專利名稱：北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜合提取方法
技術領域：
本發明涉及中草藥中有效成分的提取方法，特別涉及北冬蟲夏草 菌絲體中多種有效成分的綜合提取方法。
背景技術：
蟲草是一類具有顯著醫療保健功效的食藥用真菌，其中最著名的是冬蟲夏草(Cor辦ce戸w力e/w&)。由于冬蟲夏草生境特殊、寄主專一， 人工培養難度很大，加之濫采濫挖造成的資源破壞，使冬蟲夏草的價 格嚴重背離了本身價值。在蟲草屬中最有可能代替冬蟲夏草的是北蟲 草(Cor辦ce戸/m7/ton's)，又稱北冬蟲夏草、蛹蟲草。北蟲草是冬蟲夏 草的近緣種，也是蟲草屬的模式種，北蟲草是優良的藥材和冬蟲夏草 替代品。北蟲草菌粉在我國作為一類新藥(中藥)以獲得國家藥品監 督管理局批準進入臨床，產品標識具有補肺益腎、止咳化痰之功效， 能夠調節機體免疫功能，提高機體綜合抗病能力，主要用于慢性支氣 管炎、各種腫瘤及其它免疫系統疾病的治療，主要原因是北蟲草中含 有大量的生物活性物質，主要有蟲草甾醇(麥角甾醇、P-谷甾醇等)、 蟲草多糖、蟲草素及甘露醇、腺苷、多種氨基酸、維生素和無機鹽等。 蟲草中的甾醇類成分已鑒定的有P-谷甾醇、麥角甾醇等。甾醇能阻斷膽固醇的吸收，降低機體及血液中膽固醇的含量，防止高膽固醇血癥的形成，從而防止動脈粥樣硬化、靜脈血栓的發生保證人體健康；具有類似于羥基保泰松或氫化可的松的抗炎作用，還可以阻斷致癌物誘 發癌癥的形成，同時在皮膚營養和保護方面都有良好的生理效能，總 之具有防癌、治療、減毒及營養保護等作用。蟲草多糖是蟲草中含量 最高的生物活性物質，大量醫學證實，蟲草多糖對單核巨噬細胞系統 有增強作用，對細胞免疫功能具有調節作用，能增強體液免疫功能， 可活化巨噬細胞剌激抗體產生，提高人體免疫能力，并具有降血糖、 抗腫瘤及對肝損傷具有保護作用，并可作為抗輻射保護劑。蟲草素又 稱蟲草菌素，它是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素，是一種 具有多種生物活性的核苷類物質，具有抗病毒、抗菌，明顯抑制腫瘤生長，干擾人體RNA及DNA合成的作用，在臨床上可用于治療癌癥、 白血病、有擴張支氣管，顯著增強腎上腺激素和抗衰老等作用。北蟲草中的有效成分提取方法較多，但幾乎都只側重于蟲草素、 蟲草多糖和蟲草酸等單方面的提取方法上或是簡單地對蟲草素和蟲草 多糖的復合提取進行了研究，然而對其他成分，如蟲草甾醇、維生素、 色素類等，作為雜質除去或不予考慮忽略掉了，這樣就造成資源利用 不充分從而造成巨大的資源浪費。申請號為200610023578.4的中國專 利提供了一種連續提取北冬蟲夏草子實體有效成分的方法涉及甾醇 類、蟲草多糖和蟲草素的綜合提取，但是其仍有以下缺陷原料為北 蟲草子實體，這樣成本較高；其所采用的甾醇類的超臨界萃取以及蟲草素的正相低壓硅膠色譜和制備型反相高效液相色譜等純化方法，操作步驟多，過于復雜等， 一般中小企業很難實現；其制備得到的甾醇、蟲草多糖沒有進一步純化處理，純度不高。發明內容本發明的目的是提供了一種節省原料、提取充分、純度較高并且 操作簡單的北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜合提取方法。