專利名稱：：人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種基因的克隆、新型真核表達載體的構建及其在血液系統疾病及腫瘤研究方面的應用。具體地，涉及從人肝臟組織中克隆"甲基鳥嘌呤甲基轉移酶"基因，構建含熒光蛋白的真核表達質粒，并將其應用于細胞的耐藥性研究。
背景技術：
：基因治療已成為腫瘤生物治療領域內最引人矚目的研究熱點，是繼手術、放療、化療及免疫治療之后的又一種極有前景的治療模式。腫瘤的基因治療包括多種技術與方法，如反義核酸阻斷技術、自殺基因導入等等。一種較新的策略是將耐藥基因(DrugResistanceGene)通過合適的載體導入正常組織細胞，從而增強正常細胞對化療藥物的抗藥性，借以擴大化療藥物安全劑量范圍并盡可能減少化療帶來的毒副作用。近年國內、外在腫瘤基因治療相關領域的研究結果顯示了基因治療的誘人前景。甲基鳥嘌呤甲基轉移酶(06-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)是存在于生物體內的一種特異性DNA修復酶，它能在DNA交聯形成前將烷化基團轉移到自身半胱氨酸殘基上，從而修復DNA分子上鳥嘌呤的損傷，同時MGMT在轉甲基后即發生不可逆地失活。目前的研究還未發現有其它蛋白質參與此過程，因此MGMT是決定細胞對烷化劑類藥物耐受的分子基礎。人MGMT基因定位于10q26，cDNA全長769bp，含有一個621bp的氨基酸編碼序列，表達含207個氨基酸的蛋白產物。MGMT的特點之一是在不需要任何輔助因子或蛋白質的條件下執行垸基轉移功能，這就賦與了MGMT作為耐藥基因用于基因治療研究的先天優勢。MGMT對烷化劑損傷的修復使它在腫瘤化療中發揮雙重作用一方面保護正常細胞免受烷化劑的損傷；另一方面引起腫瘤組織對烷化劑類化療藥物的耐藥性。在MGMT與腫瘤發生相關性方面，國外近年的研究表明MGMT基因失活在諸多癌癥發生過程中起著關鍵作用。正常情況下DNA修復酶對細胞具有抑制突變的保護作用。若各種原因造成MGMT表達降低或者出現基因沉默即不表達，則使細胞失去了DNA修復酶的保護作用，隨之惡性突變的發生機率明顯升高。若MGMT在腫瘤細胞中的高表達，會使腫瘤對垸化劑類化療藥物產生耐藥性進而使化療失敗。另一方面，正常組織細胞中若MGMT高表達，則表現為有益的保護作用。因此目前如何調控MGMT的表達而達到最佳化療效果己成為腫瘤治療中倍受關注的問題。在基因治療研究中表達載體的選擇很重要。必須選擇合適、有效而且對人體無危害的基因表達載體。目前常用的有逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關病毒載體、質粒及共軛DNA分子等。逆轉錄病毒載體可以整合入宿主DNA，持久表達目的基因，但隨機整合可能使宿主細胞產生插入突變和惡性變，且此種載體只能在細胞分裂期進行轉染，大大限制了其應用。腺病毒載體能定位于細胞核DNA并高水平表達外源DNA，但具免疫原性的特點限制了其應用。腺相關病毒載體具有先天缺陷，其可插入片段較小并有插入性突變的危險，大劑量使用時亦可引起宿主免疫反應。與之相比質粒載體具有穩妥可靠和操作簡便的優點，是目前基因轉染研究中較為常用的方法，且隨著細胞轉染技術的進步其應用將會更加廣泛。目前已有含MGMT基因的腺病毒載體及逆轉錄病載體構建成功并應于相關領域的研究。但如上所述，兩種載體都存在自身載體所具有的先天缺陷，且構建過程要求實驗條件較高，程序復雜，構建及轉染細胞成功率不高。兩種含有MGMT基因的載體亦不適于細胞瞬時轉染相關的實驗。本發明中采用了真核表達質粒pIRES2-EGFP作為載體。其本質是雙順反子真核表達質粒，進入多克隆位點內的外源基因與EGFP基因共同轉錄和翻譯，而翻譯出的EGFP與目的蛋白各具有獨自的空間結構和生理活性而不會形成融合蛋白。因為目的基因與標記基因(EGFP)共用一個啟動子，故所有表達標記蛋白EGFP的轉染細胞必然也同時表達目的蛋白MGMT。EGFP所編碼的增強熒光蛋白使得基因轉染后的檢測變得簡便而高效。EGFP是從生物發光水母體內提取的一種特殊熒光蛋白，由于其能在活細胞中直觀地觀察到，對細胞無毒性且能維持較長時間的穩定性，因此可以把EGFP作為標記基因用于陽性轉染克隆的篩選。pIRES2-EGFP另一特點是含新霉素抗性基因(Neo，)，其編碼產物是一種新毒素磷酸轉移酶(Neomycinphosphotransferase)，可以使G418失活。