉膜
用8%分離膠,配方是30%: 0. 8% ( AA: Bis ) 2ml; 4xTris HC1 pH8. 8 1.9ml; ddH20 3.5ml; 10°Mp50|al; TEMED10jul，約20-30分鐘凝固后 再輕輕洗上一層4°/。積存膠:30%: 0. 8%( AA: Bis )0. 7ml， 4xTris -HC1 pH6. 8 1.25ml; dd H20 3 ml; 10%Ap25|ul; TEMED 5ul。每孔加入樣品液40 p 1 ， 空白孑L力口入1 x SDS Loading buffer。 10mA電流/塊膠，電泳3-4小時 電泳結束，卸下凝膠，放在saram保險膜上，置轉移緩沖液(25mM Tris堿，192mM甘氨酸和20y。曱醇)中。同步按尺寸大小剪好濾紙，硝酸纖維素 膜一并浸入轉移緩沖液平衡15分鐘。將轉膜儀置轉移槽內，槽內倒入轉 移緩沖液，靠負極白色槽內加入冷卻冰塊、蓋實，90V電壓，4。C轉移2 小時。
(3) 雜交
轉移膜置10ml Blocking buffer 4。C封閉過夜。用Blocking buffer 稀釋一抗(兔抗人Ang2 1:200,兔抗人VEGF-C 1: 500 )置冰浴中備用， 棄去Blocking封閉液，倒入一抗液37。C雜交2小時，用washing buffer 清洗三次，每次10ml， 37。C輕搖5分鐘。用Bloking buffer稀釋生物素 化二抗(1:10000 )， 一抗雜交洗滌完畢后加入二抗雜交液，37。C搖床，溫 和4展蕩1小時。二抗雜交結束，棄去雜交液，用washing buffer洗三次， 每次10ml， 37。C輕搖5分鐘。用Blocking buffer稀釋三抗(1:20000 ), 置冰浴中備用(三抗液為Avidx-Ap液)。二抗雜交洗滌后，加入Avidx-Ap 三抗液，37。C搖床，溫和振蕩40分鐘，再用washing buffer洗滌3-5 次，每次20ml， 37。C搖床，溫和振蕩5-10分鐘。
(4) 顯色
NBT/BCIP顯色液避光顯色5min，充分水洗后掃描、采用天能凝膠處 理軟件分析平均灰度比值。 結果
慢性肢體淋巴水腫淋巴管增生型病變組織中Ang-2的mRNA異常增高 (圖l)。 VEGF-C ( vascular endothelial cell growth factor 口C) 的 表達也比正常組織高。但是Ang-1的表達則與正常組織無差異。Ang-2蛋
ii白質在淋巴管擴張性淋巴水肺組織中的表達也明顯高于對照組(圖2)。 Ang-2對病變組織中淋巴管的增生起作用，引發或促進了淋巴管的增生和 擴張。 實施例2
人皮膚毛細淋巴管內皮細月包(lymphatic endothelial cells LECs ) 和淋巴管缺損動物模型實驗 材料和方法
1. 人皮膚毛細淋巴管內皮細胞(ly即hatic endothelial cells LECs ) 的分離培養
LECs取自幼兒包皮環切術的皮膚。具體方法將包皮環切術后的幼 兒包皮剪成2 x 10mm2長條狀，以2. 4u/ml Dispase于4。C冷消化過夜，揭 去表皮。將真皮剪成1 x 2mi^大小后置50ml離心管中，加0. 1°/。膠原酶(用 無血清DMEM培養基配制)于37。C震蕩消化2-3小時。消化結束后細胞懸 液以400目金屬濾網過濾，1500rpm離心5分鐘，棄去上清，收集細胞。 通過免疫磁珠CD34抗體陰性分選和CD31抗體的陽性分選得到LECs,接 種于用纖維粘連蛋白鋪底的六孔板中，置37。C， 5%0)2條件下培養。LECs 原代細胞用含10ng/ml VEGF的完全內皮細胞培養基于5%C02、飽和濕度、 37。C恒溫孵育，不加抗生素。細胞每5-6天換液一次。細胞生長到90%融 合后，0. 05%的胰蛋白酶消化，1: 2傳代，傳代后的細胞用不含VEGF的 完全內皮細胞培養基培養。
2. LECs細胞增殖實-險
