專利名稱：血腦屏障穿透性促紅細胞生成素及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種促紅細胞生成素及其應用，具體地說是一種血腦屏障穿透 性促紅細胞生成素及其應用，屬于生物制藥領域。
背景技術：
近年來，促紅細胞生成素(EP0)己經成為在缺血性腦卒中神經保護治療方 面最有前景的藥物之一。在體外和體內的缺血損傷模型的研究中，EP0都顯示具 有強烈的神經保護作用。最近， 一個應用EPO治療急性腦卒中的臨床試驗證明 EPO可以減少腦卒中患者腦梗死面積，促進神經功能的恢復。因此，在腦卒中治 療中，尤其對錯過治療時間窗，不適合應用組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑治 療的患者，EPO顯示了一個潛在的令人鼓舞的臨床應用前景。但是，EP0的臨床 應用也面臨著一個重大的挑戰如何能更有效地使EP0穿透血腦屏障(BBB) EP0 通過與神經元的受體結合而發揮作用，而EPO與神經元的結合能力遠遠低于EP0 與紅母細胞的結合能力，約為其千分之一。此外，由于BBB的作用，注射到體 內的EPO只有大約P/。穿過BBB而進入大腦，所以，要使EPO在腦內達到有效濃 度，須加大注射劑量。臨床上己報道用于治療腦卒中的EP0劑量為33000U/次， 每天一次，此劑量遠遠高于治療貧血的維持劑量3500U/次，每周兩次。實驗室 用于治療腦卒中的劑量則更高，為5000U/kg體重。此外，EPO在血液中的半衰 期短，需要多次注射才能維持其神經保護作用。大劑量，反復多次注射EPO可 能致使其紅細胞比容增加[8]，刺激血小板生成，增加微小梗塞灶，形成大梗死灶 的危險性亦增加，從而，嚴格地限制甚至阻止了 EP0在腦卒中治療中的應用。 因此，通過促進或增加EPO穿透BBB的能力，將大大降低EPO的用量，從而， 降低EP0的促紅細胞生成作用和其他潛在副作用，大大地增進EP0在腦卒中治 療中臨床應用的可能。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種對血腦屏障具有穿透性的促紅細胞 生成素。
本發明要解決的另一個技術問題是提供促紅細胞生成素在制備治療缺血性腦卒中神經保護治療藥物中的應用。
為實現上述目的，本發明采用以下技術方案 血腦屏障穿透性促紅細胞生成素，在野生型EP0或野生型EP0衍生物的羧基 末端連接有具有蛋白轉導功能的蛋白轉導序列(PTD)。蛋白轉導序列包括
(1) HIV TAT;
(2) 由5-10個精氨酸組成的多聚精氨酸；
(3) 果蠅控制觸角基因的同源結構域；
(4) 單純皰疹病毒VP22。
所述HIVTAT標記為含有11個氨基酸殘基RGRKKRRQRRR的肽或來自HIV TAT
的其它肽段。
所述野生型EPO的氨基酸序列為序列表SEQ ID No. 2;成熟的人類促紅細胞 生成素氨基酸序列為序列表SEQ ID No. 3;具有蛋白轉導功能的人類促紅細胞生 成素氨基酸序列為序列表SEQ ID No. 4;具有蛋白轉導功能的突變型人類促紅細 胞生成素氨基酸序列為序列表中SEQ ID No. 5至No. 11。
所述野生型EPO的衍生物包括由氨基酸定點突變而產生的突變型EPO、甲酰 化EPO(Carbamylated EPO)、或無唾液酸EPO(asiaoerythropoietin EPO)。
所述的血腦屏障穿透性促紅細胞生成素在制備藥物中的應用，所述藥物是治 療腦卒中、急性心肌梗死、外傷性腦損傷、脊髓損傷、急性外傷性器官損傷、 急性中毒、急性器官衰竭以及麻醉意外、外傷或疾病引起的呼吸或心跳暫停而 引起的全身器官衰竭的藥物。
我們構建了表達EPO-TAT融合蛋白和二氫葉酸還原酶(DHFR)的雙順反子 質粒，將此載體導入DHFR缺失的中國倉鼠細胞后，用DHFR的相似體氨甲喋林 進行篩選，誘導，擴增導入的DNA，使蛋白表達倍增。簡而言之，用PCR方法將 HIV的TAT加至EPO cDNA的3，端，同時引入六個組氨酸殘基組成的his-6標 記，用于分離、純化EPO-TAT融合蛋白。PCR擴增的EPO-TAT-his-6用EcoRV 和EcoRI消化后插入pIRES-EYFP質粒(Clontech, Mountain View, USA )，然 后用鼠的(DHFR)置換EYFP，詳細步驟見下述具體實施方式
實施例1 。
EPO是一種糖基化蛋白，只有糖基化的EPO才有生物學活性。大腸桿菌由于 缺乏糖基化的酶而不具有糖基化機制。因此，為獲得適當的糖基化作用，EPO