采用 的技術方案如下 (1)蟲草甾醇的提取粉碎取新鮮北冬蟲夏草菌絲體置于低于95"C的環境條件下干燥， 干燥的菌絲體使用粉碎機進行粉碎至粉末狀；所述的北冬蟲夏草菌絲體包括液體發酵菌絲體、固體培養菌絲體、栽培子實體及子實體收獲后的下腳料或其混合物；提取向干燥、粉碎后的北冬蟲夏草菌絲體中加入有機溶劑，按每1克菌絲體加入3 40毫升有機溶劑，30 95。C下提取0. 5 5小時， 過濾，得濾液，重復提取1 4次；將每次濾液混合，殘留物備用；其 中所述的有機溶劑是正已垸、正丁烷、環己垸、丙酮或石油醚中的一 種；濃縮將濾液在溫度30 95°C、常壓或減壓下濃縮至無有機溶劑 味，回收有機溶劑，得濃縮物；皂化常溫下每1克濃縮物中加入0.2 5毫升堿性溶液，混勻， 靜置0.5 24小時，除去下層可皂化物，得不皂化液，重復皂化1 3次，其中所述的堿性溶液是濃度為1%至50%的氫氧化鈉或氫氧化鉀 溶液；萃取向不皂化液中加入0.2 10倍體積的有機溶劑，混勻，靜 置0.5 24小時，分取有機溶劑層，得萃取液，重復萃取1 5次，其 中所述的有機溶劑是正已烷、正丁垸、環己垸、丙酮或石油醚中的一 種；干燥將萃取液在30 95'C下常壓或減壓濃縮至無有機溶劑味， 回收有機溶劑，濃縮物經干燥處理后，即得到蟲草甾醇。 (2)蟲草多糖的提取提取將步驟(1)提取后所得的殘留物加水，按每l克殘留物加 入3 20毫升水，混勻，50 10(TC提取0.5 4小時，過濾，得濾液 和水提殘留物，重復提取1 4次；水提殘留物可作飼料；濃縮:將濾液在50 10(TC、減壓或常壓濃縮至原體積的1/3 1/8，得濃縮液；第一次醇沉向濃縮液中加入2 6倍體積的乙醇，置于-15 40。C 下0. 5 48小時；過濾將醇沉溶液過濾，可得濾液和濾餅，濾餅為粗蟲草多糖；除蛋白將粗蟲草多糖溶于O. 1 10倍體積水后，再加入0.5 3 倍體積的Sevage試劑除蛋白，重復1 6次；第二次醇沉經過除蛋白的粗蟲草多糖液中加入2 5倍體積的乙 醇，置于-15 40。C下0. 5 24小時;過濾將醇沉溶液過濾，得濾液和濾餅；干燥濾餅置于25 10(TC下烘干，可得高純度的蟲草多糖。 (3)蟲草素的提取濃縮取步驟(2)兩次醇沉后的濾液混合在40 8(TC、常壓或減 壓下濃縮至無醇味，得濃縮液；調pH:取濃縮液用酸性溶液調pH至1.5 6.0，其中所述的酸性 溶液是濃度為1%至50%的鹽酸或硫酸溶液；柱層析選取陽離子交換樹脂，裝柱，按說明書預處理樹脂；將 上述pH調好的濃縮液上陽離子交換柱，然后用堿性溶液洗脫，收集堿 性溶液洗脫液，其中所述的堿性溶液是0. 05 5. Omol/L的氨水溶液； 選取的陽離子交換樹脂可以是苯乙烯系大孔強酸性陽離子交換樹脂、 苯乙烯系凝膠強酸性陽離子交換樹脂等；結晶將洗脫液在50 100。C、常壓或減壓下濃縮至干，加熱乙醇 溶解，置于-15 25'C中結晶，收集晶體，置于25 10(TC烘干，得高 純度蟲草素晶體。步驟(1)所述蟲草甾醇的提取方法優選回流提取法，也可采取浸 提法、超聲或微波提取法等。步驟(2)所述蟲草多糖的提取方法可以用水熱回流法、熱水浸提 法、超聲或微波提取法等，本發明優選水熱回流法。