專利名稱：一種小干擾rna在制備治療大腸癌的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種治療腫瘤的藥物，特別是一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用。

背景技術：
隨著人們生活水平的提高和飲食結構的變化，大腸癌在我國的發病率呈增高趨勢，因此，探索有效的大腸癌防治策略是關乎國民健康的重要課題。但由于大腸癌發生發展的機制尚不明確，故缺乏有效的防治靶點及手段。尤其是中晚期大腸癌，其治療手段只能以化療為主，療效以及患者預后均較差。
哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)介導的信號通路是與細胞增殖和凋亡最密切相關的通路之一，因其處于生長調節的中心環節而倍受關注。新近研究表明，肺癌、腎癌、乳腺癌和白血病等多種腫瘤均存在mTOR信號通路的過度激活；在肝癌、胰腺癌等消化系腫瘤中亦存在mTOR的高表達和持續活化；I期和II期臨床研究顯示，雷帕霉素的衍生物如CCI-779(Temsirolimus)、RAD001(Everolimus)以及AP23573等對晚期腎細胞癌及乳腺癌具有一定的抑制作用。但是目前關于mTOR信號通路與大腸癌發生發展的關系尚無文獻報道，抑制mTOR信號通路是否可以防治大腸癌尚不知曉。
近十年來生物學最重要的進展莫過于RNA干擾(RNAi)現象的發現。已有研究表明，應用RNAi技術能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，產生類似基因敲除的效應。作為HIV相關淋巴瘤、AMD(age relatedmacular degeneration)等人類疾病的可能治療手段，RNAi相關研究已進入I期和II期臨床試驗。這無疑也為實體腫瘤的治療開辟了新途徑。目前，腫瘤治療領域的RNAi研究蓬勃開展，其中為數甚眾者將與腫瘤發生發展密切相關的信號轉導通路中的各級分子作為靜默靶點的候選。
哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)基因，GeneID 2475，NM_004958，定位于染色體1p36.2，編碼蛋白質分子量為289kDa，為不典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于PIKK家族(PtdIns3K-related kinase family)。
RNA干擾技術(RNAi)是把與內源mRNA編碼區同源的小片段外源雙鏈RNA導入細胞中，導致特定基因沉默的一種技術。siRNA是RNAi的關鍵效應分子，是長度為21-23nt的雙鏈RNA。


發明內容
本發明的目的在于提供一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，所述的這種小干擾RNA要解決現有技術中采用化療來治療中晚期大腸癌，其療效以及患者預后均較差的技術問題。
本發明提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，所述的小干擾RNA正義鏈的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述的小干擾RNA反義鏈的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO2所示。
本發明還提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO3所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO4所示。
本發明還提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO5所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO6所示。
本發明還提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO7所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO8所示。
本發明使用了針對mTOR基因的4對siRNA片段，由美國Dharmacon公司合成(Pre-designed RNAi Reagents，Dharmacon，USA)，堿基序列及分子量如下表所示。經實驗證實均為有效序列，均可抑制mTOR基因及蛋白表達，其中以siRNA3的作用最為顯著。
mTOR siRNA1-4寡核苷酸序列及分子量
siRNA3分子量為13,373(g/mole)，為凍干粉劑，保存于-20℃，用前以DEPC水溶解。正義鏈(Nucleotide-3-S)21個堿基是19個堿基的mTOR基因靶序列加上3’端2個堿基的懸頭UU，反義鏈(Nucleotide-3-A)21個堿基完全與mTOR基因靶序列互補。在體內研究部分，上述序列由上海吉瑪公司(Shanghai GenePharma Co.，Ltd)進行2’甲氧修飾以增加穩定性，并化學合成(在ISO9000質量標準下生產；HPLC純化；全長雙鏈siRNA含量＞97％)。
siRNA轉染入細胞后，即啟動RNAi效應階段。siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶(包括內切酶、外切酶、解旋酶等)結合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區進行特異性結合，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)，新合成的dsRNA再由胞質中的核酸內切酶(Dicer)切割產生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。
本發明和已有技術相比，其效果是積極和明顯的。本發明能夠抑制大腸癌細胞增殖活力，阻滯大腸癌細胞生長周期，誘導大腸癌細胞凋亡，下調大腸癌mTOR/p70s6K/4EBP1信號通路的活性，對裸鼠大腸癌移植瘤具有治療作用。