轉染pIRES2-EGFP陽性的細胞由于neo基因的存在故對G418具有抗性，可在含G418的培養基中存活，據此原理即可利用G418加壓篩選陽性轉染的細胞克隆。這也是利用MGMT基因真核表達質粒轉染構建K562/MGMT細胞株的理論基礎。目前化療仍是臨床治療腫瘤最主要手段之一。在殺滅腫瘤細胞的同時化療藥物對體內正常細胞亦產生不同程度的毒性作用，這在很大程度上限制了化療藥物在臨床上的應用。隨著現代分子生物學技術的不斷發展和完善，基因治療在腫瘤研究領域內的應用愈來愈廣泛。目前主要的研究方法是在基因水平改變各種與腫瘤發生相關的細胞因子或蛋白的表達，從而達到治療或協助治療腫瘤的目的，這也是本發明產生的初衷和所要達到的目的。本發明構建了含人肝臟組織MGMT基因的pIRES-MGMT-EGFP真核表達載體，并在此基礎上構建了K562/MGMT細胞株。通過白血病K562細胞和人外周血單個核細胞的耐藥實驗，闡述了該質粒載體在血液系統惡性疾病及腫瘤的基因治療方面的應用，為相關領域的研究提供了新的技術資源和手段。
發明內容本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒及其構建方法與應用。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒，轉染細胞后能表達出人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶，它具有SEQIDNO.1的核苷酸序列。一種上述人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒的構建方法，包括以下步驟(1)MGMT基因的克隆自行設計上游引物I:5，-GMTTCATGGACAAGGATTGT-3，及下游引物II:5，-GGTACCCATCCGATGCAGTGT-3，。利用RT-PCR，從人肝臟組織中獲得MGMT的cDNA并擴增。PCR優化條件如下預變性94""C5min，變性94°C30s，退火58。C90s，延伸72。C50s，共30個循環，終未延伸72。C5min。(2)克隆載體pGEM-T-MGMT的構建RT-PCR電泳結果出現的MGMT目的條帶用凝膠回收試劑盒回收，與pGEM-T載體按說明書連接，常規藍白斑實驗篩選陽性克隆，大腸桿菌擴增后利用質粒提取試劑盒提取pGEM-T-MGMT克隆載體。利用EcoRI和SalI雙酶切鑒定后進行序列測定，確定克隆的正確性。(3)真核表達載體pIRES-MGMT-EGFP的構建利用EcoRI和SalI分別酶切克隆載體pGEM-T-MGMT和表達載體pIRES2-EGFP，回收含MGMT片段和pIRES2-EGFP大分子線性片段，前者與后者按2:1的質量比利用T4DNA連接酶4-C過夜連接。連接產物轉化JM109細菌，含卡那霉素的LB培養基瓊脂平板培養。挑取陽性克隆擴增、提取質粒。EcoRI和NotI雙酶切鑒定并利用引物I及II進行PCR鑒定，證明構建成功。應用上述人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒構建出K562/MGMT細胞系K562是人紅白細胞白血病細胞株，具有很強的增殖功能。利用脂質體轉染法，將脂質體與質粒按l:l質量比對細胞進行轉染。轉染12小時后熒光顯微鏡下可見熒光蛋白表達。瞬時轉染48h后換用含G418濃度為400ug/ml的1640培養基篩選，以lxl06/ml密度接種6孔板。每三天更換含G418的培養基，篩選約三周，至抗性克隆形成，即為K562/MGMT細胞系。K562/MGMT的特征是K562細胞轉染了權力要求1中所述人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒，并處于加壓篩選后的穩定轉染狀態，高豐度表達MGMT，適用于MGMT及腫瘤相關的研究。一種上述人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒在耐藥基因研究中的應用。一種上述K562/MGMT細胞系在惡性血液病及腫瘤相關基因治療研究中的應用。本發明的有益效果是(1)本發明采用自行設計的引物，通優化的RT-PCR條件，克隆了人肝臟MGMT基因，為進一步有關MGMT基因的研究奠定了良好的實驗基礎。