專利名稱：醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用骨誘導(dǎo)金屬植入材料的制備方法，具體涉及一種醫(yī)用鈦合金
植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
良好的具有骨誘導(dǎo)能力的生物活性表面一直是困擾金屬材料植入物的一個難題。 目前金屬材料表面活性改性有多種方法，但迄今為止，應(yīng)用于臨床的還僅限于多孔表面和 磷酸鈣涂層，離理想的生物活性表面仍有很大差距。為了使金屬植入材料具有良好的生物 活性表面，發(fā)明人進(jìn)行了一系列的研究。在早期的研究中，先用RGD修飾材料微孔表面，再 將載藥微球復(fù)合到RGD的方法構(gòu)建材料表面的生長因子緩釋系統(tǒng)。然而一方面鈦珠燒結(jié)的 工藝尚有缺陷，燒結(jié)強(qiáng)度達(dá)不到要求，另一方面RGD作為多肽，與無機(jī)金屬材料表面的結(jié)合 強(qiáng)度始終難以保證。因此，尋找一種更有效，更牢固的結(jié)合就成為新的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供了能夠提高微球緩釋系統(tǒng)的穩(wěn) 定性，在醫(yī)用鈦合金植入物表面制備穩(wěn)定的緩釋型生長因子生物涂層，使內(nèi)固定材料在保 持優(yōu)良力學(xué)特性的同時(shí)具有良好的骨誘導(dǎo)、骨整合能力，以降低植入后假體松動等并發(fā)癥 發(fā)生的醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建方法。 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是1)醫(yī)用鈦合金植入物表面微溝嵴形 態(tài)的制備采用固態(tài)激光打標(biāo)機(jī)在醫(yī)用低彈P鈦合金表面制備微溝嵴；2)慶大霉素巰基化 明膠控釋微球的制備2. 1巰基化明膠的制備取lg明膠溶于lOOmL去離子水中，然后再加入 20mg的2-亞胺氫氯化硫醇，在室溫下反應(yīng)15h，然后將反應(yīng)殘余的2-亞胺氫氯化硫醇用鹽 酸溶液透析除去，真空干燥后于-S(TC保存得巰基化明膠；2. 2巰基化明膠微球的制備取巰 基化明膠溶于5(TC雙蒸水中配成質(zhì)量濃度為20% _30%的八液，501:下超聲均化，將201111 液體石蠟預(yù)熱至4(TC并加入0. 8ml的乳化劑span-80，然后按1 : 5的體積比將A液以30 滴/min勻速滴入加有乳化劑的液體石蠟中，邊滴邊攪拌得混懸液并將其迅速轉(zhuǎn)移至0 4°C的水浴中，然后加入異丙醇脫水繼續(xù)攪拌數(shù)分鐘，分別用異丙醇和乙醚清洗數(shù)次，洗掉 乳化劑和石蠟后再加入20ml質(zhì)量濃度為5%的戊二醛置于4t:冰箱中固化24h，采用乙醚 對固化后的物質(zhì)洗脫，洗掉殘留的戊二醛，室溫下真空干燥過篩，分裝,Co照射滅菌后密封 避光低溫保存得巰基化明膠微球；2. 3生長因子巰基化明膠微球的制備取空白巰基化明膠 微球，浸泡于4mol/L的rhBMP2鹽酸胍飽和溶液24h，真空凍干后得加載生長因子的巰基化 明膠微球；3)生長因子巰基化明膠控釋微球與植入材料表面復(fù)合3. 1植入材料表面的涂層 修飾將經(jīng)過步驟l處理后的醫(yī)用低彈13鈦合金植入材料先經(jīng)超聲清洗，然后將其浸入多巴 胺溶液中，調(diào)節(jié)至典型的海洋環(huán)境，空氣暴露，多巴胺自發(fā)沉積在鈦合金表面生成一層粘附 的聚合物薄膜；3. 2微球與植入材料的復(fù)合將生長因子巰基化明膠微球配制成0. 2mg/ml的 溶液，然后將已經(jīng)用多巴胺涂層表面修飾的植入材料放置于生長因子巰基化明膠微球溶液
3中，抽真空放置30min，取出得到醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)。 所述的固態(tài)激光打標(biāo)機(jī)為F-DPC-50A型固態(tài)激光打標(biāo)機(jī)，激光功率50W(max)，激
光波長1064um，焦距175cm，掃描速度2000mm/s，掃描頻率5. 5kHz。 所述的微溝嵴表面溝槽寬度為細(xì)胞級別50 ii m，深度為20 y m。所述的典型的海洋環(huán)境為每2mg多巴胺加入1毫升1Ommol/L的tris緩沖液，pH
