專利名稱：乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗制備方法及其制備的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療性疫苗及其制備方法，尤其涉及一種乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞 治療性疫苗的制備方法及其制備的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)是一種嗜肝的DNA病毒。乙型病毒性肝炎簡(jiǎn)稱乙型肝炎，是 由HBV引起，主要通過血液、體液及母嬰傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)的傳染病。目前世界上有 3億多人為慢性HBV感染，我國(guó)約占半數(shù)。此種感染容易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，少數(shù)病 例可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝細(xì)胞癌，是當(dāng)前WHO公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。為 此，尋求理想的抗HBV藥物一直是亟待解決的研究課題。目前，慢性HBV感染主要采用抗病 毒藥物進(jìn)行治療，應(yīng)用的抗病毒藥物主要有干擾素和核苷類藥物如拉米夫定等，其中，干擾 素的適應(yīng)癥有限，療效較差，不良反應(yīng)發(fā)生率較高，且價(jià)格昂貴；拉米夫定作為逆轉(zhuǎn)錄酶的 強(qiáng)抑制劑，在控制慢性HBV感染方面具有確切的近期療效，且有良好的耐受性，但其不能清 除肝細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的來源，長(zhǎng)期用藥又存在耐藥問題。因此，積極尋求更為有效的抗病毒 藥物仍為當(dāng)務(wù)之急。CD8+T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要組成部分，在針對(duì)病毒、細(xì)菌和真菌等病原性微 生物以及惡性腫瘤等的免疫監(jiān)視、免疫防御以及免疫治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。HBV感染 的慢性化主要是由于機(jī)體對(duì)HBV的免疫應(yīng)答特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答不能清除病原，從而導(dǎo) 致感染的持續(xù)存在。在急性HBV感染時(shí)，機(jī)體存在大量的針對(duì)HBV多個(gè)抗原表位的多特異 性、多克隆的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，而在慢性HBV感染時(shí)，這些CTL應(yīng)答非常微弱甚 至檢測(cè)不到。因此，采取恰當(dāng)?shù)拿庖叻绞剑蚱茩C(jī)體對(duì)HBV的免疫耐受，重建活躍的免疫應(yīng) 答，有望清除病毒，終止慢性HBV感染。乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是HBV的一種結(jié)構(gòu) 蛋白，是機(jī)體CTL識(shí)別和攻擊HBV感染細(xì)胞的主要靶抗原。因此，增強(qiáng)HBcAg特異性的CTL 應(yīng)答，有望終止慢性HBV感染。但是，HBV的慢性患者存在免疫應(yīng)答低，特異性細(xì)胞免疫激活不足，外周免疫耐受 等問題，在設(shè)計(jì)治療性疫苗時(shí)需增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)HBV的識(shí)別能力以激發(fā)有力的特異性細(xì)胞 免疫。樹突狀細(xì)胞(DC)是體內(nèi)最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，能夠識(shí)別、捕獲、加工、遞呈 抗原引發(fā)初始免疫反應(yīng)。利用DC來改善病毒的免疫原性是治療性疫苗設(shè)計(jì)的重要策略之 一。DC顯著的特點(diǎn)是①為功能很強(qiáng)的專職APC ；②可分泌極化信號(hào)誘導(dǎo)ThO細(xì)胞向Thl細(xì) 胞分化；③可通過“交叉激活”途徑激活⑶8+T細(xì)胞。因此，若將抗原特異性地靶向DC，定能 增強(qiáng)疫苗的療效。DC表面具有Fc受體，為設(shè)計(jì)DC靶向性疫苗創(chuàng)造了條件。免疫球蛋白G(IgG)Fc片段是抗體恒定區(qū)重要的結(jié)構(gòu)域，是抗體分子與效應(yīng)分子 和細(xì)胞相互作用的部位，F(xiàn)c能介導(dǎo)抗體的多種生物學(xué)功能。Fc不僅能夠激活補(bǔ)體系統(tǒng)， 而且還能介導(dǎo)抗原抗體復(fù)合物通過Fc受體與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合，并在受體的介導(dǎo)下促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)外來抗原的吞噬，進(jìn)而激發(fā)機(jī)體對(duì)特定抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)。由于Fc具 有介導(dǎo)細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，所以人們利用Fc片段與特異抗原蛋白進(jìn)行融合，以促進(jìn)抗原 對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的靶向性，提高機(jī)體對(duì)特異抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答反 應(yīng)。研究已證明，在抗原呈遞細(xì)胞中，通過Fc受體介導(dǎo)內(nèi)吞的外來抗原，不僅可以大幅度 (1000 10000倍)促進(jìn)MHC II途徑呈遞抗原的活性而激活⑶4+T細(xì)胞，而且還可以通過 MHC I交叉呈遞抗原作用激活CD8+T細(xì)胞。所以用Fc融合抗原可以刺激機(jī)體抗原特異性的 淋巴細(xì)胞毒性反應(yīng)，所以可被用于病毒的免疫治療。免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、膽固醇及磷脂混合后自發(fā)形成 的一種直徑為30 40nm的球形籠狀顆粒，具有佐劑和抗原遞呈的雙重功能，可大幅度提高 抗原的免疫原性。文獻(xiàn)報(bào)道，以ISCOM為佐劑制得的DNA疫苗誘導(dǎo)的中和抗體水平和免疫 保護(hù)力明顯高于裸DNA，可能的機(jī)制是經(jīng)ISCOM包裹的DNA能免受體內(nèi)核酸酶的降解，從而 保證該DNA在機(jī)體內(nèi)持續(xù)表達(dá)。另外，ISCOM的結(jié)構(gòu)特性使其更易于定居在淋巴組織內(nèi)，從 而有利于抗原遞呈細(xì)胞的吞噬。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備方法及其 制備的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗。本發(fā)明還提供上述的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備方法，其主要包含 步驟1)構(gòu)建乙肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載 體；2)制備免疫刺激復(fù)合物將步驟1)中獲得的乙肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球 蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，冰浴超 聲處理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的免疫刺激復(fù)合物；3)步驟2)獲得的免疫刺激復(fù)合物活化刺激樹突狀細(xì)胞獲得所述細(xì)胞治療性疫