LECs接種于細胞培養池中培養，接種數量5xl()4個，置37。C， 5%C02條件下培養48小時后MTT法測定細胞增殖情況。檢測時，將細胞培養池 移至新的6孔板中，每孔加入含2%血清的EBM 2ml以及MTT溶液(5mg/ml ) 200 nl, 37。C繼續孵育4小時后終止培養，吸去孔內培養上清液。每孔加 入1.5mlDMS0，振蕩IO分鐘，使結晶物充分溶解。每孔吸取200 jli 1液體 移至96孔板中，選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收 值，記錄結果。不同標本來源的細胞重復實驗3次，每次每組重復3孔。
3. 淋巴管缺損動物模型的制備和實驗 取5周齡的雌性Balb/c小鼠，稱重后以速眠新肌肉注射麻醉，尾部
75%酒精消毒，測量距尾跟部2cm處尾巴直徑。在距尾跟部lcm處環行切 除尾巴皮膚約3腿，同時將深筋膜去除。于尾尖皮內注射用生理鹽水l: 5 稀釋的亞曱基蘭注射液0. lml，觀察皮膚切除部位與兩側尾部血管伴行的 淋巴管顯色。將顯露的淋巴管切除，斷端與創緣皮膚均進行燒灼以防止淋 巴管再通。手術創口凡士林紗布包扎，定期觀察愈合情況以及尾部水腫情 況，待創口愈合后再次測量距尾跟部2cm處尾巴直徑。
4. 質粒局部注射治療小鼠尾^^巴水腫
(1)構建Ang2和VEGF-C以及綠色熒光蛋白目的基因 pCDNA3. 1 (+) -EGFP質粒的構建和制備 1目的基因的亞克隆
用Not I 、 HindIII雙酶切帶有人EGFP基因的pEC質粒(上海市組織 工程研究所提供)，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得2. 3kb大小的 EGFP目的基因片段。同樣用Not I 、 HindlII雙酶切pcDNA3. l質粒(購于 Invitrogen公司，美國)，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，收獲約5. 4Kb
13大小的pcDNA3. 1質粒載體片段。在紫外燈下切取目的基因和pcDNA3. 1 栽體片段，將凝膠塊置于2. Oml塑料離心管中，稱重(每100mg膠約相當 于100 jli 1體積)，以DNA凝膠回收試劑盒進4于回收純化加入3倍體積的 QG， 50。C水浴10min;待凝膠充分溶解后加入等體積異丙醇，混勻。將液 體倒入QIAquick吸附柱中，10000rpm室溫離心lmin;棄去廢液，加入 500jLilQG, 10000rpm離心lmin;棄去廢液，加入750 y 1 PE,靜置5 min， 再離心lmin。將吸附柱》文入清潔無菌的1.5ml離心管中，在柱中央加入 20jul EB;靜置5 min后，10000rpm離心lmin;收集離心液，核酸分析 儀測OD26。/OD28。比值。按照載體與待擴增DNA片斷的摩爾比為1: 4設計 10 |i 1連接體系4 ja 1目的DNA片斷，1 M 1 pcDNA3. 1載體，1 ju 1 T4DNA 連接酶，liallOx緩沖液，3jLil無菌去離子水。混勻后，室溫連接2hrs, -20。C保存備用 2感受態細菌的制備
平板上DH5oc新鮮菌落接種至5ml LB培養基中，37°C、 300rpm振蕩 過夜。取過夜菌液20p 1至5ml LB培養基中，37°C、 300rpm振蕩培養至 對數生長期(約3-4hrs)。取lml菌液，冰浴10min; 4。C、4000g離心10min， 棄上清；加入500jli1預冷10mM的CaCl2重懸細菌，冰浴20min; 4"C、 4000g離心10min，棄上清；100 ju 1預冷lOmM的CaCl2重懸細菌；4。C冰 箱中放置18 hrs后使用，或-20。C保存備用。 3連接產物的轉化
連接產物3 p 1加入100 ju 1感受態細菌中，混勻，水浴30 min; 42 。C水浴熱休克1. 5min,冰浴30min;加SOC培養基900jul， 37°C、 300rpm振蕩lh;取lOOp 1菌液均勻涂于含氨千青霉素100Mg/ml的LB瓊脂平 板上，稍干后，37。C正放lh，倒置培養12-16hrs。 4質粒的小量制備