(2)本發明在基因克隆中所用的克隆載體pGEM-T和構建真核表達載體中所用的質粒載體pIRES2-EGFP，具有其他載體所不具備的優勢。尤其是pIRES2-EGFP載體，除了具有普通質粒載體的優點外，能在轉染后表達"增強熒光蛋白"，使得轉染后的檢測變得簡單快捷，高效準確。(3)本發明中采用的細胞轉染技術經過優化，達到了高效轉染。所用技術和轉染試劑為基礎醫學研究所廣泛采用，故使本發明具有易于推廣應用的優點。(4)本發明應用所構建的pIRES-MGMT-EGFP真核表達質粒轉染白血病細胞株K562后，檢測到MGMT蛋白大量表達，應用加壓篩選后形成了K562/MGMT細胞株，為相關的血液系統惡性疾病的研究提供了新的實驗資源。(5)本發明應用pIRES-MGMT-EGFP載體對人外周血單個核細胞進行了正常細胞的抗藥性實驗。在MGMT表達水平提高以后，相應地細胞對烷化劑的抗藥性有所提高，預示了該載體在人類疾病基因治療領域中良好的應用前景。(6)本發明各步所用方法使用常規分子物學實驗室設備即可完成，所構建的含人肝臟MGMT基因的真核表達質粒具有穩定的理化性質，轉染后具有高效表達的特點，適用于血液系統疾病、腫瘤治療以及基因治療等領域推廣應用。圖1是真核表達質粒pIRES2-EGFP的結構示意圖2是真核表達質粒pIRES-MGMT-EGFP的酶切鑒定圖，圖中M為Marker,1為酶切，2為未酶切；圖3是K562細胞轉染質粒pIRES-MGMT-EGFP48h時熒光蛋白(呈現綠色熒光)表達情況狀態圖4是轉染后三組K562細胞MGMT在mRNA水平的表達情況電泳圖，圖中M為Marker,1為未轉染組，2為轉染目的基因組，3為轉染空載體組；圖5是轉染后三組K562細胞MGMT蛋白的表達情況電泳圖；圖中1為轉染MGMT基因組，2為轉空載體組，3為對照組具體實施例方式本發明提供含人MGMT基因及增強熒光蛋白真核表達質粒的構建方法，同時提供了該質粒在生物醫學中應用的具體實驗方法。質粒pIRES-MGMT-EGFP的構建可在常規分子生物學實驗室完成，具有構建便捷、易于轉染細胞、易于檢測蛋白表達的特點。故具有可推廣性。具體構建及應用主要過程如下1.MGMT基因的克隆(1)總RNA的提取及RT-PCR:根據GeneBank公布的MGMTcDNA序列，自行設計上游引物I:5，-GAATTCATGGACMGGATTGT-3，下游引物II:5，-GGTACCCATCCGATGCAGTGT-3，其中引物I的5'端含有EcoRI酶切位點，引物II的5'端含有KpnI酶切位點。產物長度693bp。取新鮮肝臟組織利用Trizol提取總RNA，利用逆轉錄試劑盒按條件20°CxlOmin—37°Cx45min—95°Cx5min—4°Cx5min逆轉錄為cDNA后，用引物進行PCR擴增反應。PCR優化條件如下預變性94'C5min，變性94。C30s，退火58。C90s，延伸72。C50s，共30個循環，終未延伸72°C5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測MGMT目的片段，MGMT片段具有序列表SEQIDNo.1所示的基因序列。(2)克隆載體pGEM-T-MGMT的構建電泳結果出現MGMT目的條帶，凝膠回收試劑盒回收后與pGEM-T載體按說明書連接，利用常規藍白斑實驗篩選陽性克隆，JM109大腸桿菌擴增后利用質粒提取試劑盒提取pGEM-T-MGMT。利用EcoRI和SalI雙酶切鑒定后送上海生工生物工程公司測序。測序結果與GeneBank公布的序列(NM002412)完全一致，證明克隆成功。2.真核表達載體pIRES-MGMT-EGFP的構建利用EcoRI和SalI分別酶切克隆載體pGEM-T-MGMT和表達載體pIRES2-EGFP，回收含MGMT片段和pIRES2-EGFP大分子線性片段，前者與后者按2:1的質量比利用T4DNA連接酶4'C過夜連接。連接產物轉化JM109細菌，含卡那霉素的LB培養基瓊脂平板培養。挑取陽性克隆擴增、提取質粒。EcoRI和NotI雙酶切鑒定并利用引物I及II進行PCR鑒定，證明構建成功。3.真核表達載體pIRES-MGMT-EGFP在真核細胞的表達(1)在K562細胞中瞬時轉染與表達K562是人紅白細胞白血病細胞株，具有很強的增殖功能。利用脂質體轉染試劑盒，脂質體與質粒按l:l(經實驗優化的方案)質量比進行轉染。