步驟(2)所述的分離濾液和濾餅的方法可以用過濾法或離心法， 本發明優選過濾法。通過采用本發明技術方案實現了北冬蟲夏草菌絲體中蟲草甾醇、蟲草 多糖、蟲草素等主要三大類有效成分的綜合提取，而且最終殘留物可 作為優質的動物詞料。附圖1清晰地顯示了這三類有效成分綜合提取 的方法流程。為證實所得提取物的純度，我們對蟲草素的純度進行了分析通 過732陽離子交換樹脂、結晶等技術進行純化處理；其中732陽離子 交換樹脂處理步驟為，將含蟲草素溶液用HC1調pH為2上柱，用0. 15 mol/L氨水洗脫，收集氨水洗脫液，在205nm下檢測蟲草素的液相純度 達74.0% (見附圖2);再將收集液經過濃縮、乙醇溶解、結晶等步驟 獲得晶體，取晶體溶于水中進行高效液相色譜分析，在205nm下檢測 蟲草素的液相純度(見附圖3)，從圖中可見，幾乎所有的雜質都被除 去，此時蟲草素的純度已達98%以上。本發明技術和工藝主要表現在以下幾點①本發明利用有機溶劑 將弱極性的甾醇類有效成分提取出來，所用原料包括液體發酵菌絲體、 固體培養菌絲體、栽培子實體及子實體收獲后的下腳料，而己有其他 的技術都有將這部分成分作為雜質除去，基本上以蟲草子座(子實體) 為原料，價格昂貴，成本高；本發明充分利用了資源，避免浪費；這 是本發明的一個亮點。②在提取蟲草多糖或蟲草素方面，現有技術先 大多采用乙醇提取、再水提、再用乙醇沉淀，這樣要浪費大量的乙醇， 生產成本較高；而本發明則是先水提、濃縮、再用醇析，這樣節約乙 醇用量而且一次性就能得到蟲草多糖和蟲草素，與其相比生產成本大降低。③已有的工藝提取蟲草多糖的含量較低，而本發明提取的蟲草多糖含量大于90%。④大多數已有的工藝方法是單一或兩種成分簡 單復合提取，提取后在進行一系列的純化工作，操作繁瑣；⑤大多數 已有技術得到的產品純度不高，而本發明得到的蟲草甾醇、蟲草多糖 和蟲草素等三類產品純度均較高，其中蟲草素的純度高達98%，分別 是無色、灰白色和白色晶體。本發明的有益效果是所用原料上及提取過程中節約了成本，北蟲 草中的多種有效成分提取充分，經過反復提取、去除雜質使所得提取 物純度較高，并且操作簡單，能實現多種有效成分的綜合提取。


圖1是北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜合提取方法的工藝流 程2是陽離子交換樹脂處理洗脫液高效液相圖譜 圖3是結晶純品高效液相圖譜具體實施方式
(共3例)實施例1: (1)蟲草甾醇的提取粉碎取新鮮北冬蟲夏草固體培養菌絲體1000克置于5(TC烘箱烘 干至恒重，干燥的菌絲體使用粉碎機進行粉碎；提取在粉碎的100克菌絲體中加入1000毫升正丁垸，4(TC下提 取2小時，過濾，得濾液，重復提取3次，殘留物備用；濃縮將濾液在4(TC下常壓濃縮至無正丁垸味，得濃縮物，回收正丁烷；皂化在常溫下向濃縮物加入其2倍體積的10。^的氫氧化鈉溶液， 混勻，靜置2小時，除去下層可皂化物，得不皂化液，重復2次；萃取加入不皂化液3倍體積的正丁烷，混勻，靜置2小時，萃 取，取正丁垸液，重復3次；干燥將上述萃取液在4(TC下常壓濃縮至無正丁烷味，回收正丁烷，濃縮物經干燥處理后，得0.56克蟲草甾醇。 (2)蟲草多糖的提取提取將步驟(1)提取后的殘留物加水，殘留物與水重量體積比1: 20，混勻，95"C提取3小時，重復提取2次；過濾將水提殘留物過濾，得到濾液和濾餅，濾餅可作詞料，將濾液在85。