從平板上挑取數個單菌落至3ml LB培養基(含氨芐青霉素100 n g/ml)中，37°C、 300rpm振蕩培養過夜。取2ml菌液，4°C、 10000rpm離 心3min,棄上清；加入250 jli 1 Pl ，徹底振勻，重懸細菌沉淀，室溫靜置 10min;加入250 |i 1預溫的P2,溫和顛倒混勻5-IO次，室溫靜置4min; 加入350 jli 1預冷的P3,溫和顛倒混勻5-10次，室溫靜置lmin; 12800rpm 離心10min，將上清液倒入另一清潔離心管中，12800rpm再離心10min; 將上清液倒入華舜吸附柱中，室溫10000rpm離心15s;倒去離出液體； 在吸附柱中加入500jli 1 Bl,同條件離心15s,倒去離出液體；加入500 plWl，靜置lmin后，離心15s，倒去離出液體；重復上一步驟一次后， 倒去離出液體，再以12000rpm室溫離心lmin;將吸附柱》文入清潔無菌的 1.5ml離心管中，在柱中央加入50ju 1 Tl;靜置5min后，10000rpm離心 lmin;收集離心液，核酸分析儀測0026。/0028。比值后，-20。C保存備用。 5酶切鑒定
取小量制備的pcDNA3. 1-EGFP重組質粒，用Not I 、 HindIII雙酶切。 酶切產物1%瓊脂糖電泳檢測，天能皿分析儀觀察。 6菌種保存
根據測序鑒定結果，將正確連4妄菌落的相應菌液850 ja 1與100%甘油 150jil徹底混勻，-80。C保存。
7 FuGENE6介導pCDNA3. 1 (+) -EGFP質粒DM轉染COS7細月包按照FuGENE6與pCDNA3. 1 (+)-EGFP質粒DNA的體積與質量比為3: 1 i殳定轉染體系。即在無血清的DMEM600 pl中加入FuGENE6 20 jul，質 粒DNA6iag。輕輕混勻，室溫靜置30分鐘后均勻滴加至上述細胞中。轉 染24小時后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。 pcDNA3. 1-Ang2的制備方法
1 Ang2 ( Genbank NM_ 001147 )基因cDNA的獲取>^皮膚成纖維細胞 提取總RNA,應用RT-PCR方法成功克隆Ang2基因cDNA。取第一代成纖維 細胞，Trizol法進行RNA抽提。25mM MgCl2 4 ju 1， 10 x逆轉錄緩沖液2 y 1, 10mM dNTP 2 jn 1， 40U/ /a 1 RNase 4中制劑0. 5 |a 1, 5U/ ju 1 AMV逆4爭 錄酶ljnl， 200ng/jal Oligo dT-Adaptor Primer RNA2jug,力口無
RNase水至20ju 1。反應條件為30°C IO分鐘，42°C 60分鐘，99°C 5分 鐘，5°C 5分鐘。聚合酶鏈式反應(PCR):人Ang2上游引物5， -GCCAGCAACACTACCACA-3'下游引物5， -ACATTCACAGGCACATTTT-3，；人 P-actin上游引物5， - ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3，；下游引物5，-CATCTCTTG CTCGAAGTCCA-3， 。 PCR反應體系為:ddH20 13. 2pl， 25mMMgCl2 1.6 Ml, 10x逆轉錄緩沖液2p 1， lOmM dNTP 0.5 jul, 5U/p 1 Taq酶0. 5jal， cDNA1.0ial， 20pmol/pl目的基因上下游引物各0. 3 1.反應條件 為95。C變性5分鐘；95。C30秒、55。C30秒、72°C30秒為一個循環，共 35個循環；72。C延伸10分鐘。電泳、圖象分析PCR產物10 p 1經1. 2% 瓊脂糖，70V電壓電泳1.5小時后，進4亍圖象分析。 2克隆目的基因選用的pcDNA3.1 (+)質粒載體(購于Invitrogen 7> 司，美國)為一種真核高校表達載體。