專利名稱：免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳后通過真空冷凍干燥、懸浮造 粒和腸溶包膜制備具有良好的免疫與微生態(tài)調(diào)節(jié)雙重活性復合微膠丸的方法。
背景技術：
19世紀末，人類開始認識雙歧桿菌和免疫乳。經(jīng)過1個多世紀的研究與實 踐，人類已經(jīng)了解并掌握了二者的基本特性，并已開發(fā)出多種產(chǎn)品。雙歧桿菌是人類腸道內(nèi)主要的有益菌群，可以抑制有害菌群的生長繁殖，促 進機體新陳代謝，增強機體抵抗能力，調(diào)節(jié)人體內(nèi)微生態(tài)平衡，已應用于醫(yī)療保 健藥品和食品。雙歧桿菌產(chǎn)品在日本和歐美等國家非常盛行，目前國外己開始采 用高密度培養(yǎng)、真空冷凍干燥、腸溶微膠囊等技術生產(chǎn)各種雙歧桿菌微生態(tài)制劑， 如益生菌(Probiotics)制劑、益生元(Prebiotics)制劑、合生素(Synbiotics) 制劑等。我國雙歧桿菌乳制品的發(fā)展起步較晚，90年代才開始對雙歧桿菌酸奶 進行研究，主要是雙歧桿菌系列酸"益生菌"酸奶，以及麗珠腸樂、回春生、 菲康、金雙歧、"法國合生元益生菌"等微生態(tài)制劑。雖然在這些制劑中，雙歧 桿菌的活菌數(shù)達到108dWg，但制劑生產(chǎn)過程中沒有經(jīng)過包埋和緩釋技術處理， 因此制劑在保藏過程中會出現(xiàn)活菌數(shù)與穩(wěn)定性降低，服用過程中胃腸通過率極低 等現(xiàn)象，嚴重影響了產(chǎn)品的保健功能。對于免疫乳的研究國外起步較早，從20世紀50年代開始，科學家就著手研 究通過免疫乳來防治人類的疾病。如Mainer、 Sheridan等人研制抗輪狀病毒的免 疫乳，Biokema、 Mietns等人研制抗大腸桿菌的免疫乳，Tacket等人研制抗福氏 志賀氏菌的免疫乳，以及抗其它腸道病原菌及非腸道疾病的免疫乳，并取得了相 當好的臨床結果。另外，國外的學者對免疫球蛋白的特性進行了大量的研究，如 Mainer、 David、 Tyler等人研究發(fā)現(xiàn)當溫度超過65°C，乳中免疫球蛋白的活性被 破壞；Hipert通過免疫電泳表明，免疫球蛋白經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后， 仍可保持一定的活性；胃酸對免疫球蛋白的破壞作用較大。目前國外己采用超濾、 超高壓、微膠囊技術對各種免疫乳制品進行研究，得到的產(chǎn)品穩(wěn)定性較好，胃腸 通過率較高。但國內(nèi)開發(fā)出的免疫乳類產(chǎn)品種類較少，主要是以普通牛初乳為原 料生產(chǎn)出的牛初乳類干粉產(chǎn)品，特異性免疫球蛋白的產(chǎn)品還未見有生產(chǎn)，而且這些產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中主要應用熱殺菌、噴霧干燥等技術，產(chǎn)品中免疫球蛋白的免 疫活性損失較大，保藏穩(wěn)定性較低，胃腸通過率低于10%。本發(fā)明專利是以高活性免疫牛初乳和高密度培養(yǎng)的雙歧桿菌為原料，采用高 密度培養(yǎng)、超高壓、真空冷凍干燥、懸浮造粒和腸溶包膜技術制備免疫與微生態(tài) 調(diào)節(jié)雙重活性的復合腸溶微膠丸。該制劑不僅有效保持高免疫和微生態(tài)調(diào)節(jié)雙重 活性，而且具有較強的耐酸和抗消化酶特性，腸道內(nèi)釋放效果良好。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種利用雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳后通過真空冷凍干燥、懸浮造 粒和腸溶包膜制備復合微膠丸的方法，旨在解決在生產(chǎn)、使用過程中免疫牛初乳 與雙歧桿菌的活性、數(shù)量及效價顯著降低的問題。本發(fā)明采取的技術方案是1、 雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳的制備選取距離預產(chǎn)期6~8周的健康預產(chǎn)奶牛作為免疫對象，進行人體腸道內(nèi)有害 菌(如致病性大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等)免疫，收集該母牛分娩后l~3d 的乳汁即為免疫牛初乳；所得免疫牛初乳經(jīng)離心脫脂、超高壓殺菌后接種雙歧桿 菌，離心脫脂條件為3000 5000rpm， 5 15min，使脫脂后免疫牛初乳中脂肪質(zhì)量 含量為0.8~1.2%，超高壓殺菌條件為300 800MPa，保壓2 20min，接種量為 