4需在哺乳動物體系里表達。最常用的體系是缺乏DHFR的CHO細胞，此細胞由于 缺乏DHFR，可用DHFR類似物氨甲喋林進行選擇性擴增導入的DNA。詳細步驟見
實施例2。
人類EP0cDNA(序列SEQ ID No. l)編碼193個氨基酸(序列SEQ ID No. 2)， EPO初級蛋白合成后，其氨基端含27個氨基酸殘基的信號肽經切割后變為成熟 EPO(序列SEQ ID No. 3)。 因此成熟的人類EPO為166個氨基酸。本發明所采 用的野生型EPO的氨基酸序列為序列表SEQ ID No. 2;成熟的人類促紅細胞生成 素氨基酸序列為序列表SEQ ID No. 3;具有蛋白轉導功能的人類促紅細胞生成素 氨基酸序列為序列表SEQ ID No. 4;具有蛋白轉導功能的突變型人類促紅細胞生 成素氨基酸序列為序列表中SEQ ID No. 5至No. 11。
本發明的優點與效益在于本發明己經建立了一個穩定的哺乳動物細胞株， 它可以產生和分泌具有生物學活性的(糖基化的)EP0融合蛋白，而此蛋白含有 來自HIV反式作用轉錄激活子(TAT)的蛋白轉導域(PTD)(圖l-2)。我們前 期數據實驗表明(l)體外實驗證明EPO-TAT與野生型EPO—樣，具有對缺血缺 氧以及興奮性損傷具有很強的祌經保護作用(圖3); (2)全身給藥后在鼠腦內 EPO-TAT的轉運量比野生型EPO的轉運量增加了 2.5倍(圖4); (3)重要的是， 我們發現在鼠局灶性腦缺血模型中，EPO-TAT減少腦梗死的效率遠遠高于野生型 EP0，如圖5所示1000U/kg的EPO-TAT可明顯減少腦梗死體積，其效果與使用 5000U/kg野生型EPO相似;(4)此外，因為TAT增加了 EPO通過BBB的轉運率， 所以EPO-TAT比野生型EPO在腦內能更快更早達到有效的治療濃度，延長了治 療的有效時間窗。
與野生型EPO相比EPO-TAT具有兩個優勢第一，EPO-TAT可顯著減少治療 腦卒中所需EPO的劑量，從而明顯減輕了 EPO的副作用；第二， EPO-TAT可以延 長腦卒中治療時間窗，從而使更多腦卒中病人達到治療。
下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明，并非對本發明的限定，依 照本領域公知的現有技術，本發明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開 內容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。


圖l-A為EP0-TAT全基因序列示意圖。
圖1-B為表達質粒pEPO-TAT-IRES的物理圖，用PCR方法將HIV TAT加至EP0cDNA的3'端，同時引入由六個組氨酸殘基組成的his-6標記，用于分離、 純化EPO-TAT融合蛋白。PCR擴增的EPO-TAT-his-6用EcoRV和EcoRI消化后插 入pIRES-EYFP質粒(Clontech)，然后用鼠DHFR置換EYFP。
圖2為穩定表達EP0-TAT融合蛋白的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株的建立及 其EPO-TAT融合蛋白的制備及純化。pEPO-TAT-DHFR轉染CH0DG44細胞(DHFR ——)。用氨甲喋啉進行誘導擴增，劑量從5pM逐漸擴增到20uM。取2W培養基上 清液用Western blot分析EPO-TAT的表達。如圖2-A所示，我們成功地分離純 化了 EP0-TAT，分子量約36-45 kD (泳道5-7)，其分子量比沒有TAT的野生型 EPO (泳道2-4)商用標準EPO (泳道1)大1 2 kD。 圖2-B顯示特定表達的 EPO-TAT融合蛋白。
圖3為小鼠體內實驗證明，TAT能增加EPO血腦屏障通過率。腹腔注射 EPO-TAT或EPO (5000U/kg BW) 3小時后收集血漿和腦脊液(CSF)。通過ELSIA 檢測在血漿(圖3-A)或腦脊液(圖3-B)中EPO蛋白含量。數據為平均數士標 準差(n=4)表示。*p<0.05， **p<0.01，與鹽水對照組比較。##p〈0.01，與 野生型EPO組比較。
圖4為體外實驗，提示EP0-TAT具有抗OGD和醒DA的腦保護作用。用1U/ml 的EPO-TAT或EPO處理制備的皮層神經元24h后，然后給與OGD或醒DA毒性的 剌激。圖4-A示暴露于90分鐘OGD后給予正常糖氧濃度24小時后的神經元。 取培養基檢測LDH活性，作為細胞死亡的標記。圖中數據顯示的是與單獨OGD 對照組的LDH釋放比例。圖4-B示神經元接受200 uM麗DA刺激15分鐘后恢復 到正常培養基，再培養24小時。細胞核用煙酸己可堿染色，計數濃縮及片段化 的細胞核比例。TAT-GFP融合蛋白作為對照。數據表示為平均值土標準誤，每視 野取12-18個點，由3名與實驗無關的技術員計數。*** /X0.001與0GD對照。 **p<0. 01與單純NMDA對照。