將目的基因應用EcoRl酶切，酶切產物經ly。瓊脂糖凝皎電泳后，獲得2. 3kb大小的Ang2目的基因片段。同 樣用EcoR I酶切pcDNA3. 1質粒(受體)，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳 后，收獲約5.4Kb大小的pcDNA3. l質粒栽體片段。在紫外燈下切取目的 基因和pcDNA3. 1載體片段，將凝膠塊置于2. Oml塑料離心管中，稱重(每 100mg膠約相當于100 m 1體積)，以dna凝月交回收試劑盒進行回收純化 加入3倍體積的QG， 50。C水浴10min;待凝膠充分溶解后加入等體積異丙 醇，混勻。將液體倒入QIAquick吸附柱中，10000rpm室溫離心lmin;棄 去廢液，加入500ju 1 QG, 10000rpm離心lmin;棄去廢液，加入750 jli 1 PE， 靜置5min，再離心lmin。將吸附柱》t7v清潔無菌的1. 5ml離心管中，在 柱中央加入20ja 1 EB;靜置5min后，10000rpm離心lmin;收集離心液， 核酸分析儀測OD26。/OD28。比值。按照栽體與待擴增DNA片斷的摩爾比為1: 4 i殳計10 m 1連4妄體系4 )i 1目的DNA片斷，1 ja 1 pcDNA3. 1載體，1 m 1 T4DNA連接酶，ljLil 10x緩沖液，3jlU無菌去離子水。混勻后，室溫連 接2hrs, -2(TC保存備用 3感受態細菌的制備
平板上DH5ot新鮮菌落接種至5ml LB培養基中，37°C、 300rpm振蕩 過夜。取過夜菌液20ia 1至5ml LB培養基中，37°C、 300rpm振蕩培養至 對凄t生長期(約3-4hrs)。取lml菌液，冰浴10min; 4。C、4000g離心10min， 棄上清；加入500jnl預冷10mM的CaCl2重懸細菌，水浴20min; 4°C、 4000g離心10min，棄上清；100 ju 1預冷lOmM的CaCl2重懸細菌；4。C冰 箱中放置18 hrs后使用，或-20。C保存備用。 4連接產物的轉化
17連接產物3m 1加入100m 1感受態細菌中，混勻，冰浴30 min; 42 。C水浴熱休克1. 5min，冰浴30min;加SOC培養基9Q0|li1, 37°C、 300rpm 振蕩lh;取100 jil菌液均勻涂于含氨爺青霉素lOOjjg/ml的LB瓊脂平 板上，稍干后，37。C正放lh，倒置培養12-16hrs。 5質粒的小量制備
從平板上挑取數個單菌落至3ml LB培養基(含氨芐青霉素100 ju g/ml)中，37°C、 300rpm振蕩培養過夜。取2ml菌液，4°C、 10000rpm離 心3min,棄上清；加入250julPl，徹底振勻，重懸細菌沉淀，室溫靜置 10min;加入250 p 1預溫的P2,溫和顛倒混勻5-10次，室溫靜置4min; 加入350 ia 1預冷的P3,溫和顛倒混勻5-10次，室溫靜置lmin; 12800rpm 離心10min,將上清液倒入另一清潔離心管中，12800rpm再離心10min; 將上清液倒入華舜吸附柱中，室溫10000rpm離心15s;倒去離出液體； 在吸附柱中加入500 m1 Bl，同條件離心15s，倒去離出液體；加入500 julWl，靜置lmin后，離心15s,倒去離出液體；重復上一步驟一次后， 倒去離出液體，再以12000rpm室溫離心lmin;將吸附柱》文入清潔無菌的 1.5ml離心管中，在柱中央加入50|u 1 Tl;靜置5min后，10000rpm離心 lmin;收集離心液，核酸分析儀測OD26。/OD28。比值后，-20。C保存備用。 6酶切和測序鑒定
取小量制備的pcDNA3. l-Ang2重組質粒，用HindIII單酶切。酶切產 物1%瓊脂糖電泳4企測，天能凝膠分析儀觀察。將酶切鑒定正確的質粒送 上海生工生物工程7>司測序。 7菌種保存根據測序鑒定結果，將正確連接菌落的相應菌液850ju 1與100%甘油 150 y 1徹底混勻，-8(TCM呆存。