圖1顯示了應用RNAi靜默mTOR基因及蛋白表達的圖，其中，圖1A是應用脂質體法瞬時轉染人大腸癌HCT116細胞系，轉染48h后應用Taqmen Real-Time PCR檢測mTOR基因表達的圖，圖1B是應用脂質體法瞬時轉染人大腸癌HCT116細胞系，轉染48h后應用Western blot技術檢測mTOR蛋白表達的圖，圖1C是以GAPDH蛋白條帶密度為標準，進行Pan-mTOR及P-mTOR蛋白密度半定量的圖。
圖2顯示了mTOR基因沉默抑制下游p70S6K及4EBP1蛋白磷酸化的圖；其中，圖2A是以mTOR siRNA3(100nM)及陰性對照siRNA(100nM)轉染HCT116細胞，48h后抽提細胞總蛋白，以Western blot檢測pan-p70s6K，pho-p70s6K(Thr389)，pan-4EBP1，pho-4EBP1(Thr37/46)，以GAPDH作為內參照；圖2B是以相應總蛋白(pan-)條帶密度為標準，進行pho-p70S6K及pho-4EBP1蛋白半定量。
圖3顯示了mTOR siRNA3轉染抑制HCT116細胞活力的圖。
圖4顯示了mTOR siRNA3轉染阻滯HCT116細胞周期的圖。
圖5顯示了mTOR siRNA3轉染誘導HCT116細胞凋亡的形態學檢測及定量的圖；其中，圖5A是吖啶橙染色(Acridine Orange Staining)的結果，顯示正?；罴毎鸇NA呈綠色，RNA呈紅色，凋亡細胞呈現致密濃染的黃色增強熒光(箭頭所示)；圖5B是AnnexinV/PI雙染色的結果，顯示早期凋亡細胞呈現綠色熒光，晚期凋亡細胞膜呈綠色熒光，核呈紅色熒光；圖5C是流式細胞術檢測結果，早期凋亡細胞位于第4象限(右下)。
圖6顯示了mTOR siRNA3轉染誘導HCT116細胞PARP蛋白剪切體(89kDa)形成的圖。
圖7顯示了瘤內注射mTOR siRNA3抑制裸鼠大腸癌移植瘤生長的圖；其中，圖7A是首次瘤內注射當天及注射后第10天各組荷瘤裸鼠圖片；圖7B是以游標卡尺測算腫瘤體積，每5天一次，數據以

±SD表示(n＝6)。
圖8顯示了mTOR siRNA3轉染抑制裸鼠大腸癌移植瘤mTOR蛋白表達以及mTOR/p70S6K/4EBP1信號通路活性的圖，其中，圖8A是三組裸鼠大腸癌移植瘤(siRNA3組、陰性對照組、轉染試劑對照組)mTOR蛋白以及mTOR信號通路活性的Western blot檢測結果；圖8B是mTOR蛋白以及pho-p70S6K和pho-4EBP1的標準化半定量結果；圖8C是轉染試劑對照組(VC)mTOR信號通路活性的SABC法檢測結果；圖8D是siRNA3轉染組mTOR信號通路活性的SABC法檢測結果。
圖9顯示了瘤內注射mTOR siRNA3誘導裸鼠大腸癌移植瘤細胞凋亡的圖，其中，圖9A是SiRNA3作用組TUNEL法檢測結果；圖9B是陰性對照組(NC)及轉染試劑對照組(VC)的TUNEL法檢測結果；圖9C是各組凋亡細胞計數結果(％)，數據以

±SD表示。

具體實施例方式 實施例1體外研究 本實施例的實驗材料人大腸癌細胞系HCT116購自中科院細胞生化所、McCOY’S5A培養基購自美國Sigma公司；針對mTOR基因4個潛在靶位點的SiRNA片段及陰性對照由美國Dharmacon公司合成(Pre-designed RNAi Reagents，Dharmacon，USA)；轉染試劑DharmaFECTTM 4siRNA Transfection Reagent(T-2004-03)；5×SiRNA BufferDharmacon，USA；TRIzol ReagentInvitrogen；MTT，Triton X-100，碘化丙啶(PI)Sigma；RNase ARoche公司；試驗所用SiRNA、引物、探針序列見表1；試驗所用抗體見表2；化學發光檢測用試劑盒Super