圖5為小鼠體內實驗，證明與野生型EPO相比，EPO-TAT更能有效減少小 鼠大腦中動脈阻塞模型腦梗死體積。小鼠缺血60min注即刻腹腔注射EPO-TAT 或EPO，缺血72h后TTC染色。圖5-A分別為對照組，EP0-TAT和野生型EPO的 MCAO大鼠腦的冠狀切面TTC染色照片。圖5-B為。數據用平均數士標準差表示 (n=9)。 **p〈0. 01與空白對照組比較，# p〈0. 05與EPO(1000U/kg)比較。多組 間比較4吏用方差分析(ANOVA)禾口 post hoc Student—Newman—keuls tests。
具體實施例方式
實施例1:載體制備
一、 人類EP0 cDNA的擴增
人類EP0 cDNA編碼193個氨基酸，EP0初級蛋白合成后，其氨基端含27個氨基酸殘基的信號肽經切割后變為成熟EP0。因此成熟的人類EP0為166個氨基酸。最近研究發現第166號氨基酸精氨酸也被切割。基于上述研究結果，我們在構建含有HIV TAT轉導序列的融合蛋白時，將HIV的TAT以及用于分離純化的組氨酸標簽加于EP0cDNA的3'端，同時將第166號精氨酸刪除。含有HIVTAT標簽的人類EPO cDNA用PCR方法從人類腎臟Marathon-ready cDNA文庫(Clontech ，USA)中擴增。引物設計依照已發表的人類EPO cDNA序列(基因序列號NM000799)。其中上游序列含有EcoRV及KOZAK序列(劃線部分)5， ACgATATCgCCACCATgggggTgCACgAATgT CTTgC-3，。下游為95bp的長引物，從3'至5'依次含有EP0下游序列(小寫部分)，編碼11個氨基殘基的HIVTAT標簽(下劃線部分)，六個組氨酸組成的組氨酸標簽(斜體部分)以及EcoRV克隆位點(方框部分)。在不同肽段之間加入甘氨酸殘基(黑體部分)，便于從功能上分隔不同肽段以及肽段的自由旋轉。EPO-TAT下游引物序列為
4ACCgtcccctgccctgcaggcctcccctg-3' 。PCR反應條件為上述兩弓l物各lOpmol，Marathon cDNA 2W， AccuprimerM Taq DNA polymerase (Invitrogen， Carlsbad,美國)1P1， dNTP 200PM。 94。C預變性2分鐘后，94。C變性30秒，60。C退火30秒，68t:延伸50秒，28個循環后用瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物。克隆入AT克隆載體pGEM-T easy (Promega， Madison,美國)。質粒擴增及酶切鑒定后進一步進行DNA測序。EPO-TAT全基因序列示意圖如圖1-A所示。
二、 含TAT標簽的EPO表達載體的構建
將上述測序后的EPO-TAT全基因用EcoRV及EcoRI雙酶切后，亞克隆至pIRES-EYFP表達載體中(clontech，美國)。命名為pEPO-TAT-EYFP。此載體含有CMV啟動子，同時含有心腦炎病毒的內核糖體自啟動位點，因此一條mRNA可以同時翻譯兩種不同蛋白。小鼠二氫葉酸還原酶DHFR經PCR擴增，測序鑒定后，用SmaI及BsrGI雙酶切。亞克隆至經相同酶切的pEPO-TAT-EYFP載體中，組成既表達EPO-TAT融合蛋白，又表達篩選標記酶DHFR的雙順反子真核表達載體pEPO-TAT-DHFR，見圖1-B。
實施例2:為表達EP0-TAT融合蛋白的中國倉鼠卵巢(CH0)穩定細胞株的建立及其EP0-TAT融合蛋白的制備及純化
一、 表達EP0-TAT融合蛋白的CHO穩定細胞株的建立
將載體pEP0-TAT-DHFR用Xhol酶線性化后，回收純化。用轉染試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國)將線性化的質粒導入DHFR缺失的CH0細胞株DG44 (Duke大學惠贈)。轉染24h后，1: 12傳代，改用無核苷酸的a-MEM培養基(Invitrogen,美國)培養，同時加入5 pM的氨甲喋林，2周后挑選單個克隆轉入6孔板繼續培養。取培養基用Western blot或稀釋1000倍后用ELISA鑒定EPO-TAT高表達細胞株。取其中六個EP0-TAT高表達株，加入氨甲喋林至50pM，繼續培養2周后傳代，按上述方法依次增加氨甲喋林至500pM， 5nM， 50nM， 500nM, 5(41以及至最終濃度20^M。上清用Western blot和ELISA鑒定EP0-TAT的表達，結果見圖2-A。
