專(zhuān)利名稱(chēng)：一種含有Wnt蛋白的生發(fā)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生發(fā)劑，尤其涉及一種通過(guò)Wnt/ {3 -catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用的Wnt蛋 白的促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的生發(fā)劑，尤其涉及一種含有Wnt3a蛋白的促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的生發(fā)劑。
背景技術(shù)：
毛和發(fā)為哺乳動(dòng)物所特有，是長(zhǎng)在全身皮膚表面的角化的絲狀結(jié)構(gòu)，為表皮衍生的附屬 器。獸皮膚的毛極多，對(duì)保持體溫和對(duì)抗機(jī)械性損害起重要作用。人類(lèi)的毛已相當(dāng)退化，但 毛囊有豐富的神經(jīng)末梢，是靈敏的觸覺(jué)感受器。同時(shí)，人類(lèi)的毛影響著人的外表，具有重要 的社會(huì)意義。
伸出皮膚外的毛稱(chēng)毛干，埋在皮膚內(nèi)的稱(chēng)毛根，毛根包在由上皮和結(jié)締組織組成的鞘狀 毛囊內(nèi)。毛根和毛囊的下端結(jié)合在一起，形成膨大的毛球。毛球的地面內(nèi)凹，其內(nèi)容納毛乳 頭，也叫真皮乳頭。
毛囊是具有周期性生長(zhǎng)特性的一個(gè)特殊的亞器官，由呈同心圓排列的三層結(jié)構(gòu)(毛干、 內(nèi)根鞘、外根鞘)組成，包含十多種細(xì)胞類(lèi)群(見(jiàn)圖l)。毛囊位于真皮和皮下組織中，較 短的毛囊位于真皮中。在縱切面上，生長(zhǎng)期的毛囊可分為三段①漏斗部，其上端為毛囊的 開(kāi)口，下端到皮脂腺開(kāi)口；②峽部，此段較短，上端至皮脂腺開(kāi)口，下端至立毛肌附著處； ③下段，由立毛肌附著處到毛囊底部，包括內(nèi)根鞘、外根鞘和毛球。整個(gè)毛囊由結(jié)締組織鞘
所包繞。結(jié)締組織鞘也稱(chēng)纖維鞘，其中富含m型膠原和彈性纖維，并有豐富的感覺(jué)神經(jīng)末梢
和血管。
毛囊干細(xì)胞位于毛囊上段與立毛肌連接處的隆突區(qū)，在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)上表現(xiàn)為原始 細(xì)胞，細(xì)胞動(dòng)力學(xué)特征是標(biāo)記保留細(xì)胞，并有若干明確的分子標(biāo)記物。毛囊干細(xì)胞具有三向 分化潛能下行分化為毛囊的各種類(lèi)群的細(xì)胞，向上迀移分化為皮脂腺細(xì)胞以及在特定情況下分化為皮膚的表皮細(xì)胞。目前，隆突區(qū)是毛囊干細(xì)胞棲息地的學(xué)說(shuō)已經(jīng)得到普遍認(rèn)同。
哺乳動(dòng)物的毛囊呈周期性生長(zhǎng)，在哺乳動(dòng)物的整個(gè)生命期間循環(huán)往復(fù)(見(jiàn)圖2)。毛囊 周期分為三個(gè)期生長(zhǎng)期的毛囊和毛活躍生長(zhǎng)；退化期的毛停止生長(zhǎng)，毛囊和毛球發(fā)生退化 ;靜止期的毛囊和毛球萎縮，毛易脫落。
在生長(zhǎng)期末，毛球發(fā)生一系列退化性變化。在退化期開(kāi)始時(shí)，毛母質(zhì)細(xì)胞停止增殖，同 時(shí)，外根鞘上皮退縮成角化的上皮管，包過(guò)毛干的球形下端，形成杵狀毛。
在靜止期，杵狀毛下方的上皮細(xì)胞柱萎縮并向上方移動(dòng)，游離的毛乳頭伴隨在上皮柱下 端，并有結(jié)締組織尾隨在退縮的上皮柱后面。最后，杵狀毛上移到立毛肌附著毛囊處。在靜 止期中，某些因素如激素、藥物等激活毛囊干細(xì)胞，則毛囊進(jìn)入下一個(gè)生長(zhǎng)期。
生長(zhǎng)期開(kāi)始時(shí)，毛乳頭與一部分圍繞它的未分化細(xì)胞發(fā)生重建。毛芽生成新的毛母質(zhì)， 并增大和變長(zhǎng)，沿遺留的結(jié)締組織鞘與毛乳頭一起向下移，同時(shí)分化形成內(nèi)根鞘和毛干。新 生的毛干向上生長(zhǎng)，將原有的杵狀毛推出。
人體的毛脫落不明顯，也不規(guī)則，因?yàn)橄噜彽拿幱谏L(zhǎng)周期的不同時(shí)期，不利于研究 。而小鼠的毛囊呈波浪形生長(zhǎng)，即同一橫截面的毛囊處于同一周期，且整個(gè)背部的周期頭尾 相差僅約2天，給毛囊的研究提供了便利的模型。