轉染12小時后熒光顯微鏡下可見熒光蛋白表達，24-48小時達到明亮狀態。利用RT-PCR及常規WesternBlot檢測48h時MGMT基因的mRNA和蛋白表達水平。(2)K562/MGMT細胞系的構建瞬時轉染48h后換用含G418(篩選濃度400ug/ml)的1640培養基，以lxl0Vml密度接種6孔板。每三天更換含G418(篩選濃度400yg/ml)的培養基，篩選約三周至抗性克隆形成，即為K562/MGMT細胞系。經篩選的K562/MGMT可直接用于相關醫學實驗或保存于液氮中備用。4.pIRES-MGMT-EGFP相關的耐藥基因研究(l)轉染K562細胞后的耐藥性改變以硝卡芥作為實驗用藥。取K562/MGMT細胞、轉空載體(細胞株的構建步驟同K562/MGMT)細胞及未轉染細胞分為三組，分別加入不同濃度硝卡芥(1000ug/ml、100Pg/ml、10ixg/ml、lug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml、0.001ug/ml)，培養72小時利用MTT法測定細胞的IC50值及耐藥指數(RF值)。(2)轉染人外周血單個核細胞(PBMC)后的保護作用以硝卡芥作為實驗用藥。原代培養PBMC并常規激活，進行瞬時轉染，分為轉目的基因組(pIRES-MGMT-EGFP)、轉空載體組(pIRES2-EGFP)及未轉染細胞組，分別加入不同濃度硝卡芥(秦0pg/ml、細ug/ml、10iig/ml、lug/ml、0.liig/ml、0.01ug/ml、0.001yg/ml),培養72小時利用MTT法測定細胞的IG。值及耐藥指數(RF值)。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>K562細胞及PBMC細胞耐藥實驗結果如上表所示。兩者RF顯示其對烷化劑的耐藥性均有不同程度的增高，且以K562細胞明增。K562細胞體現了轉染后對化療藥物耐藥性的增強。PBMC體現了MGMT基因對正常細胞免受烷化劑損傷的保護作用。本發明從人肝臟中克隆了耐藥基因MGMT的cDNA并重組構建了真核表達質粒pIRES-MGMT-EGFP。含人MGMT基因的病毒載體國外有個別報道，同時含有增強熒光蛋白的質粒真核表達載體的構建國內、外均無先例。在質粒構建成功后又利用該質粒構建了K563/MGMT細胞株，并檢測了真核細胞在轉染該質粒后的耐藥性改變，為血液病及腫瘤領域的研究提供了新的研究手段。上面的陳述己將本發明中主要內容和關鍵點闡明，相信能使從事生命科學研究和實驗醫學研究的科研人員最大限度的認識和了解本發明。序列表<110>浙江大學〈120〉人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒及其構建方法與應用〈160〉1〈170>Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉693<212〉麗<213〉人體肝臟〈400>1gaattcatggacaaggattgtgaaatgaei3cgceicc3C3ctggacagccctttggggaag60ctggagctgtctggttgtgagcagggtctgC3cgaaataaagctcctgggca鄉ggacg120tctgcagctgatgccgtggaggtcccagcccccgctgcggttctcggaggtccggagccc180ctgatgcagtgC3C3gCCtggctgaatgcctatttccaccagcccgaggctatcgaagag240ttccccgtgccggctcttcaccatcccgttttccagcaag3gtcgttcaccagacaggtg300ttatggaagctgctgaaggttgtgaaattcgg6lg犯gtg3tttcttaccagcaattagca360gccctggcaggc肪cccca3agccgcgcgagC3gtggg3ggagcaatgagaggcaatcct420gtccccatcctcatcccgtgccacagagtggtctgcagcagcggagccgtgggcaactac480tccggaggactggccgtgaaggaatggcttctggcccatgaaggccaccggttggggaag540ccaggcttgggagggagctcaggtctggcaggggcctggctcaagggagcgggagctacc600tcgggctccccgcctgctggccgaaactgagtatgtgcagt鄉eitggatgtttgagcga660cacacacgtgtaacactgcatcggatgggt3CC69權利要求1.