1~10%體積濃度，培養(yǎng)4 24h，使雙歧桿菌活菌數(shù)量達到l(fcfii/mL以上，免疫 球蛋白效價>21()，獲得雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳；2、 免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉的制備在雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳中添加0.1~10%質(zhì)量濃度的蔗糖和0.4~40%質(zhì)量 濃度的甘露醇(蔗糖和甘露醇作為凍干保護劑使用)，控制料液的厚度處于 5 20mm范圍內(nèi)，先在-80 -20。C溫度范圍內(nèi)預凍l~10h，使料液中心達到預凍溫 度；然后進行凍干，凍干過程中采用擱板導熱的加熱方式，凍干壓力為l~50Pa， 擱板溫度控制在0 3(TC以下，凍干時間6 16h;所制得的免疫牛初乳與雙歧桿菌 復合凍干粉，其中活菌數(shù)量達到10^cfU/g干粉以上，免疫球蛋白效價》29;3、 免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備以淀粉和砂糖粉制作母芯，母芯中淀粉的質(zhì)量百分含量為10~50%，母芯經(jīng) 造粒后干燥；在100mL質(zhì)量濃度為0.4~40%海藻糖的水溶液中添加經(jīng)濃縮后的酪蛋白水解液5 50mL (酪蛋白含量為20%質(zhì)量濃度)，并添加0.2~20%體積的Span80作 為乳化劑，制成復合保護液；以復合凍干粉1~2倍質(zhì)量的復合保護液為潤濕劑，在25 45'C溫度范圍內(nèi)， 采用空氣懸浮造粒法將免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉包被在母芯上，母芯與 復合凍干粉的質(zhì)量比為l: 4~14，從而制備免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉顆 粒；再以質(zhì)量濃度為5~50%的腸溶型歐巴代包衣液為包埋劑，同樣采用空氣懸 浮造粒法進行腸溶包膜，從而制得具有良好免疫與微生態(tài)調(diào)節(jié)雙重活性的復合微 膠丸。上述方法步驟1中所述的雙歧桿菌經(jīng)高密度培養(yǎng)后進行接種，高密度培養(yǎng)后 的活菌數(shù)量達到109 cfo/mL以上。上述方法步驟3中所述的母芯造粒機的工藝參數(shù)為主機調(diào)速50 120rpm， 噴漿調(diào)速80 150rpm，鼓風溫度20~60°C;在干燥室內(nèi)鼓風干燥，干燥溫度 37~40°C，空氣相對濕度《20%，干燥時間2 10h。上述方法步驟3中所述的空氣懸浮造粒機的工藝參數(shù)為進風量 100~300m3/h;進氣溫度20~60°C;排氣溫度20~60°C;物料溫度10~60°C; 噴漿速度1~10 rpm;造粒機內(nèi)鼓風干燥，進風量100~300m3/h，干燥溫度 37~40°C，干燥時間2 10h。經(jīng)以上工藝制備的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸，呈淡綠色、圓形顆粒 狀，不粘連，流動性好，粒徑大小基本均勻，90。/。以上的微粒直徑均處于0.9 1.5mm 范圍內(nèi)，活菌數(shù)量達到108CfWg以上，免疫球蛋白效價》28。所得復合微膠丸能夠有效克服胃液對免疫牛初乳與雙歧桿菌活性的殺滅作 用，有效保持免疫與微生態(tài)雙活性，可在人工胃液中2 4h不崩解，而在人工腸 液中l(wèi)h內(nèi)崩解，釋放出活菌及免疫球蛋白，達到免疫牛初乳與雙歧桿菌聯(lián)合起 效的保健功能。本發(fā)明的有益效果是針對具有免疫活性與微生態(tài)調(diào)節(jié)雙重活性功能性乳制 品的開發(fā)與應用。本發(fā)明專利是以高活性免疫牛初乳和高密度培養(yǎng)的雙歧桿菌為 原料，采用高密度培養(yǎng)、超高壓、真空冷凍干燥、懸浮造粒和腸溶包膜技術制備 免疫與微生態(tài)調(diào)節(jié)雙重活性的復合腸溶微膠丸。該制劑不僅有效保持高免疫和微 生態(tài)調(diào)節(jié)雙重活性，而且具有較強的耐酸和抗消化酶特性，腸道內(nèi)釋放效果良好。 本發(fā)明解決了該類制品在生產(chǎn)、使用過程中免疫牛初乳與雙歧桿菌的活性、數(shù)量及效價損失嚴重的問題，為進一步開發(fā)雙歧桿菌與免疫牛初乳制品提供了堅實的 技術支撐，為更好的開發(fā)新型功能性食品開辟了新的研究領域和空間。