Wnt基因是鼠類(lèi)乳腺癌病毒(MMTV)誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌中克隆出的一種原癌基因，由 Nusse等人于1982能發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，當(dāng)時(shí)稱(chēng)為int基因。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)int基因與Sharma 報(bào)道的果蠅的無(wú)翅基因wingless (wg)為同源基因，因而將兩者合稱(chēng)為Wnt。近十年來(lái)對(duì)果 蠅、兩棲類(lèi)、哺乳類(lèi)到人類(lèi)Wnt族基因，編碼產(chǎn)物及其生物學(xué)效應(yīng)的研究表明，Wnt信號(hào)途 徑參與了從胚胎到成體的一系列控制細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及分化的調(diào)控，特別是在干細(xì)胞和腫瘤生 物學(xué)研究中越來(lái)越突出了其潛在的價(jià)值。
Wnt蛋白家族是一系列高度保守的分泌性的糖蛋白。動(dòng)物體早期發(fā)育中，Wnt信號(hào)決定 背腹軸的形成、胚層建立、體節(jié)分化、組織或器官形成等一系列重要事件，并直接控制著增 殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等細(xì)胞的命運(yùn)。同時(shí)，Wnt信號(hào)途徑也與腫瘤發(fā)生密切相關(guān) 。許多Wnt蛋白分子發(fā)揮作用都是通過(guò)其經(jīng)典信號(hào)途徑，經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑也稱(chēng)為Wnt/{3 -catenin信號(hào)途徑。在不同物種中Wnt/{3 -catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制具有極高的保守性
Wnt/e-catenin信號(hào)通路對(duì)毛囊的生長(zhǎng)和發(fā)育都起了非常重要的作用。胚胎發(fā)育時(shí)持續(xù) 過(guò)表達(dá)Wnt通路的抑制劑DKKl，毛囊完全不能生成，出生后過(guò)表達(dá)DKK1抑制毛囊的生長(zhǎng)。相
4反，持續(xù)表達(dá)穩(wěn)定形式的e-catenin，小鼠毛囊生成的數(shù)量增多。
Wnt3a是wnt家族成員之一，Wnt3a參與肺、牙、毛囊等器官的早期形成，調(diào)節(jié)造血干細(xì) 胞的自我更新。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，wnt3a能夠促進(jìn)表皮干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，抑制其 分化。毛囊中的真皮乳頭細(xì)胞能夠誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞的分化，體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a能夠 維持真皮乳頭細(xì)胞的這種誘導(dǎo)作用。
隨著社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)加劇，各種壓力增大，高脂性飲食增多，現(xiàn)代生活導(dǎo)致睡眠減少，都會(huì)使 脫發(fā)的發(fā)病率呈逐漸上升以及愈來(lái)愈年輕化的趨勢(shì)。近年來(lái)，在我國(guó)城市醫(yī)院(特別是大城 市醫(yī)院)中脫發(fā)患者的門(mén)診量在不斷上升。
早期的生發(fā)劑，從來(lái)自民間醫(yī)學(xué)的藥方、偏方為主，以改善微循環(huán)達(dá)到促進(jìn)生發(fā)作用， 后來(lái)發(fā)展為以臨床研究方法為主，根據(jù)脫發(fā)的生理病理原因有針對(duì)性地研制產(chǎn)品，如應(yīng)用擴(kuò) 張血管藥促進(jìn)微循環(huán)，調(diào)節(jié)激素及抗炎殺菌藥劑等。
目前，我國(guó)市場(chǎng)上各種各樣的生發(fā)劑品種繁多，以中藥品種為主，大多為外用藥。西藥 及內(nèi)服藥較少。市場(chǎng)上大部分產(chǎn)品的療效不盡如意，患者使用后癥狀改善不明顯。有關(guān)調(diào)査 還顯示，有98%左右的脫發(fā)患者認(rèn)為市場(chǎng)上傳統(tǒng)的治療脫發(fā)藥物不能帶來(lái)滿意療效，大多數(shù) 患者在試用生發(fā)劑半年無(wú)效時(shí)會(huì)選擇棄用。即便如此，由于人們生活水平不斷提高，越來(lái)越 注重外表美的問(wèn)題，因此購(gòu)買(mǎi)生發(fā)劑的人不斷增多。因此，如何能有效地治療脫發(fā)，是廣大 患者更為關(guān)心的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有Wnt蛋白的生發(fā)劑。它使毛囊呈現(xiàn)生長(zhǎng)期表型，毛囊從靜 止期向生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化，具有起效快，效果明顯，機(jī)制清楚等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)開(kāi)發(fā)促毛發(fā)生長(zhǎng)藥物具有 重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