C減壓濃縮至原體積的1/4左右；第一次醇沉在濃縮后的濾液中加入3倍體積的乙醇，置于-4°C 下24小時；過濾將醇沉溶液過濾，可得含蟲草素的濾液和含蟲草多糖的濾 餅，濾餅為粗蟲草多糖，濾液備用；除蛋白粗蟲草多糖沉淀溶于2倍體積水后，再加入加水量3倍 體積的Sevage試劑(氯仿與正丁醇的體積比是4: 1)除蛋白，重復2次；第二次醇沉將除蛋白的粗蟲草多糖液中加入3倍體積的乙醇，置于-4'C下24小時；過濾將醇沉溶液過濾，濾餅置于65'C烘干，得3.4克蟲草多糖。 (3)蟲草素的提取濃縮取步驟(2)兩次醇沉后的濾液混合，在65T:下減壓濃縮至 無醇味；調pH:取濃縮液用10X鹽酸溶液調pH至2.0， pH計跟蹤檢測；柱層析732陽離子交換樹脂按說明書預處理；然后將上述pH調好的濃縮液上732陽離子交換柱，然后用0. lmol/L氨水溶液洗脫，收 集洗脫液；結晶將洗脫液濃縮，加熱乙醇溶解，置于-4。C中結晶，收集晶體， 置于45"C烘干，得0.2克蟲草素。實施例2: (1)蟲草甾醇的提取粉碎取新鮮北冬蟲夏草液體發酵培養的菌絲體12000克置于 65"C烘箱烘干至恒重，使用粉碎機粉碎；提取準確稱取粉碎的菌絲體1000克加入8升正己烷，65'C下提 取3小時，過濾，得濾液，重復提取2次，殘留物備用；濃縮將提取濾液在50。C減壓濃縮至無正己垸味，得濃縮液；皂化上述濃縮液在常溫下加入濃縮液3倍體積的10%的氫氧化鈉溶液，混勻，靜置4小時，除去下層可皂化物，得不皂化液，重復皂化2次；萃取加入不皂化液3倍體積的正己烷進行萃取，混勻，靜置2 小時，重復萃取3次；干燥將上述有機溶劑萃取液在5(TC下減壓濃縮至無正己垸味，回收正己烷，濃縮物經干燥處理后，即得到4.7克蟲草甾醇。(2) 蟲草多糖的提取提取將步驟(1)提取后的殘留物加水，殘留物與水重量體積比1: 8，混勻，9(TC提取3小時，重復提取2次；過濾將水提殘留物過濾，得到濾液和濾餅，濾餅用作詞料，將濾液在85"C減壓濃縮至原體積的1/5;第一次醇沉在濃縮后的濾液中加入3倍體積的乙醇，置于-4t:下12小時；過濾將醇沉溶液過濾，可得含蟲草素的濾液和含蟲草多糖的濾 餅，濾餅為粗蟲草多糖；除蛋白粗蟲草多糖沉淀溶于2倍體積水后，再加入加水量l倍 體積的Sevage試劑(氯仿與正丁醇的體積比是5: 1)除蛋白，重復3 次；第二次醇沉將除蛋白的粗蟲草多糖液中加入3倍體積的乙醇， 置于-4'C下12小時；過濾將醇沉溶液過濾，濾餅置于6(TC烘干，得蟲草多糖28.3 克。 -(3) 蟲草素的提濃縮取步驟(2)兩次醇沉后的濾液混合減壓濃縮至無醇味；調pH:取濃縮液用10%的鹽酸溶液調pH至2. 5;柱層析732陽離子交換樹脂按說明書預處理；將上述調好pH的濃縮液上該陽離子交換柱，然后用O. lmol/L氨水洗脫，收集洗脫液；結晶將洗脫液濃縮，加熱乙醇溶解，置于-4。C中結晶，收集晶體，置于45'C烘干，得1.6克高純度蟲草素。