圖h雙歧桿菌在免疫牛初乳中的生長曲線圖； 圖2:免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸狀態(tài)圖； 圖3:標尺下的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸。圖1所示，雙歧桿菌接種到免疫牛初乳中，初始活菌數(shù)為6.8xl()ScfU/mL， 0~1.5h為菌體生長的延滯期，1.5~6.5h為對數(shù)生長期，6.5~llh為穩(wěn)定期。6.5h 活菌數(shù)達到最大值3.61xl09cfWmL。
具體實施方式
實施例l:雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳的制備 一、免疫牛初乳的制備1、 抗原制備將福氏志賀氏菌(SWge//ayfec"^7'，從吉林大學第一臨床醫(yī)院微生物研究室 購進，常規(guī)菌種)增菌培養(yǎng)，搖床溫度37'C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)18~20h;收集 培養(yǎng)液，添加0.4%體積濃度的甲醛，37'C滅活24h，雜檢。如無活菌存在，用 麥氏比濁管測定菌體濃度。用無菌生理鹽水調(diào)整菌體濃度為1.0xlO"cfWmL，制 成水劑苗，并在水劑苗中加入等體積的IO號白油，攪拌乳化，制成油佐劑苗； 水劑苗、油佐劑苗均4'C保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r用小白鼠做安全檢査。2、 抗原免疫接種隨機選擇健康、距離預產(chǎn)期6 8周的預產(chǎn)奶牛肌肉注射水苗，兩周后皮下注 射油佐劑苗，以后每隔一周交替注射水劑苗和油佐劑苗，直至奶牛分娩。在接種 過程中，定期采血，監(jiān)測牛分泌抗體的水平，要求血清抗體凝集價》25。3、 免疫牛初乳的收集、脫脂與效價測定收集母牛分娩后l~3d的牛初乳即為免疫牛初乳。將免疫牛初乳在4000rpm， 10min條件下離心脫脂，所得脫脂免疫牛初乳中脂肪質(zhì)量含量為0.96%。同時測 定脫脂免疫牛初乳的抗體含量和效價，抗體含量為35.6mg/mL，免疫球蛋白效價為2"<二、雙歧桿菌的高密度培養(yǎng) 1、雙歧桿菌液體培養(yǎng)基酵母浸粉10g 吐溫-80 lml 蒸餾水 1LKH2P04 l.Og K2HP04 l.Og大豆蛋白胨5g 半胱氨酸'HC1 0.5gMgS04.7H20 0.48g NaCl 2.0g胰胨5g 葡萄糖10g 鹽溶液40ml 鹽溶液的成分和制備 無水CaCl2 0.2g NaHC03 10g 蒸餾水1L 2、雙歧桿菌高密度培養(yǎng)在10L發(fā)酵罐中通入氮氣保持壓力，壓力為O.lMPa,接種量2.5%體積濃度， 37'C攪拌培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速80rpm。培養(yǎng)基初始pH值7.0，培養(yǎng)6h后發(fā)酵液pH值降 至5.76，采用恒流補堿的方法從發(fā)酵罐補料口滴加lmol/L濃氨水保持pH值在 6.0士0.3;葡萄糖濃度12h降至4g/L，此時開始補糖，補充10%質(zhì)量濃度的滅菌 葡萄糖10mL，使糖濃度保持在4~6g/L。 6 20h為菌體生長的對數(shù)期，在對數(shù)生 長期末期放罐，此時活菌數(shù)為4.62X 109 cfWmL。三、雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳的制備1、 免疫牛初乳超高壓殺菌將脫脂后的免疫牛初乳密封于聚乙烯塑料袋中，置于壓力容器內(nèi)，以最大程 度的提高殺菌效率和保護免疫乳中免疫球蛋白的活性為目標，確定超高壓殺菌工 藝為殺菌壓力為600MPa、保壓時間10min，孢子的殺菌率達到99.58%。2、 雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳將實施例1步驟二得到的雙歧桿菌以2.5%體積濃度的接種量接種于經(jīng)超高 壓殺菌的免疫牛初乳中，在37'C條件下培養(yǎng)6.5h，使活菌數(shù)達到3.61 X 109cfu/mL，雙歧桿菌在免疫牛初乳中的生長曲線如圖1所示。雙歧桿菌發(fā)酵免 疫牛初乳中免疫球蛋白效價為21Q。實施例2:免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉的制備在雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳中添加1%質(zhì)量濃度的蔗糖和4%質(zhì)量濃度的甘 露醇作為凍干保護劑。冷阱溫度為-45'C，料液的裝液厚度10mm，先在-3(TC條 件下預凍2h;然后進行凍干，凍干過程中采用擱板導熱的加熱方式，壓力為15Pa， 擱板溫度控制在20"C以下，凍干時間10h。