本發(fā)明的技術(shù)方案是
所述生發(fā)劑包含通過(guò)Wnt/{3 -catenin信號(hào)通路促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的Wnt蛋白。 所述通過(guò)Wnt/e -catenin信號(hào)通路促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的Wnt蛋白為Wnt3a蛋白。 通過(guò)Wnt/e-catenin信號(hào)通路促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的Wnt蛋白在制備治療脫發(fā)藥物中的應(yīng)用。 毛囊的周期性生長(zhǎng)受復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控。Wnt信號(hào)通路在毛囊發(fā)育和再生中都發(fā)揮重要作 用，可以篩選到有明顯促毛作用的wnt蛋白為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的生發(fā)劑。作為皮膚 的附屬器官，毛發(fā)具有重要的生理學(xué)與社會(huì)學(xué)功能。毛發(fā)缺失給患者帶來(lái)很大的心理負(fù)擔(dān)，開(kāi)發(fā)促毛發(fā)生長(zhǎng)藥物具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
Wnt3a蛋白通過(guò)直接激活wnt經(jīng)典信號(hào)通路，使毛囊從靜止期迅速進(jìn)入生長(zhǎng)期，從而促進(jìn) 毛囊生長(zhǎng)。以此為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的生發(fā)劑，具有效果明顯，起效快，機(jī)制清楚等優(yōu)點(diǎn)，為臨床脫 發(fā)患者帶來(lái)福音。
下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。


圖l是生長(zhǎng)期毛囊結(jié)構(gòu)圖； 圖2是毛囊周期圖； 圖3為AdWnt3a感染293細(xì)胞的情況； 圖4為小鼠注射AdWnt3a后14天的整體照相；
圖5A和5B為分別注射AdGFP組和注射AdWnt3a組經(jīng)HE染色的毛囊生長(zhǎng)圖示； 圖6A和圖6B為AdWnt3a處理后毛囊器官培養(yǎng)l天和4天對(duì)照?qǐng)D示；加入AdWnt3a組毛囊生長(zhǎng) 明顯加快。
圖7為小鼠注射AdWntl0b后14d的整體照相；
圖8A和圖8B分別為注射AdWntl0b和注射AdGFP組經(jīng)HE染色的毛囊生長(zhǎng)的圖示。
具體實(shí)施例方式
本實(shí)施例所采用的試劑均為用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的市售產(chǎn)品。 WilliamE無(wú)血清培養(yǎng)基自配，配方見(jiàn)實(shí)施例2。 C57BL/6小鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 實(shí)施例l AdWnt3a的構(gòu)建與擴(kuò)增
采用何通川等的AdEasy系統(tǒng)，獲得AdWnt3a的滴度為10、fu/ml 。參考基因序列 NM—011718.1。(具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)1. He TC， Zhou S， da Costa LT， et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A， 1998， 95:2509-14 2. Luo丄Deng ZL， Luo X， et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc， 2007， 2:1236-47.)實(shí)施例2 Wnt3a促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)試驗(yàn) (1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
1) 注射取8周齡雌性C57BL/6小鼠，此時(shí)小鼠背毛處于靜止期，分組如下重組腺病毒 AdWnt3a注射組36只，AdGFP對(duì)照組(空載體)36只，PBS對(duì)照組36只。