二、 EP0-TAT融合蛋白的制備及純化經一系列的濃度的氨甲喋林篩選后，我們獲得了 EPO-TAT高表達細胞株。其中11號細胞株EP0-TAT的分泌量達到1000U/ml，大量擴增后，收集培養基用Ni-NTA瓊脂糖層析柱(QIAGEN， Valencia,美國)回收純化EP0-TAT融合蛋白。簡言之，培養基用Na0H將其PH值調至8. 0，加入5M NaCl至終濃度為300mM。將5ml Ni-TAT瓊脂糖加入層析柱中，用PBS洗柱兩遍后，將Nl-TAT瓊脂糖加入培養基中。4-C振搖結合2小時后，將Ni-TAT瓊脂糖培養基加入層析柱中，用磷酸鹽緩沖液(50mMNaH2P04, 300mMNaCl， 20mM咪唑imidazole,pH8. 0)洗柱6遍，然后加入洗脫液(50mMNaH2P04, 300mMNaCl，250mM imidazole, PH8. 0) 10ml洗脫EPO-TAT融合蛋白。將洗脫的EPO-TAT融合蛋白加入Slide-A-Lyzer透析盒中(PIERCE， Rockford,美國)，置于1000ml PBS中進行透析，每8小時更換一次PBS，透析6次后收集蛋白。SDS-PAGE電泳后，用考馬斯亮蘭染色鑒定蛋白純度。用ELISA試劑盒(R&D System, Minneapolis,美國)進行定量分析。
8理論上未糖基化的EPO-TAT分子量應為23kD， Western blot法確定純化的EPO-TAT融合蛋白分子量為36至40kD (圖2-B)，表明我們生產的EPO-TAT為糖基化的。用此法提純的EPO-TAT純度可達90%，濃度高達50U/W。純化的蛋白經0. 2to濾器過濾后分裝，凍存于-8(TC或冷凍真空抽干備用。
實施例3:檢測TAT介導的EPO是否能增加EPO通過血腦屏障
我們制備TAT標記的EPO的目的是提高其穿透血腦屏障而增加EPO在大腦內的治療濃度。為進一步證明此問題，我們給成年大鼠腹腔注射EPO-TAT或野生型EPO (未融合TAT)，劑量為5000U/公斤體重。注射3h后，收集血漿和腦脊液并使用ELISA試劑盒(R&D System)測定EPO含量，該試劑盒的敏感性為0.8mU/ml。我們發現這個試劑盒在測量EPO-TAT和野生型EPO的敏感性上沒有差別。如圖3所示，血中EPO-TAT的含量明顯高于野生型EPO。腦脊液樣本的監測結果顯示EPO-TAT通過BBB的效率明顯高于野生型EPO (大約增加2. 5倍)。這些數據支持EPO-TAT能增強EPO通過BBB的能力。ELISA按廠家說明進行，腦脊液的收集按Frankman SP (Physiol Behav. 1986; 37 (3) :489-63)所報道的方法。簡言之，大鼠用1.5%異氟垸/30% 02/70%&0混和氣體麻醉后，切開枕部外皮膚，暴露枕骨下膜，用25號針頭插入小腦延髓池，輕輕吸取給200W腦脊液。取稀釋后在顯微鏡下計數紅細胞。血漿中EPO濃度約為腦脊液的1000倍。因此紅細胞污染若大于O. 0P/。V/V或紅細胞計數大于500/ml，該腦脊液樣品作廢。
實施例4: EPO-TAT具有抗OGD和NMDA的腦保護作用一、大鼠皮層神經元原代培養
按Cao等報道的方法進行(Cao G， J Neurosci. 2001， 21a913a0:4678x-46901)。簡言之，取懷孕16至17天的SD大鼠胚胎，用剪刀將大腦皮層組織剪成約lmmi小塊，用0.01%胰酶緩沖液37°(:消化30分鐘后，加入馬血清滅活胰酶，用吸管吹打后過濾190g離心10分鐘后收集細胞，重懸于Neurobasal培養基(invitrogen)后禾中于poly—D—lysine coated 24孑L板(3X 10s)或100mm盤(5X106)中，同時加入50XB27添加劑(invitrogen)。每72小時更換一次液體。用Neurobasal培養基所得神經元純度為95%。
二、 缺糖缺氧模型(0GD模型)