8 FuGENE6介導質粒DNA轉染C0S7細胞和人皮膚成纖維細胞
質粒DNA轉染按照FuGENE6與質粒DNA的體積與質量比為3: 1設 定轉染體系。即在無血清的DMEM600 ial中加入FuGENE6 20 jul，質粒 DNA 6pg。輕輕混勻，室溫靜置30分鐘后均勻滴加至上述細胞中。其中 實-驗組加入pcDNA3. l-Ang2,對照組加入空白載體pcDNA3. 1質粒。
RT-PCR反應配制20 jn 1逆轉錄反應體系25mM MgCl2 4 jn 1 ， 10 x 逆轉錄緩沖液2 ju 1, 10mM dNTP 2 ju 1, 40U/ ju 1 RNase抑制劑0. 5 ju 1, 5U/ ju 1 AMV逆轉錄酶1 ju 1, 200ng/ m 1 Oligo dT-Adaptor Primer 1 ju 1, RNA2iig,加無RNase水至20 |a 1。反應條件為30°C 10min， 42°C 60min， 99°C 5min, 5°C 5min。反應產物cDNA置-20。C保存。PCR反應體系為 ddH20 12. 25 p 1， 25mMMgCl2 1. 6 ji 1， 10 x逆轉錄緩沖液2 |a 1 ， lOmM證P 0. 5 jLi 1 ， 5U/ |a 1 Taq酶0. 25 |i 1 ， RT反應產物2. 5 p 1 ， 20pmo1/ ja 1人Ang2 0. 3jal。 20pmol/jul人P -act in上下游引物(序列同上)各O. 15jul。 反應條件為95°C 4min變性；95°C 30s、 55。C30s、 72°C 30s為一個循環， 共35個循環；72°C延伸10min。電泳圖象分析PCR產物10 |i 1經1%瓊 脂糖，70V電壓電泳lh后，用天能凝膠系統拍照、進行圖象分析。計算 目的電泳帶灰度平均密度與內參照P-actin灰度平均密度的比值，作為 相對灰度值。
Western blot檢測分別取基因轉染組和對照組COS7細胞各2 x 106， 用4 °C的PBS洗滌2次，加入4 °C的細胞裂解液(15 OmM NaCL， l%Tr i ton-X，
1920rnM HEPES, 10%甘油，1. 5mM MgCL2， lmM EDTA, lmM PMSF， lpg/ml的 le叩印tin及ljug/ml的aprotinin)以裂解細胞，細胞裂解物置冰中 20min, 12000rpm4。C離心20min,取上清，Bradford法測定蛋白濃度，備用。 配制12%分離膠加積存膠至滿，插入1. 5mm梳聚合20分鐘后，拔梳、清 洗，濾紙吸干加樣孔。上樣，電泳每孔加入40jn 1蛋白樣品。空白孑L內 加入1 x SDS loading buffer。 15mA，電泳3hrs。轉膜電泳結束后，卸 下凝膠置于轉膜緩沖液中平衡。在轉膜儀上由負到正依次平鋪海綿、濾紙、 凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙、海綿。在轉膜儀內4。C、 90V轉膜2hrs。封 閉轉膜結束后，取出轉移膜，置15ml封閉液中封閉1小時。雜交一 抗(兔抗人Ang2 , 1: 200;鼠抗人P-actin 1: 1000 ) 4。C雜交過夜， Washing buffer 10ml 37。C搖洗5min x 3次；HRP二抗(1: 10000 ) 37 。C振搖雜交lh, Washing buffer 10ml 37。C搖洗5min x 3次。 ECL發光，照相。