=8. 5。 本發(fā)明在原有的醫(yī)用低彈13鈦合金鈦合金植入物表面抗生素緩釋系統(tǒng)基礎(chǔ)上， 創(chuàng)新性的引入了海洋仿生的多聚多巴胺涂層。有研究報(bào)導(dǎo)滲透壓信號的剌激可以使多巴胺 發(fā)生空間構(gòu)象變化從而對物體產(chǎn)生強(qiáng)力粘附。這一涂層在機(jī)械打磨、超聲等強(qiáng)物理作用下 也是相當(dāng)穩(wěn)定的。慶大霉素巰基化明膠微球通過與金屬表面的多聚多巴胺涂層的共價(jià)結(jié) 合，使微球牢固地結(jié)合于金屬材料表面。此方法與RGD修飾方法相比，涂層制備工藝更加簡 單，粘附更加強(qiáng)力可靠。利用該多聚多巴胺涂層對金屬微形態(tài)表面修飾，既滿足了對金屬表 面的強(qiáng)力粘附，又可以與巰基化明膠微球發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從理論上完全可以達(dá)到微球_涂 層-金屬表面的穩(wěn)定結(jié)合。


圖1A為規(guī)則微溝嵴表面放大圖，圖1B為不規(guī)則磨砂表面放大圖；圖2是成骨細(xì)胞 生長圖；其中圖2A為規(guī)則微溝嵴表面成骨細(xì)胞偽足伸展多，細(xì)胞形態(tài)好；圖2B為磨砂表面 成骨細(xì)胞偽足數(shù)量較少細(xì)胞形態(tài)不好；圖3是巰基化明膠的化學(xué)反應(yīng)圖；圖4是植入材料 表面的涂層修飾圖；圖5是微球與植入材料復(fù)合過程圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。 經(jīng)過前期研究，微溝嵴表面比光滑表面和不規(guī)則磨砂表面都更適合成骨細(xì)胞的粘 附和生長(見圖1，2)，且其制備工藝簡單，質(zhì)量容易控制，更適合工業(yè)化生產(chǎn)，相關(guān)研究結(jié) 果已經(jīng)發(fā)表(J皿Fu，Zheng Guo，Y皿yu Hu，Yongqimn Zhang，Yulin Hao，Shuj皿Li. Effect ofsurface micro—topogr鄰hy of titanium material on the behaviors of rabbit osteoblast in vitro. Applied Surface Science. 2008 ;255 :286-289)。因此，本申請采用 微溝嵴表面替代先前的鈦珠燒結(jié)表面，以克服燒結(jié)強(qiáng)度不足，燒結(jié)工藝復(fù)雜等難題。
在自然界中，藤壺、貽貝等生物能通過足絲盤分泌出一種特殊的粘性很強(qiáng)的蛋白 質(zhì)，即藤壺粘合蛋白，與巖石、船體等固體表面牢固結(jié)合。對多種不同來源的藤壺粘合蛋 白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白無一例外均含有高組分的酪氨酸殘基，在粘合反應(yīng)中，酪氨酸 在酪氨酸酶的作用下生成多巴胺，進(jìn)而在氧化條件下聚合為多聚多巴胺，從而形成牢固粘 合。在該機(jī)制被闡明之后，Lee等發(fā)現(xiàn)使用多巴胺作為原料可以在弱堿性氧化(10mmol/L Tris-HCl， pH 8.5，空氣暴露)條件下在多種材料表面形成多聚多巴胺涂層，并且該涂層極 為穩(wěn)定，甚至能經(jīng)受機(jī)械打磨、超聲和強(qiáng)酸的破壞作用。在此基礎(chǔ)之上，還有一個重要特性 就是可通過與含有巰基和氨基的有機(jī)物進(jìn)行麥克加成反應(yīng)或希夫堿反應(yīng)加入新涂層，這使 得該涂層可以作為材料表面的改性的橋梁，連接多種藥物。
在經(jīng)過反復(fù)的摸索和實(shí)驗(yàn)后，本申請最終找到了一種更佳的解決方案，即用多聚 多巴胺涂層修飾金屬材料微溝嵴表面，然后再用載藥的巰基化明膠進(jìn)行連接。