實施例3:(1) 蟲草甾醇的提取粉碎取栽培北冬蟲夏草子實體收獲后的下腳料9000克置于65°C 烘箱烘干至恒重，使用粉碎機粉碎；提取稱取粉碎的下腳料1000克加入8升石油醚，65"C下提取3 小時，過濾，得濾液，重復提取2次，殘留物備用；濃縮將提取濾液在5(TC減壓濃縮至無石油醚味，得濃縮液；皂化上述濃縮液在常溫下加入濃縮液3倍體積的10%的氫氧化 鈉溶液，混勻，靜置4小時，除去下層可皂化物，得不皂化液，重復皂化2次；萃取加入不皂化液3倍體積的石油醚進行萃取，混勻，靜置2 小時，重復萃取3次；干燥將上述有機溶劑萃取液在5(TC下減壓濃縮至無石油醚味，回收石油醚，濃縮物經干燥處理后，即得到5.7克蟲草甾醇。(2) 蟲草多糖的提取提取將步驟(1)提取后的殘留物加水，殘留物與水重量體積比 1: 8，混勻，98"C提取2小時，重復提取2次；過濾將水提殘留物過濾，得到濾液和濾餅，濾餅用作飼料，將 濾液在85'C減壓濃縮至原體積的1/5;第一次醇沉在濃縮后的濾液中加入3倍體積的乙醇，置于-4'C 下12小時；過濾將醇沉溶液過濾，可得含蟲草素的濾液和含蟲草多糖的濾 餅，濾餅為粗蟲草多糖；除蛋白粗蟲草多糖沉淀溶于2倍體積水后，再加入加水量l倍體積的Sevage試劑(氯仿與正丁醇的體積比是3: 1)除蛋白，重復3 次；第二次醇沉將除蛋白的粗蟲草多糖液中加入3倍體積的乙醇， 置于-4"C下12小時；過濾將醇沉溶液過濾，濾餅置于6(TC烘干，得蟲草多糖42.5克。(3)蟲草素的提取 濃縮取步驟(2)兩次醇沉后的濾液混合，減壓濃縮至無醇味； 調pH:取濃縮液用10X的鹽酸溶液調pH至3.0;柱層析732陽離子交換樹脂按說明書預處理；將上述調好pH的濃縮液上該陽離子交換柱，然后用O. lmol/L氨水洗脫，收集洗脫液；結晶將洗脫液濃縮，加熱乙醇溶解，置于-4"C中結晶，收集晶體，置于45-C烘干，得3.2克高純度蟲草素。
權利要求
1、一種北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜合提取方法，其特征是按以下步驟進行(1)蟲草甾醇的提取提取向干燥、粉碎后的北冬蟲夏草菌絲體中加入有機溶劑，按每1克菌絲體加入3～40毫升有機溶劑，30～95℃下提取0.5～5小時，過濾，重復提取1～4次，將每次所得的濾液混合，殘留物備用；其中所述的有機溶劑是正己烷、正丁烷、環己烷、丙酮、石油醚中的一種；濃縮將濾液在溫度30～95℃、常壓或減壓下濃縮至無有機溶劑味，回收有機溶劑，得濃縮物；皂化常溫下每1克濃縮物中加入0.2～5毫升堿性溶液，混勻，靜置0.5～24小時，除去下層可皂化物，得不皂化液，重復皂化1～3次，其中所述的堿性溶液是濃度為1％至50％的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液；萃取向不皂化液中加入0.2～10倍體積的有機溶劑，混勻，靜置0.5～24小時，分取有機溶劑層，得萃取液，重復萃取1～5次，其中所述的有機溶劑是正己烷、正丁烷、環己烷、丙酮、石油醚中的一種；干燥將萃取液在30～95℃下常壓或減壓濃縮至無有機溶劑味，回收有機溶劑，濃縮物經干燥處理后，得蟲草甾醇；(2)蟲草多糖的提取提取將步驟(1)提取蟲草甾醇后的殘留物加水，按每1克殘留物加入3～20毫升水，混勻，50～100℃提取0.5～4小時，過濾，得濾液和水提殘留物，重復提取1～4次；濃縮將濾液在50～100℃、減壓或常壓下濃縮至原體積的1/3～1/8，得濃縮液；第一次醇沉