專利名稱：聯合利用抗菌肽和超高壓制備細菌菌影的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種聯合利用抗菌肽和超高壓技術制備細菌菌影的方法及應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
菌影是一種近年在國外開展的新型疫苗和耙向藥物載體系統，它是將裂解基因在革蘭氏陰性細菌中表達，在細菌細胞膜和胞壁上可形成多個穿膜隧道，在滲透壓的作用下使細菌胞內細胞漿和核酸成分降解為小片斷后被排出，繼而形成一種空的細菌外殼，即為"細菌膜影"。菌影能夠有效刺激機體產生特異性和非特異性的免疫應答，包括T細胞的活化和粘膜免疫等，而且既能攜帶外源抗原，又能同時遞送核酸和其他藥物，所以它被認為是非常有用的候選疫苗和滅活載體。菌影可以通過發酵而大量生產，加工容易，安全可靠，同時菌影表面存在很多受體，可以用來靶向作用于特異性的細胞和組織。目前，除大腸桿菌外，很多革蘭氏陰性菌均能在裂解基因E作用下產
生菌影，如胸膜肺炎放線桿菌，霍亂弧菌、溶血性巴氏桿菌、幽門螺桿菌和遲鈍愛德華氏菌等。菌影免疫原性好、佐劑作用明顯、還是良好的藥物與蛋白的靶向載體，制備方法簡單，成本低廉，接種途徑多樣，使用安全，易于產業化推廣，使菌影成為當今疫苗研究的熱點，也顯示了極具吸引力的應用前景。
抗菌肽是生物體內經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽，分子量在
2000 7000左右，由20 60個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數具有強堿性、熱穩定性以及廣譜抗菌等特點。世界上第一個被發現的抗菌肽是1980年由瑞典科學家G.Boman等人經注射陰溝通桿菌及大腸桿菌誘導惜古比天蠶蛹產生的具有抗菌活性的多肽，定名為Cecr叩ins。此后數年間，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發現并分離獲得具有抗菌活性的多肽。由于最初人們發現這類活性多肽對細菌具有廣譜高效殺菌活性，因而命名為"antibactetialpepiides，ABP"，
中文譯為抗菌肽，其原意為抗細菌肽。隨著人們研究工作的深入開展，發現某些抗細菌肽對部分真菌、原蟲、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用，因而對這類活性多肽的命名許多學者傾向于稱之為"peptideantibiotics"—多肽抗生素。目前，所有的常規抗生素都出現了相應的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經R益嚴重地威脅著人們的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問題的一條有效途徑?？咕囊驗榭咕钚愿?，抗菌譜廣，種類多，可供選擇的范圍廣，靶菌株不易產生抗性突變等原因，而被認為將會在醫藥工業上有著廣闊的應用前景。目前，己有多種多肽抗生素正在進行臨床前的可行性研究，其中magainins己經進入三期臨床試驗階段。
超高壓技術是是一種新型的冷殺菌技術，它的基本原理是將100 1 OOOMPa的壓力施加于細菌，改變微生物的細胞形態結構，破壞微生物細胞膜和細胞壁，增加細胞膜的通透性，導致細胞內容物流失，抑制生化反應，阻遏了細胞的新陳代謝過程，使細菌分裂減慢，生長滯后，甚至停止生長，常用于食品的滅菌和保鮮。
目前傳統的菌影制備方法存在以下不足菌影的裂解效率一直很難提高，菌體內
含物釋放不徹底，菌體滅活不徹底；構建裂解載體費時費力，操作繁復；傳統的菌影
制備方法是建立在裂解載體的基礎上，制備不同細菌的菌影需要不同的裂解載體，如
果沒有相應的載體則無法制備該細菌的菌影。
目前國內外還沒有將抗菌肽和超高壓技術結合用于制備菌影的報道。發明內容-
本發明公開一種聯合利用抗菌肽和超高壓制備細菌菌影的方法，提供了一種新的細菌菌影制備方法。
本發明公開了聯合利用抗菌肽和超高壓制備的細菌菌影，可以作為一種新的候選疫苗使用。