上述培養的神經元至第11天時，更換新鮮培養基，同時加入B27(-)添加劑(invitrogen)。 12小時后，更換為無糖培養基MEM-PAK (UCSF cell culture,San Francisco ， 美國)。將上述細胞置于缺氧培養室(Billups-Rothenberg,Del Mar， 美國)，通入95%氬氣/5%二氧化碳氣體90分鐘。更換新鮮培養基及給予正常濃度氧氣，繼續培養24小時。為證明EPO-TAT融合蛋白是否對缺糖缺氧所致神經元損傷具有保護作用，神經元提前24小時用EPO-TAT或常規EP0(lU/ml)預處理，然后給予缺糖及缺氧，24小時后取培養基上清檢測LDH活性，作為細胞死亡的標記。
三、 NMDA毒性模型
生長至11天的原代培養神經元更換新鮮培養基，加入B27(-)添加劑，同時加入EPO-TAT或常規EPO (lU/ml)，半小時后加入200南NMDA作用15分鐘后更換為新鮮培養基及B27(-)添加劑。同時加入EP0-TAT或常規EPO。 24小時后用Hoechest染色細胞核。計數濃縮及片段化的細胞核比例。TAT標簽的綠色熒光蛋白作為陰性對照。
為了確定純化的EPO-TAT蛋白是否具有生物活性，我們驗證了其在缺氧和葡萄糖缺乏(0GD)或醒DA毒性誘導的神經細胞死亡中的作用。90分鐘缺氧后，給予正常濃度的氧和葡萄糖，24小時后測定LDH值。如圖4-A所示，EPO-TAT顯著保護由0GD造成的原代皮層神經元損傷，其效果與商用標準EP0(R&D System,Minneapolis,美國)相似。我們又深入研究了 EPO-TAT抗匪DA毒性的保護作用(圖4-B)。陰性對照TAT標簽的綠色熒光蛋白(TAT-GFP)在上述兩種模型中沒有保護作用，但是EPO和EPO-TAT都能顯著降低由應DA誘導的細胞凋亡及壞死。這些數據證明EPO-TAT融合蛋白具有生物活性，而且TAT的加入不會減少EPO的神經保護作用。實施例5: EPO-TAT在小鼠大腦中動脈阻塞模型中的腦梗死體積的影響
一、 小鼠短暫局部腦缺血模型的制作利用單股尼龍縫合線栓塞左側大腦
中動脈制作局部腦缺血模型。取體重25-30g， 2-3月齡雄性C57/B6小鼠(TheJackson Laboratory, Bar Harbor,美國)，1. 5%異氟烷/70°認20/30%02混和氣體氣管插管吸入麻醉。手術全程動物的直腸溫度通過反饋恒溫加熱毯維持在37.0土0.5i:之間，栓塞時使用鼠尾血壓監測器監測小鼠的平均動脈壓，于栓塞后15分鐘取動脈血行血氣分析。栓塞60分鐘后于各指定時間點拔出線栓恢復血供造成再灌注。手術完畢解除麻醉，小鼠被放回籠內飼養在2(TC恒溫的空調屋內。
二、 梗死體積測定梗死體積的測定采用Yang所描述方法(Stroke. 1994，25(1) :165-70)。概括如下于再灌注不同時間點處死動物，快速取出腦組織，冠狀位切片，共6片，每片厚2毫米，將切好的腦片放入用PBS配置的2%TTC
(氯化2， 3， 5-三苯基四氮唑)溶液中，37. 5。C水浴20分鐘，然后將其放入4%的多聚甲醛中固定15分鐘后取出拍照。使用圖像分析系統(MCID，St. Catherine' s，加拿大)。計算機圖像分析系統計算各層腦組織面積。公式為梗塞面積=非梗塞面積-梗塞側正常腦組織面積，這樣可以減小腦水腫對計算梗塞面積的影響。總的梗塞體積二各層梗塞面積X層厚(2mm)。為了驗證TTC染色測定梗死體積的準確性，實驗室進行了組織學染色與之對比。將動物處死后快速取腦，將腦組織放入2-甲基-丁烷在3(TC下冰凍。行冠狀位連續冰凍切片，每片厚20陶，每隔0. 5mm取一張腦片(每個腦組織大概可取22-24張腦片)。
切好的腦組織切片進行甲酚紫染色，按上述的方法進行梗塞體積的計算。
我們進一步證實了 EP0-TAT在小鼠腦缺血再灌注模型中的神經保護作用。C57/B6小鼠大腦中動脈栓塞60分鐘再灌注72小時后造成同側半球梗死，TTC染色顯示梗死體積大約為32 mm:'。缺血后再灌注即刻使用1000U/kg EP0-TAT可明顯減少梗死體積(P〈0.01，與空白對照組比較)，其效果與5000U/kg野生型EP0相似(圖5-A和5-B)。表明EP0-TAT能顯著促進EP0穿透血腦屏障而進入大腦，因而可顯著降低EPO的注射劑量。序列表
<110>曹國棟、陳俊、羅玉敏、吉訓明、邢娟〈120〉血腦屏障穿透性促紅細胞生成素及其應用<130〉<160〉 68
<170〉 Patentln version 3. 5
〈210〉 1
〈211〉 582
〈212〉 DNA〈213〉人屬，人種
<400〉 1 (人類促紅細胞生成素cDNA)
atgggggtgc acgaMgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct GO
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240