基因轉染細胞上清液中目的蛋白的檢測Ang2基因轉染后6小時將 細胞培養液更換為含0. 2%BSA的無血清DMEM。每10cm培^m加5ml上述 培養液培養36小時后，收集培養液。設立未轉基因組、轉pCDNA3. 1空載 體組和陰性對照組。將各組細胞培養上清液分別加入96孔板，每孔各加 入樣品100ial，每組重復三孔，實-驗組及對照組共四組12孑L, 4。C》文置 過夜。傾去細胞培養上清液，用含0. 5%吐溫的PBS洗滌4-6次。每孔加 0. 5%BSA于37。C封閉1小時；傾去封閉液后每孔分別加入一抗(Ang2 1: 200; )50 m1, 37。c反應l小時，洗滌(同前)；加入酶標二抗工作液ioo jal， 37。C反應l小時，洗滌(同前)；加入l: 50DAB100jlU,反應5-10分鐘；加入1N硫酸終止反應，混勻。490nm處測吸光值。 pcDNA3. l-VEGF-C的制備方法
1 VEGF-C (Genbank NM— 005429 )基因c艦的獲取:
^MvA皮膚成纖維細胞提取總RNA,應用RT-PCR方法成功克隆Ang2基 因cDNA。取第一代成纖維細胞，Trizol法進行RNA抽提。25mM MgCl2 4 ju 1， 10 x逆轉錄緩沖液2 jli 1， 10mM dNTP 2 u 1， 40U/ jli 1 RNase抑制劑0. 5 5U/m 1 AMV逆專爭錄酶1 ju 1 ， 200ng/ju 1 01 igo dT—Adaptor Primer 1 jn 1， RNA2 iag，加無RNase水至20 m 1。反應條件為30°C IO分鐘，42°C 60 分鐘，99。C 5分鐘，5。C 5分鐘。聚合酶鏈式反應(PCR ): VEGF-C引物sence: 5， -TAAACATCCCAGTCCACC-3' antisence: 5， -TCTTGCTTTGGTCCGTTA-3'. 各O. 3jul。反應條件為95°C 4min變性；95°C 30s、 58。C30s、 72°C 30s 為一個循環，共35個循環；72°c延伸10min。 pcr產物10 m 1經1. 2%瓊 脂糖，70V電壓電泳1. 5小時后，用天能凝膠系統拍照、進行圖象分析。 將目的基因VEGF-C和載體pcDNA3. 1用EcoRl和Xhol雙酶切。酶切產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得1053bp大小的VEGF-C目的基因片段和5. 4Kb 大小的pcDNA3. 1質粒載體片段。
克隆目的基因、感受態細菌的制備、連接產物的轉化、陽性克隆的挑選、 質粒的小量制備、基因測序及鑒定、菌種保存、質粒的大量制備和純化等 方法均同pcDNA3. l-Ang2的制備方法。
(2 )質粒的大量制備和純化分別將pcDNA3. 1-Ang2和pcDNA3. l-VEGF-C 菌液500jii 1至1000ml LB培養基中，37°C、 300rpm振蕩12-16hrs。菌液 4°C、 6000g離心15min,棄上清；加入10mlPl，徹底振勻，重懸細菌沉淀；加入10ml P2，溫和顛倒混勻4-6次，室溫靜置5min;力口入10ml 預冷的P3，溫和混勻，冰浴20min; 4°C、 20000g離心30min,將上清液 倒入另一清潔離心管中，再離心15min;用10ml QBT濕化平衡QIAGEN-tip 500吸附柱；將上清液倒入QIAGEN吸附柱中，待其自然過柱，加入30ml QC， 清洗吸附柱2次；將吸附柱》文入一清潔無菌的離心管中，在柱中央加入 15ml QF,洗脫質粒DNA;收集滴出液體，加入0. 7倍體積的異丙醇，溫 和混勻，水浴20min; 4°C、 15000g離心30min;見淡黃色透明斑塊，棄 上清，加入5ml室溫的70。/。乙醇洗滌DNA， 15000g離心10min;小心棄上 清，室溫風干5-10min，加入200jal滅菌生理鹽水溶解DNA;核酸分析 儀測OD^/OD28。比值后，-2(TC保存備用，可取適量質粒DNA再次酶切鑒定。 (3 )小鼠尾部慢性阻塞性淋巴水腫模型可以通過手術方法建立(圖4 )。 手術中將小鼠尾跟部皮膚環行切除。在亞曱基蘭淋巴管顯色的幫助下，將 與尾部血管平行走行并顯藍色的淋巴管破壞(A，黃色箭頭指示淋巴管)。 小鼠手術后第二天即出現明顯的尾部腫脹(C),尾部直徑較術前(B)增 大。在成功制作出淋巴水肺模型的小鼠，尾部一直保持明顯的水腫，即使 術后一個月左右手術創口已經愈合(D)。