本發明的聯合利用抗菌肽和超高壓制備細菌菌影的方法，其特征在于聯合利用抗菌肽和超高壓替代傳統方法來制備細菌菌影，提供了一種新的細菌菌影制備方法。本發明的聯合利用抗菌肽和超高壓制備細菌菌影的方法如下-利用基因工程表達的方法，獲得抗菌肽；將細菌菌株培養至對數生長期(OD600為0.4 0.6)時，加入抗菌肽，4"作用過夜或室溫作用2 4h;離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次，加入生理鹽水重懸，進行200 250MPa超高壓處理；離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次，即制備成細菌菌影，冷凍干燥保存于一2(TC或一8(TC
備用o
本發明的聯合利用抗菌肽和超高壓制備細菌菌影的應用，包括以下步驟制備細菌菌影，免疫實驗動物，可剌激機體產生特異的體液免疫和細胞免疫，與滅活苗相比有相同的保護率，具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗。
本發明的積極效果在于-傳統的菌影制備方法存在以下不足菌影的裂解效率一直很難提高，菌體內含物
釋放不充分，菌體滅活不徹底；構建裂解載體費時費力，操作繁復；傳統的菌影制備
方法是建立在裂解載體的基礎上，制備不同細菌的菌影需要不同的裂解載體，如果沒
有相應的載體則無法制備該細菌的菌影。本發明聯合利用抗菌肽和超高壓制備細菌菌
影，提供了一種新的細菌菌影制備方法，取得了良好的效果，裂解效率高，可達
99.9999999%以上，并且操作簡單，可廣泛用于細菌的菌影制備；對制備的細菌菌影
進行了應用，具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗使用。


圖1.正常豬胸膜肺炎放線桿菌的TEM照片(13000X);
圖2.豬胸膜肺炎放線桿菌菌影的TEM照片(13000X);
圖3.正?？莶輻U菌的TEM照片(13000X);
圖4.枯草桿菌菌影的TEM照片(13000X);
圖5.正常大腸桿菌0138的TEM照片(13000X);
圖6.大腸桿菌Ou8菌影的TEM照片(13000X);
具體實施例方式
通過以下實施例進一步舉例描述本發明，并不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求范圍之內。下面用實施例來進一歩說明本發明的實質性內容，但本發明的內容并不局限于此。實施例1
利用抗菌肽Tachyplesin I制備豬胸膜肺炎放線桿菌的菌影本實施例選用的抗菌肽為Tachyplesin I ;選用的細菌為豬胸膜肺炎放線桿菌(革
蘭氏陰性菌)，為本研究室保存。
Tachyplesin I的DNA序列為
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51
Tachyplesin I的氨基酸序列為
Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly lie Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
1. 抗菌肽的表達
利用酵母表達系統對抗菌肽進行真核表達。
2. 細菌菌影的制備將細菌菌株過夜增菌后，按0.5%轉接種于培養基中，37'C振蕩培養OD6W)為0.4 0.6時，加入表達的抗菌肽Tachyplesin I至終濃度為3.5ug/mL， 4'C作用過夜或室溫作用2 4h;作用結束后，4°C， 5 000 rpm離心10 min，離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次，制備成細菌菌影；對處理前后的細菌適當稀釋進行活菌計數(CFU，個/ml)，計算裂解率。
3. 菌影的保存
將離心收集菌影細胞棄盡上清，最后溶于適當體積生理鹽水，計算菌影濃度，分裝于1.5mL疫苗瓶，每瓶800pL左右(含菌影5.0X 10^個/mL)，高度不超過0.5cm，冷凍干燥后保存于一20。C或一8(TC。
實施例2
聯合利用抗菌肽和超高壓制備豬胸膜肺炎放線桿菌的菌影本實施例選用的抗菌肽為Tachyplesin I ，選用的細菌為豬胸膜肺炎放線桿菌(革