West Femto Maximum SensitivitySubstrate(34095)；Super

West Pico Chemilu-minescent Substrate(34077)，均為Pierce公司產品；細胞培養耗材Greiner，Germany；Real-Time quantitative PCR試劑盒TOYOBO，Japan；PVDF膜Milipore，Bedford，MA；8％SDS PAGE、12％SDS PAGEPIERCE，USA；酶標儀Microplate Reader，Model 550，Bio Rad，USA；流式細胞儀EPICS-XL，Beckman Coulter，Germany；熒光定量PCR儀FTC2000(Canada)；蛋白電泳系統Mini Protein II BIO-RAD，USA；超凈工作臺(YJ-875)蘇州凈化設備公司；二氧化碳培養箱Sheldon Manufacturing Inc，SHELLABMODEL2300；低溫超速離心機Eppendorf Centrifuge，5417R；紫外/可見分光光度計Ultraspec 2000型，Pharmacia Biotech公司。
1.體外mTOR siRNA瞬時轉染及mTOR基因沉默效果的測定 細胞培養 HCT116細胞的培養基為McCOY’S 5A MEDIUM完全培養液(10％胎牛血清，100U/ml青/鏈霉素)，培養條件為95％空氣、5％CO2、95％濕度、37℃恒溫。
siRNA瞬時轉染 [1]分別設置空白對照組，轉染試劑對照組(Vehicle Control，VC)，陰性對照組(Negative Control)，mTOR siRNA干擾組。
[2]以0.125％胰蛋白酶消化HCT116細胞成單細胞懸液，接種于直徑6cm的細胞培養皿，培養20h，使細胞融合度達到50％。
[3]取20uM siRNA 80μl，加入720μl 1×siRNA Buffer，800μl無血清培養基，共1600μl，混勻。室溫放置5分鐘。
[4]以同上方法溶解陰性對照(NC)序列。
[5]取DharmaFECTTM 4 192μl(16×12)，加入4608μl(384×8)無血清培養基，共4800μl，混勻。室溫放置5分鐘。
[6]將DharmaFECTTM 4與siRNA等體積混合，室溫放置20分鐘。
[7]棄培養皿內的液體，以PBS洗滌后加入3.2ml含血清的完全培養液，800μlDharmaFECTTM 4與siRNA的混合物，使siRNA終濃度為100nM。轉染試劑對照組只加DharmaFECTTM 4，終濃度與RNA干擾組相同(4μl/ml)。
[8]按常規條件繼續培養48h后檢測RNA及蛋白。
[9]試驗所用siRNA、引物、探針序列見表1 表1 siRNA寡核苷酸、Taqmen Real-Time PCR引物及探針序列