腹腔注射100yl 1%戊巴比妥。約5分鐘后，小鼠處于麻醉狀態(tài)，用剃毛器小心剃除小鼠 背部被毛，注意不要剃傷皮膚和拔動(dòng)毛囊。
剃毛后，沿背中線中間取一點(diǎn)，皮內(nèi)注射25yl AdWnt3a，病毒滴度l()Spfu/ml，注意不 要注射到皮下。注射后，注射部位產(chǎn)生一個(gè)直徑約5mm的皮丘，用3%苦味酸沿皮丘邊緣標(biāo)記 注射部位。
2) 觀察注射后每天觀察并照相，注意注射部位皮膚顏色變化和毛囊生長(zhǎng)情況。
3) 取材注射后3天、5天、7天、9天、14天、28天分別處死6只小鼠，取注射部位皮膚 ，4%多聚甲醛固定過(guò)夜后，常規(guī)石蠟包埋，5ym厚度切片，進(jìn)行HE染色觀察。
HE染色步驟
① 切片梯度水合二甲苯I15分鐘一二甲苯II15分鐘一100%乙醇13分鐘一95%的乙醇11 3分鐘一85%乙醇3分鐘一75%乙醇3分鐘一50%乙醇3分鐘一蒸餾水洗3分鐘。
② 蘇木素染色2分鐘，自來(lái)水沖洗，至切片發(fā)藍(lán)。
③ 分色1%鹽酸乙醇分色3-5秒(提插數(shù)下)，且切片變紅，顏色較淺即可。
④ 返藍(lán)自來(lái)水浸泡15分鐘或溫水(約5(TC) 5分鐘。(顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞核藍(lán)色，細(xì)胞 質(zhì)和結(jié)締組織無(wú)色為宜)
復(fù)染伊紅液2分鐘。
⑥ 梯度脫水50%乙醇3分鐘一75%乙醇3分鐘一85%乙醇3分鐘一95%的乙醇3分鐘一 100%乙醇I3分鐘一100%乙醇II 3分鐘用吸水紙吸干多余乙醇，二甲苯I3分鐘一二甲苯II 3分鐘。
⑦ 封片將玻片從二甲苯中取出，用吸水紙搽去組織片周?chē)亩妆剑杆俚我坏沃行?樹(shù)脂于組織上，取清潔的蓋玻片，在酒精燈上烘一下去濕，以未烘的一面輕輕蓋在樹(shù)膠上， 應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
⑧ 觀察顯微鏡下觀察，照相。(2)器官培養(yǎng)
1) 取新生7天健康C57BL/6小鼠一只，此時(shí)毛囊處于生長(zhǎng)期，易于分離。頸椎脫臼處死 ，酒精棉球消毒觸須部位。眼科剪垂直皮膚剪下小鼠兩邊觸須皮膚，放入裝有D-Hank' s液 的培養(yǎng)皿中。用鑷子夾著皮膚稍做清洗，吸去多余D-Hank' s液；
2) 解剖顯微鏡下(X3.2)用27號(hào)針頭將毛囊連同結(jié)締組織鞘一起分出來(lái)，D-Hank' s液 洗凈，移入24孔板中，每孔5根毛囊，加入lml WilliamE無(wú)血清培養(yǎng)基；
3) 分別加入AdWnt3a、 AdGFP和等量PBS，使病毒終濃度達(dá)到10、fu/ml滴度，放入孵箱 培養(yǎng)。
4) 每2天換液，所有孔都加入相同的培養(yǎng)基。
5) 觀察每天在顯微鏡下觀察，用測(cè)微尺測(cè)量毛囊長(zhǎng)度并照相。 WilliamE無(wú)血清培養(yǎng)基配方
WilliamE: 100ml 氫化可的松10ng/ml 胰島素10ug/ml 谷氨酰胺2mmol/L 青霉素/鏈霉素100U/ml 實(shí)施例3結(jié)果分析
1. AdWnt3a的獲得
經(jīng)過(guò)多次擴(kuò)增，獲得AdWnt3a的滴度為109 pfu/ml。圖3為AdWnt3a感染293細(xì)胞2天的情 況。可見(jiàn)，感染后2天，293細(xì)胞感染率達(dá)100%。
2. Adwnt3a促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)
(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在注射AdWnt3a后9d，注射部位皮膚開(kāi)始變黑(18只中有15只出現(xiàn))； ll天，有毛干長(zhǎng)出表皮(12只中有10只出現(xiàn))；14天，毛干全長(zhǎng)出(12只中有11只出現(xiàn))。而整 個(gè)期間，注射AdGFP和注射PBS組，注射部位仍處于靜止期，與注射周邊無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖4 ，其中，左邊2只分別為PBS對(duì)照組和空載體對(duì)照組，右邊3只為AdWnt3a注射組。可見(jiàn)，注射 AdWnt3a部位長(zhǎng)出新的被毛(生長(zhǎng)期)，而其他部位仍處于靜止期。
HE染色觀察，AdWnt3a注射后3天，注射部位毛囊開(kāi)始出現(xiàn)生長(zhǎng)期早期結(jié)構(gòu)(6只中有4只出現(xiàn))；注射后5天，注射后部位毛囊呈生長(zhǎng)期表型(6只中6只出現(xiàn))；注射后7天、9天、 14天、28天毛囊均呈生長(zhǎng)期表型。整個(gè)期間，AdWnt3a注射組(圖5B)毛囊處于典型生長(zhǎng)期 ，而AdGFP組(圖5A)毛囊仍處于靜止期。 (2)器官培養(yǎng)