蘭氏陰性菌)，為本研究室保存。
Tachyplesin I的DNA序列為
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51
Tachyplesin I的氨基酸序列為
Lys Tip Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly He Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
1. 抗菌肽的表達
利用酵母表達系統對抗菌肽進行真核表達。
2. 抗菌肽處理細菌
將細菌菌株過夜增菌后，按0.5%轉接種于培養基中，37'C振蕩培養0D6QG為0.4 0.6時，加入表達的抗菌肽至終濃度為0.35ug/mL，4'C作用過夜或室溫作用2 4h;4'C，5 000 rpm離心10 min，離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次。對處理前后的細菌適當稀釋進行活菌計數(CFU，個/ml)，計算裂解率。
3.超高壓處理
將用抗菌肽處理過的菌液裝入無菌處理的聚乙烯復合袋中，真空密封，放入超高壓裝置中；經過200MPa，保壓10min，進行超高壓處理，離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次，制備成細菌菌影；對處理前后的細菌適當稀釋進行活菌計數(CFU，個/ml)，計算裂解率。
4. 菌影的保存將離心收集菌影細胞棄盡上清，最后溶于適當體積生理鹽水，計算菌影濃度，分裝于1.5mL疫苗瓶，每瓶800iaL左右(含菌影5.0X 1(T個/mL)，高度不超過0.5cm，冷凍干燥后保存于一2(TC或一8(TC。
實施例3
聯合利用抗菌肽和超高壓制備枯草桿菌的菌影
本實施例選用的抗菌肽為Catesbeianin-l，選用的細菌為枯草桿菌(革蘭氏陽性菌)，為本研究室保存。
Catesbeianin-l的DNA序列為
atgatgaggg tgatgaggag gaagactaaa gttatttggg aaaaaaagga ctttattgga 60ttatacagta ttgattga 78Catesbeianin-1的氨基酸序列為
Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val lie Tip Glu Lys LysAsp Phe lie Gly Leu Tyr Ser lie Asp
1. 抗菌肽的表達
利用酵母表達系統對抗菌肽進行真核表達。
2. 抗菌肽處理細菌
將細菌菌株過夜增菌后，按0.5X轉接種于培養基中，37。C振蕩培養OD6oo為0.4 0.6時，加入表達的抗菌肽至終濃度為0.35ug/mL,4。C作用過夜或室溫作用2 4h;4"C，5 000 rpm離心10min，離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次。對處理前后的細菌適當稀釋進行活菌計數(CFU，個/ml)，計算裂解率。
3.超高壓處理
將用抗菌肽處理過的菌液裝入無菌處理的聚乙烯復合袋中，真空密封，放入超高壓裝置中；經過250MPa，保壓10min，進行超高壓處理，離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次，制備成細菌菌影；對處理前后的細菌適當稀釋進行活菌計數(CFU，個/ml)，計算裂解率。
4.菌影的保存
將離心收集菌影細胞棄盡上清，最后溶于適當體積生理鹽水，計算菌影濃度，分裝于1.5mL疫苗瓶，每瓶800pL左右(含菌影5.0X 10"個/mL)，高度不超過0.5cm，冷凍干燥后保存于一20。C或一80。C。
實施例4聯合利用抗菌肽和超高壓制備大腸桿菌o138的菌影
本實施例選用的抗菌肽為Tachyplesin I，選用的細菌為大腸桿菌0138 (革蘭氏 陰性菌)，為本研究室保存。
Tachyplesin I的DNA序列為
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51 Tachyplesin I的氨基酸序列為