向濃縮液中加入2～6倍體積的乙醇，置于-15～40℃下0.5～48小時；過濾將醇沉溶液過濾，可得濾液和濾餅，濾餅為粗蟲草多糖；除蛋白將粗蟲草多糖溶于0.1～10倍體積水后，再加入0.5～3倍體積的Sevage試劑除蛋白，重復1～6次；第二次醇沉經過除蛋白的粗蟲草多糖液中加入2～5倍體積的乙醇，置于-15～40℃下0.5～24小時；過濾將醇沉溶液過濾，得濾液和濾餅；干燥將濾餅置于25～100℃、減壓或常壓下烘干，得高純度蟲草多糖。(3)蟲草素的提取濃縮取步驟(2)兩次醇沉后的濾液混合，在40～80℃、常壓或減壓下濃縮至無乙醇味，得濃縮液；調pH取濃縮液用酸性溶液調pH至1.5～6.0，其中所述的酸性溶液是濃度為1％至50％的鹽酸或硫酸溶液；柱層析選取陽離子交換樹脂，裝柱，按說明書預處理樹脂；將上述pH調好的濃縮液上陽離子交換柱，然后用堿性溶液洗脫，收集堿性溶液洗脫液，其中所述的堿性溶液是0.05～5.0mol/L的氨水；結晶將洗脫液在50～100℃、常壓或減壓下濃縮至干，加熱乙醇溶解，置于-15～25℃中結晶，收集晶體，置于25～100℃烘干，得高純度蟲草素。
2、 如權利要求1所述的北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜合 提取方法，其中步驟(1)所述的北蟲草菌絲體包括液體發酵菌絲體、 固體培養菌絲體、栽培子實體及子實體收獲后的下腳料或其混合物。
3、 如權利要求1所述的北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜合 提取方法，其中步驟(2)除蛋白所用Sevage試劑的組份氯仿與正丁 醇的體積比是2 8: 1。
4、 如權利要求3所述的北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜合 提取方法，其中步驟(2)除蛋白所用Sevage試劑的組份氯仿與正丁 醇的體積比是4: 1。
5、如權利要求1所述的北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜 合提取方法，其中步驟(3)所述的陽離子交換樹脂是苯乙烯系強酸 性凝膠型陽離子交換樹脂。
全文摘要
本發明提供了一種北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜合提取方法。將干燥粉碎的北冬蟲夏草菌絲體先用有機溶劑提取、過濾，得濾液和殘留物；將濾液濃縮回收溶劑，濃縮液經皂化、萃取、干燥，可得蟲草甾醇；將殘留物用水提取、過濾，濾液經濃縮、醇沉、離心，得沉淀物和上清液；將沉淀物溶解于水中進行除蛋白等操作，可得蟲草多糖；將離心上清液通過離子交換樹脂柱、結晶等手段，可得蟲草素。該方法節省原材料，所得提取物純度較高，成本較低，操作簡單，能實現北冬蟲夏草菌絲體中多種有效成分的綜合提取。
文檔編號A61K36/06GK101229199SQ20081006924
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月15日 優先權日2008年1月15日
發明者劉洪波, 偉 葉, 朱華李, 毛先兵 申請人:重慶和潤生物工程有限公司