細胞RNA抽提 [1]六孔板每孔細胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，以1ml移液槍頭吹打。
[2]將各孔裂解液吸到1.5ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振搖15s。15-30℃孵育2-3min，離心(4℃，12,000g，15min)。
[3]離心后液體分為三層，小心吸取上層無色液體移入一新的EP管中。
[4]加入等體積異丙醇，0.4-0.5ml，混勻，15-30℃孵育10-30min，離心(4℃，12,000g，10min)。
[5]去上清，加入75％乙醇1ml，漩渦振蕩30s，離心(4℃，7,500g，5min)。
[6]盡量除去上清，管內沉淀在超凈臺中鼓風靜置干燥3-5min。
[7]加入20μl DEPC水溶解，分裝5μl/管，-70℃冰箱保存。
[8]細胞總RNA的鑒定0.9-1.2％瓊脂糖電泳鑒定細胞總RNA，觀察出現條帶及各條帶亮度。紫外分光光度計分別測定RNA樣品在260nm和280nm處的光密度值(OD)，并計算RNA的含量和純度。
RT反應體系(30μl) 2×RT buffer 15μl，隨機引物(100pmol/ul)1.5μl，逆轉錄酶1.5μl，RNA模板5μl，DEPC水7μl 反應條件25℃，10min；40℃，60min；70℃，10min Taqmen Real-Time PCR反應體系(50μl) 2×Hotstart Fluo-PCR mix 25μl，引物(25pmol/μl)0.8μl×2，探針(25pmol/μl)0.3μl，cDNA模板1μl，DEPC水22.1μl 反應條件93℃，4min；93℃，20s；60℃，30s；40循環 細胞總蛋白的抽提 [1]配制細胞裂解緩沖液(RIPA緩沖液)150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，50mM Tris-HCl(PH8.0)。用前加入PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸化酶抑制劑。
[2]以RIPA裂解緩沖液懸浮凍存的細胞團，0.1ml/(1×106～1×107)細胞。
[3]渦旋30s，冰上靜置5min，重復3次。
[4]14,000rpm，4℃，離心10min，吸取上清。
[5]應用考馬斯亮蘭法(Bradford法)蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。
Western blot [1]配制HEPES電泳緩沖液HEPES 23.8g，Tris 12.1g，SDS 1.0g，加入去離子水溶解，定容至1000ml。
[2]配制Tris-甘氨酸電轉移緩沖液(PH8.3)Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，加入去離子水溶解，定容至1000ml。
[3]配制封閉液小牛血清與TBS溶液(Tris 12.1g，NaCl 9g，去離子水定容至1000ml，調節pH至7.5)以1∶9比例配成含10％小牛血清的封閉液。
[4]將定量后的蛋白樣品與5×loading buffer混合，于100℃加熱變性3-5min，簡單離心后順序加入加樣孔中。以150V電壓電泳直至溴酚藍到達分離膠底部。
[5]取出凝膠，其中一塊用于考馬斯亮藍染色以觀察樣品的加樣量及電泳情況，另一塊用于轉膜，于甘氨酸電轉移緩沖液中平衡10-15min。剪裁大小與凝膠相同的6張濾紙和1張PVDF膜。PVDF膜浸以甲醇預處理15s，與濾紙共同浸泡于Tris-甘氨酸電轉移緩沖液。將凝膠的一面與濾膜相接觸，夾于6張濾紙之間，整齊疊放于電轉移裝置中，PVDF膜靠近陽極一側。加入Tris-甘氨酸電轉移緩沖液，于冰上以0.65mA/cm2的電流強度恒流電轉移2～3h。
[6]PVDF膜于封閉液中4℃過夜。棄去封閉液，TTBS(999mlTBS，Tween-201ml)振蕩洗膜5分鐘，與一抗室溫孵育2-3h。TTBS震蕩洗膜3次，每次15min。與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1-2h。TTBS震蕩洗膜3次，每次15min。
[7]以ECL試劑盒進行化學發光，暗室內將A、B發光液等比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液上，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1～2min，清水漂洗后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。
本實施例應用脂質體法瞬時轉染人大腸癌HCT116細胞系，轉染48h后應用Taqmen Real-Time PCR(圖1A)及Western blot(圖1B)方法檢測mTOR基因及蛋白表達，(圖1C)以GAPDH蛋白條帶密度為標準，進行Pan-mTOR及P-mTOR蛋白條帶密度半定量。由圖1可知，mTOR基因的擴增標準曲線為[Y＝-3.4172X+46.4226](R＝0.99973)。針對4個mTOR基因靶位點的siRNA片段(siRNA1、2、3、4)均可顯著抑制mTOR基因及蛋白表達，以siRNA3的作用最為明顯。與轉染試劑對照組(VC)相比較，siRNA3作用組mTOR mRNA表達量減少82.65％，mTOR蛋白表達量減少90.10％，磷酸化mTOR蛋白(pho-mTOR)表達減少89.52％。據此，選擇siRNA3作為靶序列進行后續實驗。
2.mTOR基因沉默對mTOR下游p70S6K及4EBP1蛋白活性的影響 應用Western blot方法檢測mTOR信號通路下游p70s6K及4EBP1蛋白活性的變化。具體操作步驟同前。
以mTOR siRNA3(100nM)及陰性對照siRNA(100nM)轉染HCT116細胞，48h后抽提細胞總蛋白，以Western blot檢測pan-p70S6K，pho-p70S6K(Thr389)，pan-4EBP1，pho-4EBP1(Thr37/46)，以GAPDH作為內參照(圖2A)。以相應總蛋白(pan-)條帶密度為標準，進行pho-p70S6K及pho-4EBP1蛋白半定量(圖2B)。圖2中所示數據代表三次實驗結果。
由圖2可知，mTOR SiRNA3瞬時轉染可顯著降低mTOR下游p70s6K及4EBP1蛋白的磷酸化水平(pho-p70S6KSiRNA3/pho-p70S6KVC＝0.0729；pho-4EBP1SiRNA3/pho-4EBP1VC＝0.0521)，提示mTOR基因沉默可抑制下游p70S6K及4EBP1蛋白的磷酸化，即mTOR信號通路的活性被抑制。
3.MTT比色實驗檢測細胞活力變化 [1]細胞接種細胞培養至生長成單層，以0.125％胰蛋白酶消化，以含10％胎牛血清的McCOY’S 5A培養基調成單細胞懸液，濃度為2×104個/ml，按100μl/孔接種到96孔培養板中。
[2]轉染接種24小時后吸去培養液，加入200μl完全培養液，其中SiRNA濃度100nM，DharmaFECTTM 4濃度4μl/ml，溶劑對照組(Vehicle Control)只加入DharmaFECTTM4，空白對照組加入完全培養液。置于原條件分別繼續培養24h、48h、72h。每組設5個副孔。每組實驗重復三次。
[3]顯色每孔加入5mg/ml的MTT(methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide，(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenytetra-zolium，Calbiochem，San Diego，CA，USA)溶液20μl，置于37℃繼續培養4h，小心吸去上清液，加入100ul/孔DMSO，避光室溫下搖床振蕩30min。
[4]比色酶標儀雙波長(570nm、630nm)測定各孔光吸收值并記錄結果。以