將正常鼠尾皮膚切片(E, x40) 與淋巴水肺鼠尾皮膚切片(F， x40)進行比較可以看到后者較前者明顯 增厚。將20個已經造成尾部慢性阻塞性淋巴水肺的小鼠隨機分為五組， 即生理鹽水組、EGFP組、VEGF-C組、Ang2組和Ang2+VEGF-C組，每組4 個，測量并統計各組間鼠尾直徑無顯著差異。以上各組分別于鼠尾原手術 部位及手術部位遠側端皮內注射0. lml生理鹽水、pCDNA3. l-EGFP 100pg、 pcDNA3. 1- VEGF-C 100pg、 pcDNA3. 1- Ang2 100pg和pcDNA3. l-Ang2
22100|ig+pcDNA3. 1-VEGF-C 100卩g。注射時以上質粒均溶解于0. 1ml生理鹽 水中。注射進行三次，每次間隔五天，于第一次注射后兩周進行各種檢觀'J。 結果
1. Ang2質粒對LECs體外增殖沒有直接的促進作用 我們用多種與內皮細胞增殖相關的細胞因子和低氧條件對LECs進行刺 激，然后以MTT法測定細胞的增殖情況。對照組的吸光度值為1.063 ±
0. 024,與預期結果一致，FGF ( 1.765 ±0.102), VEGF ( 1. 637 ± 0. 058 ) 和特異作用于^^巴管內皮細; 包的VEGF-C ( 1. 573 ± 0. 093 )對細胞的促增 殖作用十分明顯(p<0. 01), PDGF-bb (1. 185 ± 0. 079 )也具有促進增殖的 作用(p<0. 05)。但是，雖然Ang2與淋巴管發育和新生相關，但是在體外 Ang2 (1. 067 ± 0. 060)未顯示對該細胞有促進增殖的作用(圖3 )。
2. Ang2質粒對實驗性淋巴水腫沒有明顯的治療作用
Ang2質粒注射對實驗性淋巴水肺的水腫消除和淋巴管的生長沒有明 顯的促進作用(圖5， 6)。
總之，Ang-2單獨作用時對LEC的增殖和體內淋巴管的生長并沒有直 接促進作用。Ang-2對淋巴管生長的影響是間接的，或者還有其他因素介 入。
實施例3
淋巴管擴張性病變與Ang-2的表達增高和組織中的炎癥之間關聯實驗
1. LECs細胞增殖實一驗LECs和BECs的分離和培養方法同前述。應用同 一批次包皮分離或凍存的同代LECs和BECs，傳至3代可用于細胞增殖及 遷移實-瞼。我們先單用炎性因子(IL-1 ct, IL-P ， IL-6, TNFoc， LPS(Cytolab)與細胞共培養，觀察各自對細胞增殖的作用，然后加入Ang2 (R&D)或VEGF-C (R&D),再檢測細胞的變化。具體方法氮標記細 胞增殖實驗-胞消化，96孔板，細胞量2000個/孔，接種4小時(貼壁) 后，換含1。/。BSA的EGM2培養液同時加細胞因子，劑量Ang2 ( 200ng/ml), VEGF - C ( 100ng/ml ), IL-1 cc (lng/ml) ， IL- P (lng/ml) ， IL - 6 (lng/ml)， TNFct (25ng/ml)， LPS (100ng/ml )。作用32小時加氖，16小時收氖，測 量統計。
結果單用炎性因子BECs的顯著增殖，LECs的生長卻受到明顯抑制。 但是將Ang-2重組蛋白與炎性因子共同加入處理液后，得到有趣的結果 LECs的增殖不僅未受抑制，反而顯著提高，而BECs的增長卻受到抑制(見 圖7)。以VEGF-C為對照的結果顯示，VEGF-C單獨使用時對LEC和BEC 的增殖均有明顯的促進，但是VEGF-C與炎性因子聯合使用則沒有增殖作 用。
2. 細胞遷移試驗
將LECs和BECs種植于6孔細胞培養;f反S己套的8jim孔徑細胞培養池 (Becton Dickinson, USA)，加入含有炎性因子(TNF a )的培養液，置37 °C， 5。/。C02條件下培養16小時后取出細胞培養池行Giemsa染色PBS浸 洗細胞培養池l分鐘x3次，曱醇固定20分鐘，自然干燥。用Giemsa染 液染色10分鐘，蒸餾水浸洗。在相差顯微鏡下每個細胞培養池隨機選取 5個高倍視野計數膜上、下的細胞，以遷移到膜下的細胞數除以膜上下細 胞總數計算細胞的遷移率。不同標本來源的細胞重復實-驗3次。