毛囊在分離后培養(yǎng)，繼續(xù)生長(zhǎng)(包括內(nèi)根鞘、外根鞘和毛干)。在加入AdWnt3a后，毛 囊生長(zhǎng)明顯加快。見(jiàn)圖6A和圖6B，實(shí)驗(yàn)組為加入AdWnt3a組，對(duì)照組為加入AdGFP組。培養(yǎng)毛 囊加入AdWnt3a后，毛囊生長(zhǎng)明顯加快。在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，AdWnt3a 作用后，毛囊呈現(xiàn)生長(zhǎng)期表型，使毛囊從靜止期向生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化。
用上述相同方法獲得AdWntlOb，并采用上述同樣的方法進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，AdWntl0b 同樣具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用。圖7為AdWntl0b處理后14d，左邊2只小鼠為AdWntl0b處理組 (注射部位沿背中線選取2點(diǎn))，右邊l只為對(duì)照組，可見(jiàn)，AdWntlOb處理組部位處于典型生 長(zhǎng)期，而未處理部位仍處于靜止期，S卩AdWntlOb促進(jìn)了毛囊的生長(zhǎng)。圖8A為AdWntl0b處理后 14d后HE染色結(jié)果，圖8B為AdGFP (對(duì)照)處理后14d后HE染色結(jié)果，與大體照相結(jié)果一致。
本實(shí)施例對(duì)小鼠的處理方法為皮內(nèi)注射給藥，通過(guò)涂抹、口服等給藥途徑可以達(dá)到同樣 的效果。
結(jié)論Wntl0b和Wnt3a同樣具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用，它們都是通過(guò)激活Wnt/{3 -catenin信號(hào)通路而發(fā)揮促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用。因此，其他通過(guò)該通路發(fā)揮作用的Wnt蛋白 同樣具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用。
本實(shí)施例對(duì)小鼠的處理方法為皮內(nèi)注射給藥，本發(fā)明所述生發(fā)劑采用其他給藥方式如涂 抹、口服等均可以達(dá)到本發(fā)明所述同樣的效果。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的 技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù) 范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種生發(fā)劑，其特征在于所述生發(fā)劑包含通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的Wnt蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的生發(fā)劑，其特征在于所述通過(guò)Wnt/{3 -catenin信號(hào)通路促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的Wnt蛋白為Wnt3a蛋白。
3.通過(guò)Wnt/e-catenin信號(hào)通路促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的Wnt蛋白在制備治療 脫發(fā)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有Wnt蛋白的生發(fā)劑，所述生發(fā)劑包含通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的Wnt蛋白。本發(fā)明所述生發(fā)劑使毛囊呈現(xiàn)生長(zhǎng)期表型，毛囊從靜止期向生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化，具有效果明顯，起效快，機(jī)制清楚等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)開(kāi)發(fā)促毛發(fā)生長(zhǎng)藥物具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101642563SQ20091030658
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者何通川, 李玉紅, 恬 楊, 連小華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)