復合凍干粉中活菌數(shù)量為1.24xl01() cfU/g干粉，免疫球蛋白效價為29。實施例3:免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備1、 母芯的制作以質(zhì)量比為7: 3的蔗糖粉和可溶性淀粉為原料制作母芯，母芯造粒機的工 作參數(shù)為主機調(diào)速80rpm，噴漿調(diào)速110rpm，鼓風溫度27.1°C。2、 母芯的干燥將母芯初步定型干燥后，去除不合格的母粒，在干燥室內(nèi)鼓風干燥，干燥溫 度40°C，空氣相對濕度《20%，干燥時間4h。母芯平均重量為0.226mg，直徑 0.3~0.5mm。3、 免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉顆粒的制備采用空氣懸浮造粒法將免疫牛初乳于雙歧桿菌復合凍干粉包被在母芯上，母 芯與復合凍干粉的質(zhì)量比為1: 10，制得雙歧桿菌與免疫牛初乳復合凍干粉顆粒。 制備過程中以復合保護劑為潤濕劑，復合凍干粉與復合保護液的質(zhì)量比為1: 1.5， 保護劑配方為在100mL質(zhì)量濃度為4%的海藻糖溶液中加入25mL濃縮后的酪 蛋白水解液(酪蛋白含量為20%質(zhì)量濃度)，并加入2mL Span80作為乳化劑。空氣懸浮造粒法工藝參數(shù)為進風量200m3/h，進氣溫度44.8°C，排氣溫 度36.2°C，物料溫度37°C，噴漿速度6rpm。4、 免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉顆粒的干燥造粒機內(nèi)鼓風干燥，進風量200m3/h，干燥溫度37。C，干燥時間4h。5、 免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備 (1)腸溶型歐巴代包衣液的配制在合適的配液容器中加入計算好的88%質(zhì)量濃度的乙醇溶液作為溶劑，加入 粉末狀腸溶型歐巴代包衣劑配成15%質(zhì)量濃度的腸溶型歐巴代包衣液，即免疫牛 初乳與雙歧桿菌復合凍干粉顆粒增重為15%。配制時將粉末狀腸溶型歐巴代包衣劑以平穩(wěn)的速度加入到連續(xù)攪拌的酒精 溶液中，不能使粉末漂浮在液面上。隨著包衣液的粘度不斷增大，提高攪拌速度，以保持原有的漩渦。加料完畢后可降低攪拌速度，并繼續(xù)攪拌45min，即可完成 腸溶型歐巴代包衣液的配制。 (2)空氣懸浮造粒采用空氣懸浮造粒機進行腸溶包膜，工藝參數(shù)為進風量200m3/h，進氣 溫度44.8。C，排氣溫度36.2°C，物料溫度37°C，噴漿速度6rpm。 6、免疫球蛋白與雙歧桿菌復合微膠丸產(chǎn)品質(zhì)量評價制得的雙歧桿菌與免疫球蛋白復合微膠丸如圖2所示，呈淡綠色圓形顆粒 狀、不粘連、流動性好，粒徑大小基本均勻，90。/。以上的微粒直徑均處于0.9 1.5mm 范圍內(nèi)，見圖3。微膠丸中的活菌數(shù)為6.3xl()Scfii/g，免疫球蛋白效價為28。以腸溶型歐巴代 作為腸溶包膜的完整微膠丸在人工胃液中2h不崩解，而在人工腸液中40min內(nèi) 崩解完全，將雙歧桿菌及免疫球蛋白釋放出來。
權利要求
1、免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法，其步驟如下(1)雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳的制備選取距離預產(chǎn)期6～8周的健康預產(chǎn)奶牛作為免疫對象，進行人體腸道內(nèi)有害菌免疫，收集該母牛分娩后1～3d的乳汁即為免疫牛初乳；所得免疫牛初乳經(jīng)離心脫脂、超高壓殺菌后接種雙歧桿菌，獲得雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳；(2)免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉的制備在雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳中添加凍干保護劑，控制料液的厚度處于5～20mm范圍內(nèi)，先在-80～-20℃溫度范圍內(nèi)預凍1～10h，使料液中心達到預凍溫度；然后進行凍干，凍干過程中采用擱板導熱的加熱方式，凍干壓力為1～50Pa，擱板溫度控制在0～30℃以下，凍干時間6～16h，制得活菌數(shù)量達到1010cfu/g以上，免疫球蛋白效價≥29免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉；(3)免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