atggaggtcg ggcagcaggc cgt卿agtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540
aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582
<210〉 2
<211〉 193
<212〉 PRT〈213〉人屬，人種
12<400〉 2 (人類促紅細胞生成素氨基酸序列)
MetGly ValHisGluCysProAla TrpLeuTrp LeuLeuLeuSer Leu Leu SerLeu Pro
15101520
LeuGly LeuProValLeuGlyAla ProProArg LeulieCysAsp Ser Arg ValLeu Glu
25303540
ArgTyr LeuLeuGluAlaLysGlu AlaGluAsn lieThrThrGly Cys Ala GluHis Cys
45505560
SerLeu AsnGluAsnlieThrVal ProAspThr LysValAsnPhe Tyr Ala TrpLys Arg
65707580
MetGlu ValGlyGinGinAlaVal GluValTrp GinGlyLeuAla Leu Leu SerGlu Ala
859095100
ValLeu ArgGlyGinAlaLeuLeu ValAsnSer SerGinProTrp Glu Pro LeuGin Leu
105110115120
HisVal AspLysAlaValSerGly LeuArgSer LeuThrThrLeu Leu Arg AlaLeu Arg
125130135140
AlaGin LysGluAlalieSerPro ProAspAla AlaSerAlaAla Pro Leu ArgThr lie
145150155160
ThrAla AspThrPheArgLysLeu PheArgVal TyrSerAsnPhe Leu Arg GlyLys Leu
165170175180
Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg185 190
<210〉 3<211〉 166〈212〉 PRT<213〉人屬，人種
〈400〉 3 (成熟的人類促紅細胞生成素氨基酸序列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
13Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg165
〈210〉 4〈211〉 178<212> PRT〈213〉人屬，人種
<400〉 4 (具有蛋白轉導功能的人類促紅細胞生成素氨基酸序列)Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Uu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg165 170 175 178
〈210〉 5
〈211〉 178
〈212〉 PRT<213〉人屬，人種
〈400〉 5 (具有蛋白轉導功能的突變型(R14E)人類促紅細胞生成素氨基酸序列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp1 5Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
Ser Arg Val Leu Glu Glu Tyr Leu Leu Glu10 15His Cys Ser
CysTyr
Glu
Trp
Lys Arg Met
Ala30Ala
45 50Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
65 70Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
Leu Asn Glu Asn35
105 110
Glu Val55
Leu Arg75
Val Asp95
Gin Lys115
Gly GinGly GinLys AlsGlu Ala
Ala Lys20
lie Thr40
Gin Ala60
Ala Leu80
Val Ser100
lie Ser120Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