結果Ang2單獨作用時對LECs遷移其沒有直接促進作用.在炎性因子(TNF oc )介導下Ang2能夠促進LECs的遷移，VEGF-C對LECs和BECs 有明顯的促進遷移作用，而Ang2對其沒有直接促進遷移作用(圖8) 3. Ang-2對體內炎性淋巴管生長的影響 材泮牛和方法(1 )BALB/cA -nude棵小鼠，4 ~ 6周齡8只，雌雄兼用，體重17 ~ 25 g, SPF 條件下飼養；兔抗鼠 Lymphatic Vessel Endothelial hyaluronan receptor-1 ( LYVE-1 ， AngioBio); Streptoavidin-HRP第二抗體(EnVision, DAK0);帶Ang2基因、VEGF - C基因、EGFP基因的pcDNA3. 1 質粒載體(酶切鑒定同前)；質粒小量抽提純化試劑盒(上海華舜公司)； 質粒大量抽提試劑盒(QIAGEN Inc.);電穿孔4義(ECM830 )(圖9)。(2) 自耳根部皮膚向耳緣方向進針，皮內注射0.1ml生理鹽水、 pCDNA3. 1-EGFP lOOpg、 pcDNA3. 1-VEGF-C lOOpg, pcDNA3. 1-Ang2 lOOpg 和pcDM3. 1-Ang2 100vig+LPS50ng/TNF a 25ng。注射時以上質粒均溶解于 0. lml生理鹽水中。電穿孔^f義電壓100mv，頻率20ms。隨即分組，自身對 照，兩周取材。(3) 耳皮膚淋巴管染色及計數創美圖像分析軟件進行計數 結果1電穿孔儀電壓及頻率參數的設定及質粒有效表達 以EGFP - pcDNA3. 1質粒檢測目的基因在棵鼠耳皮膚的表達，尋求最佳質 粒表達的電壓和頻率，本實驗參照大鼠皮膚參數進行了適當的調整，得出 電穿孔儀最佳參數為電壓100mv，頻率為20ms。不至于燒壞皮膚及獲得 EGFP基因在體內有效的表達(2W)(圖10)。2淋巴管染色及計數通過淋巴管免疫組織化學染色可以直觀看到Ang2基因在炎性環境中淋巴 管增粗和數目增多的改變(圖ll)。體內實驗的結果表明在炎性因子(TNFct )介導下Ang2促進LECs毛細管 的形成的數量和速度。Ang2基因能促進局部淋巴管生長，數目增多并擴 張。
權利要求
1、Ang-2在制備治療或預防體內外炎性淋巴管生長疾病藥物中的應用。
2、 根據權利要求1所述的應用，所述的疾病是淋巴水腫或胂瘤淋巴道 轉移或器官移植后的排斥性疾病。
3 、 Ang-2基因在制備治療或預防體內外炎性淋巴管生長疾病藥物中的應用。
4、 根據權利要求3所述的應用，所述的疾病是淋巴水肺或腫瘤淋巴道 轉移或器官移植后的排斥性疾病。
5、 Ang-2在制備治療或預防機體淋巴管及周圍組織炎癥疾病藥物中的應用。
6、 根據權利要求5所述的應用，所述的疾病是淋巴循環障礙相關的感 染或細菌，霉菌和其它微生物引發的淋巴系統及周圍組織炎癥疾病。
7、 Ang-2基因在制備治療或預防機體淋巴管及周圍組織炎癥疾病藥物中 的應用。
8、 根據權利要求7所述的應用，所述的疾病是淋巴循環障礙相關的感 染或細菌，霉菌和其它微生物引發的淋巴系統及周圍組織炎癥疾病。
全文摘要
本發明涉及Ang-2的用途，尤其涉及在制藥領域中的應用。本發明技術方案如下Ang-2及其基因在制備治療或預防體內外炎性淋巴管生長疾病藥物中的應用。Ang-2及其基因在制備治療或預防機體淋巴管及周圍組織炎癥疾病藥物中的應用。該發明的優點表現在對Ang-2及其基因發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。
文檔編號A61P31/00GK101518644SQ20081003389
公開日2009年9月2日 申請日期2008年2月26日 優先權日2008年2月26日
發明者劉寧飛, 胡學慶, 蔣朝華 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院