Lys Tip Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly He Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
1. 抗菌肽的表達
利用酵母表達系統對抗菌肽進行真核表達。
2. 抗菌肽處理細菌
將細菌菌株過夜增菌后，按0.5%轉接種于培養基中，37'C振蕩培養OD6QQ為0.4 0.6時，加入表達的抗菌肽至終濃度為0.35ug/mL，4'C作用過夜或室溫作用2 4h;4'C， 5 000 rpm離心10min，離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次。對處理前后的細菌 適當稀釋進行活菌計數(CFU,個/ml)，計算裂解率。
3.超高壓處理
將用抗菌肽處理過的菌液裝入無菌處理的聚乙烯復合袋中，真空密封，放入超高 壓裝置中；經過250MPa，保壓10min，進行超高壓處理，離心收集菌體并用生理鹽 水重復洗兩次，制備成細菌菌影；對處理前后的細菌適當稀釋進行活菌計數(CFU， 個/ml)，計算裂解率。
4.菌影的保存
將離心收集菌影細胞棄盡上清，最后溶于適當體積生理鹽水，計算菌影濃度， 分裝于1.5mL疫苗瓶，每瓶800pL左右(含菌影5.0X 10^個/mL)，高度不超過0.5cm， 冷凍干燥后保存于一20。C或一8(TC。
實驗例l
細菌菌影的裂解效率及透射電鏡(TEM)觀察
按實施例1、 2、 3和4制備細菌菌影，測定裂解效率，經測定實施例1的裂解 效率可達99.9999%以上。實施例2、 3和4裂解效率可達99.9999999%以上。由此 可見，聯合使用抗菌肽和超高壓制備的菌影比單純使用抗菌肽制備的菌影裂解效率要 高。
按實施例2、 3和4制備細菌菌影，用2.5 %戊二醛固定4 h， 1 %鋨酸固定1 h，30 %乙醇脫水10 min， 50 %乙醇脫水15 min， 70 %醋酸鈾作用12h， 80 %乙醇脫水 15 min， 95 %乙醇脫水20 min，兩次無水乙醇脫水40 min，然后用環氧丙烷脫水30 min， 加入1 : 1的環氧丙烷與環氧樹脂作用2 h，加入純環氧樹脂滲透3 h，然后在50 'C下 環氧樹脂包埋12h，最后用環氧樹脂繼續包埋48h。包埋后超薄切片機制成切片，放 入銅網中。切片進行染色，以醋酸鈾作用30min，水洗，然后加入檸檬酸鉛作用20min， 水洗。于透射電鏡(TEM)下觀察。
電鏡結果見圖l一圖6，由圖可以看出，聯合利用抗菌肽和超高壓的方法成功制 備了豬胸膜肺炎放線桿菌(革蘭氏陰性菌)、枯草桿菌(革蘭氏陽性菌)和大腸桿菌 0138 (革蘭氏陰性菌)的菌影。
實驗例2
細菌菌影的免疫效果評價
1. 細菌菌影的制備
按實施例1制備豬胸膜肺炎放線桿菌的菌影，重懸于適當體積生理鹽水，使菌 影濃度為5.0Xl()io個/mL，充分混勻。
2. 甲醛滅活鋁佐劑苗的制備
將豬胸膜肺炎放線桿菌接種于培養基中，經37'C培養18-24h后制備成種子菌液， 接種于液體培養基，37t:培養18-24h后取出少量進行活菌計數，其余菌液按0.1%加 入甲醛，37。C滅活24h， 4。C保存備用。使用時5000rpm離心，并用生理鹽水洗兩次 后，按l: 5比例加入氫氧化鋁膠，充分振蕩即為甲醛滅活鋁佐劑苗。
3. 無菌檢驗
將所制備豬胸膜肺炎放線桿菌的菌影和甲醛滅活鋁佐劑苗隨機抽樣，接種于LB 平板，37'C培養48h，檢査有無細菌生長。
4. 安全性檢驗
取10只18—22g小鼠，每只腹腔注射細菌菌影，注射劑量約為免疫劑量的10倍， 連續觀察7—10d;甲醛滅活鋁佐劑苗同上。腹腔注射細菌菌影及甲醛滅活鋁佐劑苗后 小鼠無死亡及發病癥狀，肝臟組織觸片鏡檢無豬胸膜肺炎放線桿菌，表明細菌菌影及 甲醛滅活鋁佐劑苗安全合格。
5. 免疫實驗
小鼠隨機分組，每組20只，接種不同抗原進行免疫，空白對照組免相同劑量生 理鹽水，相同條件下分籠飼養，免疫程序見下表。_免疫實驗分組_
分組 免疫原 免疫劑量免疫途徑免疫次數
_及時間
A 豬胸膜肺炎放線桿菌菌影 5Xl(^CFU/只腹腔注射三次，間
B 豬胸膜肺炎放線桿菌 5X109CFUAR腹腔注射 隔兩周
滅活鋁佐劑苗