表示細胞活力。試驗重復三次，數據以

±SD顯示。與陰性對照組(NC)相比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
由圖3可知，瞬時轉染mTOR siRNA3 48h即可顯著抑制HCT116細胞活力(81.99±1.1277vs.97.5±0.6186，P＜0.05)，至轉染后72h，其作用更為明顯(56.42±1.4226vs.85.83±3.635，P＜0.01)。
4.流式細胞術檢測細胞周期 [1]對數生長期細胞以無血清培養基培養24h使之同步化。
[2]SiRNA瞬時轉染，終濃度為100nM。設陰性序列對照、空白對照。于完全培養基中繼續培養48h。
[3]以0.125％胰蛋白酶消化收集細胞，PBS洗滌，4℃無水乙醇固定后，制成約106個/ml的單細胞懸液。
[4]與含1％RNA酶的Tris-HCL緩沖液(pH7.4)共同孵育10min。
[5]以碘化丙啶(PI)染色后，進行流式細胞儀檢測。
[6]根據相對不同DNA含量的細胞分布圖，擬合各周期細胞的百分率。每組復測3個樣品，試驗重復三次。數據以

±SD顯示。與陰性對照組(Negative Control，NC)相比較，*P＜0.01。
由圖4可知，siRNA3轉染后48h，S期細胞數量顯著減少，G0/G1期細胞數量顯著增多，mTOR siRNA3可將HCT116細胞周期阻滯于G0/G1期(78.667±0.2887vs.94.79±0.1，P＜0.01)。
5.mTOR基因沉默誘發細胞凋亡 以mTOR siRNA3(100nM)及陰性對照序列(100nM)轉染HCT116細胞，轉染后48h進行吖啶橙染色，AnnexinV/PI雙染色，以流式細胞術進行凋亡細胞定量。
吖啶橙(Acridine Orange，AO)染色 1000rpm/min離心5分鐘收集細胞，以PBS懸浮細胞團。取95μl細胞懸液與5μl吖啶橙染色液(pH6.8)混勻，點于潔凈載玻片上，蓋玻片封固后立即鏡檢。正?；罴毎鸇NA呈綠色，RNA呈紅色，凋亡細胞呈現致密濃染的黃色增強熒光(圖5A箭頭所示)。
Annexin-V/PI雙染色 于4℃以1300rpm/min離心5分鐘收集細胞；1ml預冷的PBS洗滌細胞；加入200μlBinding buffer懸浮細胞，加入10μl FITC-Annexin-V和5μl PI，避光室溫溫育15～30分鐘；取細胞沉淀涂片，蓋玻片封固，立即鏡檢。或加入300μl binding buffer，使終體積為500μl，進行流式細胞儀檢測。早期凋亡細胞呈現綠色熒光，晚期凋亡細胞膜呈綠色熒光，核呈紅色熒光(圖5B)。在流式細胞術檢測圖譜，早期凋亡細胞位于第4象限(右下)。凋亡細胞的比例(％)以