<210〉 6
<211〉 178
〈212〉 PRT 〈213>人屬，人種
<400〉 6 (具有蛋白轉導功能的突變型(R14A)人類促紅細胞生成素氨基酸序列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp 1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 45
Ser Arg Val Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Glu Ala
10 15 Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
30 35 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 8590 95
Gly Gin Gly Gin Lys Ala
Ala
Val
Gly Leu Arg Pro Pro Asp Leu Phe Arg
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys 105 110 115
Leu Arg 130
Arg Gly 150
Ala Ala Ser Ala Ala Pro 125
Val Tyr Ser Asn Phe Leu 145
Thr lie Thr Ala Asp 135 Lys Leu Tyr 155
Lys Leu
Glu Ala lie Thr Phe Arg Thr Gly Glu
Lys
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg165 170 175 178
<210〉 7 〈211〉 178 <212> PRT <213〉人屬，人種
<400〉 7'(具有蛋白轉導功能的突變型(S100A)人類促紅細胞生成素氨基j酸序歹ij)AlaProProArgLeulieCysAspSerArgValLeuGluArgTyr LeuLeuGluAlaLys
15101520
GluAlaGluAsnlie 25ThrThrGlyCysAla 30GluHisCysSerLeu Asn 35GluAsnlieThr 40
ValProAspThrLys 45ValAsnPheTyrAla 50TrpLysArgMetGlu Val 55GlyGinGinAla 60
ValGluValTrpGin 65GlyLeuAlaLeuLeu 70SerGluAlaValLeu Arg 75GlyGinAlaLeu 80
LeuValAsnSerSer 85GinProTrpGluPro 90LeuGinLeuHisVal Asp 95LysAlaValAla 100
GlyLeuArgSerLeu 105ThrThrLeuLeuArg 110AlaLeuArgAlaGin Lys 115GluAlalieSer 120
ProProAspAlaAla 125SerAlaAlaProLeu 130ArgThrlieThrAla Asp 135ThrPheArgLys 140
LeuPheArgValTyr 145SerAsnPheLeuArg 150GlyLysLeuLysLeu Tyr 155ThrGlyGluAla 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
<210〉 8 <211〉 178 <212〉 PRT <213〉人屬，人種〈400〉 8 (具有蛋白轉導功能的突變型(S100E)人類促紅細胞生成素氨基酸序列) Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Glu
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg
165 170 175 178
<210〉 9 〈211〉 178 〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種
〈400〉 9 (具有蛋白轉導功能的突變型(R103A)人類促紅細胞生成素氨基酸序列) Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Ala Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