一種人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒，轉染細胞后能表達出人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶，其特征在于它具有SEQIDNO.1的核苷酸序列。2.—種權利要求1所述人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)MGMT基因的克隆自行設計上游引物I:5，-GAATTCATGGACMGGATTGT-3，及下游引物II:5，-GGTACCCATCCGATGCAGTGT-3，。利用RT-PCR，從人肝臟組織中獲得MGMT的cDNA并擴增。PCR優化條件如下預變性94。C5min，變性94°C30s，退火58。C90s,延伸72。C50s，共30個循環，終未延伸72°C5min。(2)克隆載體pGEM-T-MGMT的構建RT-PCR電泳結果出現的MGMT目的條帶用凝膠回收試劑盒回收，與pGEM-T載體按說明書連接，常規藍白斑實驗篩選陽性克隆，大腸桿菌擴增后利用質粒提取試劑盒提取pGEM-T-MGMT克隆載體。利用EcoRI和SalI雙酶切鑒定后進^1序列測定，確定克隆的正確性。(3)真核表達載體pIRES-MGMT-EGFP的構建利用EcoRI和SalI分別酶切克隆載體pGEM-T-MGMT和表達載體pIRES2-EGFP，回收含MGMT片段和pIRES2-EGFP大分子線性片段，前者與后者按2:1的質量比利用T4DNA連接酶4'C過夜連接。連接產物轉化JM109細菌，含卡那霉素的LB培養基瓊脂平板培養。挑取陽性克隆擴增、提取質粒。EcoRI和NotI雙酶切鑒定并利用引物I及II進行PCR鑒定，證明構建成功。3.—種應用權利要求1所述人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒構建出的K562/MGMT細胞系，其特征在于，由以下方法實現K562是人紅白細胞白血病細胞株，具有很強的增殖功能。利用脂質體轉染法，將脂質體與質粒按1:1質量比對細胞進行轉染。轉染12小時后熒光顯微鏡下可見熒光蛋白表達。瞬時轉染48h后換用含G418濃度為400ug/ml的1640培養基篩選，以lx106/ml密度接種6孔板。每三天更換含G418的培養基，篩選約三周，至抗性克隆形成，即為K562/MGMT細胞系。K562/MGMT的特征是K562細胞轉染了權力要求1中所述人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒，并處于加壓篩選后的穩定轉染狀態，高豐度表達MGMT，適用于MGMT及腫瘤相關的研究。4.一種權利要求1所述人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶基因真核表達質粒在耐藥基因研究中的應用。5.—種權力要求3所述的K562/MGMT細胞系在惡性血液病及腫瘤相關基因治療研究中的應用。全文摘要本發明公開了一種含人甲基鳥嘌呤甲基轉移酶(MGMT)基因真核表達質粒的構建方法及其在耐藥基因研究中的應用。具本包含了利用RT-PCR從人肝臟組織中獲得MGMT基因的cDNA，克隆入T載體。與含增強熒光蛋白的真核表達質粒酶切重組，構建含人MGMT基因的真核表達質粒。轉染K562細胞加壓篩選構建K562/MGMT穩定轉染細胞系。本發明還包括了該質粒在改變腫瘤細胞和正常細胞耐藥性方面的應用。本發明所提供的質粒構建方法基于常規的細胞與分子生物學實驗條件，無需大型和復雜實驗設施。操作簡便，安全高效。所構建的質粒具有良好的理化穩定性，轉染細胞后易于檢測，高豐度表達。本發明為MGMT相關的耐藥基因研究以及腫瘤的基因治療研究提供了新的實驗資源與手段，具有較好的推廣與應用價值。文檔編號A61K48/00GK101386869SQ200810063050公開日2009年3月18日申請日期2008年7月8日優先權日2008年7月8日發明者李棟博,王季石,胡申江申請人:浙江大學