±SD顯示，代表三次試驗結果。與陰性對照組(negative control，NC)比較，*P＜0.01(圖5C)。
多聚ADP-核糖聚合酶PARP的檢測 PARP(polyADP-ribose polymerase)是第一個被鑒定的在細胞凋亡中由Caspase-3和其他半胱氨酸蛋白酶降解、且最富特征性的蛋白酶解底物。PARP的蛋白酶解作為半胱氨酸蛋白酶激活的分子事件，被認為是細胞凋亡的一個早期分子標志。將轉染后48h的HCT116細胞收集，并抽提細胞總蛋白，應用Western blot方法檢測PARP蛋白剪切體(89kD)，具體操作步驟同前文，所用抗體如表2所示。PARP蛋白免疫印跡圖片及蛋白條帶密度半定量結果(89KDa/116KDa)如圖6所示。
由圖5可知，與VC及NC對照組相比較，轉染mTOR siRNA3 48h可誘導HCT116細胞發生顯著的凋亡的形態學改變(圖5A，B)；24h及48h的平均凋亡率分別為8.94％和36.5％，均顯著高于VC及NC對照組(P＜0.01，P＜0.01)(圖5C)。由圖6可知，在mTOR siRNA3作用48h及72h，PARP蛋白剪切體(89kD)的比例顯著增加，提示116kD的PARP被Caspase-3剪切生成89kD的片段，是細胞凋亡的重要特征。
表2實驗所用抗體及稀釋度

注CST，Cell Signaling Tech；WB，Western blot；IHC，Immunohistochemistry 實施例2體內研究 本實施例的實驗材料 實驗動物BALB/c裸鼠，雄性，4周齡，近交系，購自中科院松江動物實驗基地(SCXK(滬)2003-0003)，飼養于上海交通大學醫學院IVC動物實驗室(SYXK(滬)2003-0007)；SiRNA應用表1所示siRNA3及陰性對照(NegativeControl)序列，由上海吉瑪公司(Shanghai GenePharma Co.，Ltd)進行甲氧修飾，并化學合成；轉染試劑in vivo-jetPEITM(201-50G，Polyplus Transfection，Illkirch，France)；試驗所用抗體見表2；TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒Roche，1684809a；50μl微量注射器上海天呈科技有限公司；游標卡尺上海精密儀器儀表有限公司；超聲波細胞粉碎機(JY92-II)寧波新芝生物科技股份有限公司；石蠟切片機(RM21459)、包埋機(EG1140H)、自動染色機Leica公司。
1.mTOR siRNA3瞬時轉染抑制人大腸癌裸鼠移植瘤模型的生長 建立人大腸癌裸鼠移植瘤模型 復蘇人大腸癌細胞株HCT116，傳代培養至第三代，以0.125％胰蛋白酶消化細胞，離心收集，以PBS洗滌兩次，懸浮為單細胞懸液，密度為1.5×108個/ml。以微量注射器接種于裸鼠左側腋部皮下，100μl/只。接種后1w形成肉眼可見的癌結節。接種后第10天開始RNAi實驗。實驗動物分3組，每組6只，如下 [1]溶劑對照組(Vehicle control group，VC)瘤內注射in vivo-jetPEI [2]陰性序列對照組(Negative control group，NC)瘤內注射Negative Control siRNA [3]siRNA3干擾組(siRNA3 group)瘤內注射mTOR siRNA3 siRNA瞬時轉染 [1]以5％GS分別溶解in vivo-jetPEI及SiRNA。
[2]將溶解后的in vivo-jetPEI加入SiRNA，in vivo-jetPEI與SiRNA的比例為1.6μl/10μg，總體積為30μl。渦旋混勻后室溫靜置15min。
[3]在層流超凈工作臺內，以無菌微量注射器于腫瘤局部分3點注射，10μl/點。3組裸鼠分別瘤內注射in vivo-jetPEI(1.6μl/30μl/只，VC組)、siRNANC(10μg/30μl/只，NC組)、mTOR siRNA3(10μg/30μl/只，RNAi組)。
[4]隔天重復上述操作一次，共轉染6次，末次轉染后第2天處死實驗動物。圖7A為首次瘤內注射當天及注射后第10天各組荷瘤裸鼠圖片。
腫瘤體積測算 應用游標卡尺于RNAi實驗的第1、5、10天測量腫瘤最大直徑(a)與最小直徑(b)，根據公式計算腫瘤體積。數據以