C_生理鹽7jC_100pL/只 腹腔注射_
6. 免疫水平的檢測
間接ELISA法檢測抗體效價，脾淋巴細胞轉化試驗檢測細胞免疫水平。 血清抗體水平檢測結果免疫小鼠后間接ELISA定期檢測血清IgG抗體效價， 三次免疫后抗體效價達到3200 X 。
脾淋巴細胞轉化試驗結果免疫組較對照組有明顯的細胞增值。
7. 攻毒實驗
三免后一周，小鼠腹腔注射3倍最小致死量的活菌進行大劑量感染實驗，對小鼠 存活情況進行計數，檢測疫苗的保護效果。
三次免疫后免疫保護結果見下表，細菌菌影的保護率與甲醛滅活苗的保護率都達 到100%，空白對照組全部死亡。
疫苗免疫保護測定結果
組別存活數死亡數保護率％
A20/200/20100
B20/200/20畫
C20/2020/200
結論由以上結果可以看出，聯合利用抗菌肽和超高壓制備的細菌菌影比單純利 用抗菌肽制備的菌影裂解率更高，可剌激機體產生特異的體液免疫和細胞免疫，與滅 活苗相比有相同的保護率，具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗使用。序列表
〈110>吉林大學
〈120>聯合利用抗菌肽和超高壓制備細菌菌影的方法及應用 <130> 22 <歸 4
<170> Patentln version 3. 5
<210> 1
〈211〉 51
〈212〉 廳
<213>人工合成
〈400〉 1
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51
<210> 2
<211> 17
〈212〉 PRT
〈213>人工合成
〈400〉 2
Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly lie Cys Tyr Arg Arg Cys 15 10 15
Arg
〈210> 3 〈211〉 78 〈212>艦 〈213〉人工合成 〈400> 3
atgatgaggg tgatg鄉ag gaagactaaa gttatttggg aaaaaa郷a ctttattgga 60
ttatacagta ttgattga 78
<210> 4
〈211> 25
<212> PRT
〈213〉人工合成
<400> 4
Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val lie Trp Glu Lys Lys 15 10 15
Asp Phe lie Gly Leu Tyr Ser lie Asp 20 25
1權利要求
1、一種聯合利用抗菌肽和超高壓制備細菌菌影的方法，包括以下步驟將細菌菌株培養至對數生長期(OD600為0.4～0.6)時，加入抗菌肽，4℃作用過夜或室溫作用2～4h；離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次，加入生理鹽水重懸，進行200～250MPa超高壓處理；離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次，即制備成細菌菌影。
全文摘要
本發明公開了一種聯合利用抗菌肽和超高壓制備細菌菌影的方法及應用，將細菌菌株培養至對數生長期(OD₆₀₀為0.4～0.6)時，加入抗菌肽，4℃作用過夜或室溫作用2～4h；離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次，加入生理鹽水重懸，進行200～250MPa超高壓處理；離心收集菌體并用生理鹽水重復洗兩次，即制備成細菌菌影。本發明提供了一種新的細菌菌影制備方法，取得了良好的效果，裂解效率高，可達99.9999999％以上，并且操作簡單，可廣泛用于細菌的菌影制備；對制備的細菌菌影進行了應用，具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗使用。
文檔編號A61K47/46GK101683524SQ20091006728
公開日2010年3月31日 申請日期2009年7月15日 優先權日2009年7月15日
發明者孫長江, 杜崇濤, 江麗娜, 盛相鵬, 芳 謝, 雷連成, 韓文瑜 申請人:吉林大學