其制備過程如下1)醫(yī)用鈦合金植入物表面微溝嵴形態(tài)的制備采用固態(tài)激光 打標(biāo)機(jī)在醫(yī)用低彈P鈦合金表面制備表面溝槽寬度為細(xì)胞級別50 m，深度為20 m的 微溝嵴；所制備的規(guī)則微溝嵴表面應(yīng)有利于微球的嵌入，同時(shí)滿足新骨長入對微溝槽的要 求，所采用的固態(tài)激光打標(biāo)機(jī)為F-DPC-50A型固態(tài)激光打標(biāo)機(jī)，激光功率50W(max)，激光波 長1064urn，焦距175cm，掃描速度2000mm/s，掃描頻率5. 5kHz ;2)巰基化明膠控釋微球的 制備2. 1巰基化明膠的制備參照Sushma Kommareddy和Mansoor Ami ji的巰基化明膠制 備方法(Preparation andEvaluation of Thiol-Modified Gelatin Nanoparticles for Intracellular DNA Delivery in Response toGlutathione. Bioconjugate Chem. 2005， 16,1423-1432)。通過引入巰基部分與明膠的氨基進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)得到巰基化明膠(化學(xué)反 應(yīng)見圖3)。具體過程如下取lg明膠溶于lOOmL去離子水中，然后再加入20mg的2-亞胺 氫氯化硫醇，在室溫下反應(yīng)15h，然后將反應(yīng)殘余的2-亞胺氫氯化硫醇用鹽酸溶液透析除 去，真空干燥后于-8(TC保存得巰基化明膠；明膠巰基化的程度可以通過比色法來計(jì)算。將 巰基化明膠和普通明膠分別溶于等量的含lmmol/L依地酸(EDTA)O. lmol/L磷酸鹽的緩沖 液(PH = 8. 0)中，然后取500 ii L該溶液與100 ii L i矣爾曼試劑(ELLman' s reagent)和5mL 的緩沖液混合，室溫下即可發(fā)生比色反應(yīng)，反應(yīng)15min后，在412nm波長測吸光值。然后根 據(jù)半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出每克明膠中含多少mmol巰基。 2. 2巰基化明膠微球的制備參照Fuj imoto S的乳化冷凝法(Effects of intra_aterally biodegradable microsphere containingMitomycin C.Cancer,1985 5 55 :522)并加以改進(jìn)；具體過程如下取巰基化明膠溶于50°C雙蒸水中配成質(zhì)量濃度為 20% -30%的A液，將20ml液體石蠟預(yù)熱至40。C并加入0. 8ml的乳化劑span-80，然后按 1 : 5的體積比將A液以30滴/min勻速滴入加有乳化劑的液體石蠟中，邊滴邊攪拌得混懸
液并將其迅速轉(zhuǎn)移至0 4t:的水浴中，然后加入異丙醇脫水繼續(xù)攪拌數(shù)分鐘，分別用異丙
醇和乙醚清洗數(shù)次，洗掉乳化劑和石蠟后再加入20ml質(zhì)量濃度為5%的戊二醛置于4t:冰 箱中固化24h，采用乙醚對固化后的物質(zhì)洗脫，洗掉殘留的戊二醛，室溫下真空干燥過篩，分 裝嚴(yán)Co照射滅菌后密封避光低溫保存得巰基化明膠微球；2. 3生長因子巰基化明膠微球的 制備稱取適量()空白巰基化明膠微球，浸泡于4mol/L的rhBMP2鹽酸胍飽和溶液24h，真 空凍干后得加載生長因子的巰基化明膠微球。 3)生長因子基化明膠控釋微球與植入材料表面復(fù)合3. 1植入材料表面的涂層修 飾(見圖4)將經(jīng)過步驟l處理后的醫(yī)用低彈13鈦合金植入材料先經(jīng)超聲清洗，然后將其 浸入多巴胺溶液中，調(diào)節(jié)至典型的海洋環(huán)境(每2mg多巴胺加入1毫升10mmol/L的tris， pH = 8. 5)，空氣暴露，多巴胺自發(fā)沉積在鈦合金表面生成一層粘附的聚合物薄膜；涂層的 厚度與反應(yīng)時(shí)間有函數(shù)關(guān)系，如反應(yīng)24h，涂層厚度可以達(dá)到50nm，涂層厚度可用原子力顯 微鏡測定。 3. 2微球與植入材料的復(fù)合(見圖5)將生長因子巰基化明膠微球配制成0. 2mg/ ml的溶液，然后將已經(jīng)用多巴胺涂層表面修飾的植入材料放置于生長因子慶大霉素明膠微 球溶液中，抽真空放置30min，取出得到醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)。通過測 定混合液中巰基化明膠微球的剩余量，得出明膠微球與植入材料表面的結(jié)合量。最終得到