±SD表示(n＝6)。與VC組比較，*P＜0.05，**P＜0.01(圖7B)。
由圖7可知，mTOR siRNA3可顯著抑制裸鼠大腸癌移植瘤生長，siRNA3轉染組腫瘤的生長速度顯著低于轉染試劑對照組(VC)以及陰性序列對照組(NC)。轉染后第10天，siRNA3轉染組的腫瘤體積(746.99±171.525)顯著小于VC對照組(1333.765±220.427，P＜0.01)以及NC對照組(1489.37±449.684)(P＜0.01)，VC及NC對照組間無明顯差異。
2.mTOR基因沉默對腫瘤組織mTOR信號通路活性的影響 抽提腫瘤組織總蛋白 [1]觀察期結束后采用頸椎脫臼法處死并解剖實驗動物，獲得腫瘤組織，去除壞死組織，在液氮中將其碾碎成粉。
[2]將粉末轉移到冰上預冷的RIPA裂解緩沖液中，每300mg樣品加入1ml裂解液，勻漿器內最大轉速勻漿30秒。
[3]將勻漿液置冰上，搖床上搖20min，150g離心5min，轉移上清到新的離心管。
[4]18,000rpm 4℃再次離心30min，取上清測定蛋白質濃度。
Western blot 按照前文描述的Western blot步驟檢測腫瘤組織Pan-mTOR、Pan-p70s6K、Pho-p70s6K(Thr389)、Pan-4EBP1和Pho-4EBP1(Thr37/46)蛋白水平的變化，以GAPDH作為內參照(圖8A)。所用抗體如表2所示。以GAPDH條帶密度為標準，進行Pan-mTOR標準化定量，以各自的總蛋白條帶密度為標準，進行Pho-p70s6K和Pho-4EBP1的標準化定量(圖8B)。與VC組比較，*P＜0.01。圖中所示數據代表三次實驗結果。
SABC法檢測腫瘤組織mTOR、p70s6K、4EBP1蛋白磷酸化水平 [1]至實驗觀察終點，以頸椎脫臼法處死實驗動物，解剖剝離腫瘤，以PBS緩沖液洗凈，去除壞死組織，以中性甲醛固定過夜 [2]按照常規方法取材、脫水、石蠟包埋，4μm連續切片，70℃烘烤2h [3]石蠟切片以二甲苯脫蠟，2次，10min/次。
[4]梯度酒精水化(100％，95％，75％，50％)，5min/次，蒸餾水漂洗5min。
[5]含0.1％Tween-20的0.01M PBS(pH7.4)漂洗2次，5min/次 [6]滴加過氧化氫甲醇液以消除內源性過氧化物酶活性，室溫孵育20min [7]蒸餾水洗，PBS浸泡2次，5min/次 [8]0.01mol/L pH6.0檸檬酸緩沖液(CB)微波修復10min，冷卻至室溫，蒸餾水洗2次，PBS洗2次，3min/次 [9]滴加封閉用二抗宿主血清，室溫孵育20min [10]傾去血清，不洗，滴加一抗工作液，37℃溫箱孵育1h。
[11]PBS沖洗3次，5min/次 [12]滴加生物素標記二抗，37℃溫箱孵育30min [13]PBS沖洗3次，5min/次 [14]滴加ABC復合物.37℃溫箱30min [15]PBS沖洗3次，5min/次 [16]滴加新鮮配制的BCIP/NBT液避光顯色5～30min，顯微鏡下觀察至出現陽性著色 [17]蒸餾水充分水洗終止染色 [18]核固紅復染胞核 [19]蒸餾水充分水洗 [20]梯度乙醇(50％，75％，95％，100％)脫水，5min/次 [21]二甲苯透明2次，10min/次 [22]晾干后中性樹膠封片 [23]應用OLYMPUS 1X51倒置顯微鏡觀察并拍照。認為細胞漿著色為陽性表達。(圖8C)VC組SABC法檢測結果，(圖8D)SiRNA3轉染組SABC法檢測結果。(a)Pho-mTOR(Ser2448)，(b)Pho-p70S6K1(Thr389)，(c)Pho-4EBP1(Thr37/46)。原始圖片放大倍數400×。
由圖8可知，與對照組相比，mTOR siRNA3轉染可顯著降低裸鼠大腸癌移植瘤組織中mTOR蛋白的表達量(mTORSiRNA3/mTORVC＝0.2301，P＜0.01)，以及p70s6K、4EBP1蛋白的磷酸化水平(Pho-p70s6KsiRNA3/Pho-p70s6KVC＝0.0845，P＜0.01；Pho-4EBP1siRNA3/Pho-4EBP1VC＝0.0602，P＜0.01)(圖8A，B)。SABC法檢測結果顯示，siRNA3轉染組腫瘤組織Pho-mTOR、Pho-p70s6K及Pho-4EBP1的表達量明顯低于VC對照組。各對照組間無明顯差異(圖8C，D)。提示mTOR siRNA3轉染可顯著抑制裸鼠大腸癌移植瘤組織中mTOR蛋白表達以及mTOR/p70s6K/4EBP1信號通路活性。
3.TUNEL法原位檢測細胞凋亡 [1]將石蠟組織切片置于染色缸中，二甲苯浸洗2次，每次5min [2]100％的乙醇浸洗2次，依次用95％、85％、70％和50％的乙醇各浸洗一次，每次3min，PBS浸洗5min [3]置于4％多聚甲醛溶液或含10％福爾馬林的PBS溶液(見備注1和2)中固定15min，PBS浸洗二次，每次5min [4]將載玻片取出置于一水平表面，用濾紙小心吸去載玻片上的多余液體，滴加100μL新配制的蛋白酶K工作溶液(見備注3)覆蓋在樣本區域上，室溫下放置10～30min，然后PBS浸洗5min [5]再置于4％多聚甲醛溶液或含10％福爾馬林的PBS溶液中固定5min，用PBS浸洗二次，每次5min [6]用濾紙小心吸去載玻片上的多余液體，滴加100μL的Equilibration Buffer于樣本區域上，室溫平衡5-10min [7]載玻片平衡時，將Biotin-11-dUTP置冰上解凍，同時配制TdT酶反應液，于冰上保存待用 [8]用濾紙小心吸去樣本區域周圍的多余液體，滴加50μL的TdT酶反應液于樣本區域上 [9]在反應區域蓋上蓋玻片以確保反應液分布均勻，于37℃、潮濕環境中反應60-90min [10]去除蓋玻片，加入50μL 2×SSC溶液終止反應，室溫放置15min，PBS浸洗三次，每次5min [11]用0.3％的H2O2浸洗3～5min，然后PBS浸洗三次，每次5min [12]滴加100μL稀釋的Streptavidin-AKP溶液于樣本區域上，室溫反應3-5min [13]PBS浸洗三次，每次5min [14]于載玻片的樣本區域滴加100μL BCIP/NBT工作液(見備注10)，直到呈現淺藍色背景 [15]去離子水漂洗2次，用核固紅復染 [16]去離子水漂洗2～3次；依次用70％、90％、100％乙醇浸洗、每次3min，100％乙醇浸洗兩次 [17]二甲苯浸洗固定，樹脂封片，光學顯微鏡下進行觀察并拍照。藍色為凋亡細胞。
[18]每張切片取5個視野，應用Image Pro Plus 5.0 software計算陽性細胞率，結果以