備以淀粉和砂糖粉制作母芯，母芯中淀粉的質(zhì)量百分含量為10～50％，母芯經(jīng)造粒后干燥；以復合凍干粉1～2倍質(zhì)量的復合保護液為潤濕劑，在25～45℃溫度范圍內(nèi)，采用空氣懸浮造粒法將免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉包被在母芯上，母芯與復合凍干粉的質(zhì)量比為1∶4～14，從而制備免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉顆粒；再以質(zhì)量濃度為5～50％的腸溶型歐巴代包衣液為包埋劑，同樣采用空氣懸浮造粒法進行腸溶包膜，從而制得具有良好免疫與微生態(tài)調(diào)節(jié)雙重活性的復合微膠丸。
2、 如權利要求1所述的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法，其特征 在于有害菌為大腸桿菌、沙門氏菌或志賀氏菌。
3、 如權利要求2所述的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法，其特征 在于有害菌為福氏志賀氏菌。
4、 如權利要求1所述的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法，其特征 在于雙歧桿菌經(jīng)高密度培養(yǎng)后進行接種，高密度培養(yǎng)后的活菌數(shù)量達到109cfU/mL以上。
5、 如權利要求1所述的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法，其特征 在于離心脫脂條件為3000 5000rpm， 5 15min，使脫脂后免疫牛初乳中脂 肪的含量在0.8~1.2%范圍內(nèi)。
6、 如權利要求1所述的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法，其特征 在于超高壓殺菌條件為300 800MPa，保壓2 20min。
7、 如權利要求1所述的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法，其特征 在于接種量為1~10%體積濃度，培養(yǎng)4 24h，雙歧桿菌活菌數(shù)量達到109cfU /mL以上，免疫球蛋白效價221、
8、 如權利要求1所述的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法，其特征 在于凍干保護劑為蔗糖和甘露醇，蔗糖用量為0.1~10%質(zhì)量濃度，甘露醇 的用量0.4~40%質(zhì)量濃度。
9、 如權利要求1所述的免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法，其特征 在于是在lOOmL質(zhì)量濃度為0.4~40%海藻糖的水溶液中添加經(jīng)濃縮后的酪 蛋白水解液5~50mL，酪蛋白水解液中酪蛋白含量為20%質(zhì)量濃度，并添加 0.2~20%體積的Span80作為乳化劑，制成復合保護液。
10、 如權利要求1所述的免疫與微生態(tài)調(diào)節(jié)雙重活性復合微膠丸的制備方法，其 特征在于空氣懸浮造粒的工藝參數(shù)為進風量200m3/11，進氣溫度20 6(TC， 排氣溫度20 60。C，物料溫度10 60'C，噴漿速度l 10rpm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫牛初乳與雙歧桿菌復合微膠丸的制備方法。其是將雙歧桿菌以1～10％接種量接種于經(jīng)超高壓滅菌的脫脂免疫牛初乳中，培養(yǎng)4～24h，獲得雙歧桿菌發(fā)酵免疫牛初乳；添加凍干保護劑，真空冷凍干燥，獲得免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉；將母芯與復合凍干粉按質(zhì)量比為1∶4～14以空氣懸浮造粒法制成免疫牛初乳與雙歧桿菌復合凍干粉顆粒，然后以濃度為5～50％的腸溶型歐巴代包衣液為包埋劑在空氣懸浮造粒機中進行腸溶包膜制得復合微膠丸。所得復合微膠丸能夠克服胃酸的殺傷，有效保持免疫與微生態(tài)雙活性，降低制品在生產(chǎn)、使用過程中免疫牛初乳與雙歧桿菌的活性、數(shù)量及效價的損失，增強制品對人體的保健功能。
文檔編號A61K35/20GK101219152SQ20081005036
公開日2008年7月16日 申請日期2008年2月1日 優(yōu)先權日2008年2月1日
發(fā)明者劉景圣 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學