<210〉 10 <211〉 178 <212〉 PRT <213>人屬，人種
<400〉 10 (具有蛋白轉導功能的突變型(R103E)人類促紅細胞生成素氨基酸序 列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Glu Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
〈210〉 11
〈211〉 178
<212〉 PRT 〈213〉人屬，人種
〈400〉 11 (具有蛋白轉導功能的突變型(S104I)人類促紅細胞生成素氨基酸序 列)
Leu lie Cys Asp Ser Arg 5 10 lie Thr Thr Gly Cys Ala 25 30 Lys Val Asn Phe Tyr Ala 45 50 Gin Gly Leu Ala Leu Leu 65 70 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro
85 90 Gly Leu Arg lie Leu Thr Thr Leu Leu Arg 105 110
Ala Pro Pro Arg 1
Glu Ala Glu Asn Val Pro Asp Thr Val Glu Val Trp
Val
Glu
Trp
Leu Glu Arg His Cys Ser Lys Arg Met
Ser Glu Ala Val
Leu Gin Leu His
Ala teu Arg Ala
Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 20 Leu Asn Glu Asn lie Thr
35 40 Glu Val Gly Gin Gin Ala
55 60 Leu Arg Gly Gin Ala Leu
75 80 Val Asp Lys Ala Val Ser
95 100 Gin Lys Glu Ala lie Ser
115 120
20Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
權利要求
1.血腦屏障穿透性促紅細胞生成素，其特征在于在野生型EPO或野生型EPO的衍生物的羧基末端連接有具有蛋白轉導功能的蛋白轉導序列；蛋白轉導序列包括(1)HIV TAT；(2)由5-10個精氨酸組成的多聚精氨酸；(3)果蠅控制觸角基因的同源結構域；(4)單純皰疹病毒VP22。
2. 根據權利要求1所述的血腦屏障穿透性促紅細胞生成素，其特征在于 所述HIV TAT標記為含有11個氨基酸殘基RGRKKRRQRRR的肽或來自HIV TAT的 其它肽段。
3.根據權利要求l所述的血腦屏障穿透性促紅細胞生成素，其特征在于具有蛋白轉導功能的人類促紅細胞生成素氨基酸序列為序列表SEQ ID No. 4;具 有蛋白轉導功能的突變型人類促紅細胞生成素氨基酸序列為序列表中SEQ ID No. 5至No. 11。
4. 根據權利要求1所述的血腦屏障穿透性促紅細胞生成素，其特征在于 所述野生型EPO的衍生物包括由氨基酸定點突變而產生的突變型EPO、甲酰化 EPO、或無唾液酸EPO。
5. 權利要求1至4中任何一項所述的血腦屏障穿透性促紅細胞生成素在制 備藥物中的應用，其特征在于所述藥物是治療腦卒中、急性心肌梗死、外傷 性腦損傷、脊髓損傷、急性外傷性器官損傷、急性中毒、急性器官衰竭以及麻 醉意外、外傷或疾病引起的呼吸或心跳暫停而引起的全身器官衰竭的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種血腦屏障穿透性促紅細胞生成素，屬于生物制藥領域。血腦屏障穿透性促紅細胞生成素，其特征在于在野生型EPO或野生型EPO的衍生物的羧基末端連接有具有蛋白轉導功能PTD，選自(1)HIV TAT；(2)由5-10個精氨酸組成的多聚精氨酸；(3)果蠅控制觸角基因的同源結構域；(4)單純皰疹病毒VP22。本發明的創新性在于與野生型EPO相比EPO-TAT具有兩個優勢第一，EPO-TAT可顯著減少治療腦卒中所需EPO的劑量，從而明顯減輕了EPO的副作用；第二，EPO-TAT可以延長腦卒中治療時間，從而使更多腦卒中病人達到治療。
文檔編號A61P9/00GK101671388SQ20081022210
公開日2010年3月17日 申請日期2008年9月9日 優先權日2008年9月9日
發明者吉訓明, 曹國棟, 羅玉敏, 娟 邢, 俊 陳 申請人:曹國棟;陳 俊;羅玉敏;吉訓明;邢 娟