±SD表示。(圖9A)mTOR siRNA3作用組；(圖9B)VC及NC對照組；(圖9C)各組凋亡細胞計數結果(％)。原始圖片放大倍數400×。
由圖9可知，與對照組相比較，mTOR siRNA3轉染組細胞凋亡率顯著增高(23.7±7.496 vs.2.1±0.4，P＜0.01)。提示mTOR siRNA3轉染可誘導裸鼠大腸癌移植瘤組織發生顯著的凋亡。
序列表
<110>上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院
房，靜遠
張，燕捷
<120>一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
gagaagaaau ggaagaaauu u21
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
auuucuucca uuucuucucu u21
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>3
ccaaagugcu gcaguacuau u21
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>4
uaguacugca gcacuuuggu u21
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>5
gagcaugccg ucaauaauau u21
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>6
uauuauugac ggcaugcucu u21
<210>7
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>7
ggucugaacu gaaugaagau u21
<210>8
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>8
ucuucauuca guucagaccu u2權利要求
1.一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，所述的小干擾RNA正義鏈的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述的小干擾RNA反義鏈的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO2所示。
2.一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO4所示。
3.一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO6所示。
4.一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO7所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO8所示。
全文摘要
本發明提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應用，這種小干擾RNA能夠抑制大腸癌細胞增殖活力，阻滯大腸癌細胞生長周期，誘導大腸癌細胞凋亡，下調大腸癌mTOR/p70S6K/4EBP1信號通路的活性，對裸鼠大腸癌移植瘤具有治療作用，解決了現有技術中采用化療來治療中晚期大腸癌，其療效以及患者預后均較差的技術問題。
文檔編號A61P35/00GK101606948SQ200810039008
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月16日 優先權日2008年6月16日
發明者房靜遠, 張燕捷 申請人:上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院