5醫(yī)用鈦合金植入物表面生長緩釋系統(tǒng)c
權(quán)利要求
醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于1)醫(yī)用鈦合金植入物表面微溝嵴形態(tài)的制備采用固態(tài)激光打標(biāo)機(jī)在醫(yī)用低彈β鈦合金表面制備微溝嵴；2)慶大霉素巰基化明膠控釋微球的制備2.1巰基化明膠的制備取1g明膠溶于100mL去離子水中，然后再加入20mg的2-亞胺氫氯化硫醇，在室溫下反應(yīng)15h，然后將反應(yīng)殘余的2-亞胺氫氯化硫醇用鹽酸溶液透析除去，真空干燥后于-80℃保存得巰基化明膠；2.2巰基化明膠微球的制備取巰基化明膠溶于50℃雙蒸水中配成質(zhì)量濃度為20％-30％的A液，，50℃下超聲均化，將20ml液體石蠟預(yù)熱至40℃并加入0.8ml的乳化劑span-80，然后按1∶5的體積比將A液以30滴/min勻速滴入加有乳化劑的液體石蠟中，邊滴邊攪拌得混懸液并將其迅速轉(zhuǎn)移至0～4℃的水浴中，然后加入異丙醇脫水繼續(xù)攪拌數(shù)分鐘，分別用異丙醇和乙醚清洗數(shù)次，洗掉乳化劑和石蠟后再加入20ml質(zhì)量濃度為5％的戊二醛置于4℃冰箱中固化24h，采用乙醚對固化后的物質(zhì)洗脫，洗掉殘留的戊二醛，室溫下真空干燥過篩，分裝，60Co照射滅菌后密封避光低溫保存得巰基化明膠微球；2.3生長因子巰基化明膠微球的制備取空白巰基化明膠微球，浸泡于4mol/L的rhBMP2鹽酸胍飽和溶液24h，真空凍干后得加載生長因子的巰基化明膠微球；3)生長因子巰基化明膠控釋微球與植入材料表面復(fù)合3.1植入材料表面的涂層修飾將經(jīng)過步驟1處理后的醫(yī)用低彈β鈦合金植入材料先經(jīng)超聲清洗，然后將其浸入多巴胺溶液中，調(diào)節(jié)至典型的海洋環(huán)境，空氣暴露，多巴胺自發(fā)沉積在鈦合金表面生成一層粘附的聚合物薄膜；3.2微球與植入材料的復(fù)合將生長因子巰基化明膠微球配制成0.2mg/ml的溶液，然后將已經(jīng)用多巴胺涂層表面修飾的植入材料放置于生長因子巰基化明膠微球溶液中，抽真空放置30min，取出得到醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特 征在于所述的固態(tài)激光打標(biāo)機(jī)為F-DPC-50A型固態(tài)激光打標(biāo)機(jī)，激光功率50W(max)，激光 波長1064um，焦距175cm，掃描速度2000mm/s，掃描頻率5. 5kHz。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特 征在于所述的微溝嵴表面溝槽寬度為細(xì)胞級別50 ii m，深度為20 ii m。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特 征在于所述的典型的海洋環(huán)境為每2mg多巴胺加入1毫升1Ommol/L的tris緩沖液，pH =8. 5。
全文摘要
醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建方法，首先在醫(yī)用低彈β鈦合金表面制備微溝嵴；將明膠溶于去離子水中再加入2-亞胺氫氯化硫醇經(jīng)透析、干燥得巰基化明膠；取巰基化明膠溶于雙蒸水超聲均化制成B液，在液體石蠟中加入乳化劑，然后將B液滴入加有乳化劑的液體石蠟中，異丙醇和乙醚清洗再加入戊二醛后固化，乙醚對固化后的物質(zhì)洗脫干燥過篩，60Co照射滅菌后得巰基化明膠微球；將微球浸泡于rhBMP2鹽酸胍飽和溶液，真空凍干后得加載生長因子的巰基化明膠微球。將醫(yī)用低彈β鈦合金植入材料浸入多巴胺溶液中在鈦合金表面生成一層粘附的聚合物薄膜；將表面修飾的植入材料放置于生長因子巰基化明膠微球溶液中，抽真空得到醫(yī)用鈦合金植入物表面生長因子緩釋系統(tǒng)。
文檔編號A61L27/54GK101791439SQ20101014254
公開日2010年8月4日 申請日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者吳紅, 李小康, 郝玉琳, 郭征 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)