田ο根據(jù)上述方法，步驟1)具體包括將HBcAg全長(zhǎng)cDNA插入含有IRES的雙基因共 表達(dá)真核載體的IRES上游，再將Fc全長(zhǎng)cDNA插入該真核載體的IRES下游，獲得HBcAg和 Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體。其中，步驟1)中所述HBcAg全長(zhǎng)cDNA經(jīng)SEQ ID NO :3_4所示的引物擴(kuò)增獲得；所 述免疫球蛋白G的Fc全長(zhǎng)cDNA經(jīng)SEQ IDNO :5_6所示的引物擴(kuò)增獲得。步驟2)的免疫刺激復(fù)合物中，所述乙肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc 雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂的質(zhì)量比為5 10 1 1。根據(jù)上述方法，所述表達(dá)載體優(yōu)選為pT-Easy載體。由上述方法制備的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗，其為免疫刺激復(fù)合物活化 刺激樹突狀細(xì)胞所得的細(xì)胞治療性疫苗，其中免疫刺激復(fù)合物主要由乙肝病毒核心抗原 HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組 成。所述乙肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體是在含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES的雙基因共表達(dá)真核載體的IRES上游和下游分別插入 HBcAg全長(zhǎng)cDNA和免疫球蛋白G的Fc全長(zhǎng)cDNA而構(gòu)成。所述HBcAg全長(zhǎng)cDNA經(jīng)SEQ ID NO :3_4所示的引物擴(kuò)增獲得；所述免疫球蛋白G 的Fc全長(zhǎng)cDNA經(jīng)SEQ ID NO :5_6所示的引物擴(kuò)增獲得。所述的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗，其中表達(dá)載體優(yōu)選為pT-Easy載體。所述免疫刺激復(fù)合物中，乙肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共 表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂的質(zhì)量比為5 10 1 1。本發(fā)明的乙肝治療性樹突狀細(xì)胞疫苗能夠促進(jìn)乙肝病毒核心抗原特異性T細(xì)胞 免疫應(yīng)答，高效誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的抗病毒復(fù)制的能力，可用作制備乙肝病毒治療性疫苗。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1為PCR擴(kuò)增HBcAg基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖2為PCR擴(kuò)增Fc基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖3為透射電鏡檢測(cè)免疫復(fù)合物疫苗的結(jié)構(gòu)；圖4為光鏡下檢測(cè)樹突狀細(xì)胞活化后的結(jié)構(gòu)；圖5為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)法檢測(cè)乙肝治療性樹突狀細(xì)胞疫苗激發(fā)T細(xì)胞分 泌干擾素-Y (IFN-y)的能力；圖6為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT活性檢測(cè)結(jié)果；圖7為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA抑制率檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備1、HBcAg和Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建(I)HBcAg基因的克隆根據(jù)GenBank登錄號(hào)為NC_003977. 1的HBcAg基因序列，設(shè)計(jì)并合成 如下引物以PCR擴(kuò)增兩端帶有酶切位點(diǎn)的HBcAg cDNA全長(zhǎng)F1 :5，-aatctgcag ggcatggacatcgacccttat-3，(SEQ ID No :3)，下劃線部分為 Pst I 酶切位點(diǎn)；Rl :5，-tacg aattcagttccccaccttatgagtc-3‘ (SEQ ID No :4)，下劃線部分為 EcoR I 酶切位點(diǎn)；分離 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X IO7個(gè)/mL，收 集細(xì)胞，PBS洗滌3次，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA ；將所得細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，再以該cDNA為模板、Fl和Rl為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C預(yù)變性3 分鐘，然后94°C變性1分鐘、58 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延 伸7分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與ρ-Τ Easy 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒，委托上海生工公司測(cè)定質(zhì)粒序列，將插入了 HBcAg cDNA全長(zhǎng)序 列(SEQ ID No 1)的陽性克隆質(zhì)粒命名為pT-HBcAg;PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳道為 PCR產(chǎn)物，可見PCR產(chǎn)物在約550bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(2) Fc全長(zhǎng)cDNA的克隆根據(jù)GenBank登錄號(hào)為NM_000566的Fc基因序列，設(shè)計(jì)并合成如下引物以PCR擴(kuò) 增兩端帶有酶切位點(diǎn)的FC全長(zhǎng)cDNA 上游引物F2 :5，-gatcggatccatgtggttcttgacaactct -3，(SEQ ID No :5)，下劃線部分為 BamH I 酶切位點(diǎn)；下游引物R2 :5，_acgcgtcgacctacttgg ccccctg-3' (SEQ ID No :6)，下劃線部分為Sal I酶切位點(diǎn)；按Trizol試劑盒說明書提取人 脾臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，采用上下游引物F2和R2進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR總體系為50 μ L，PCR條件為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C 退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠 電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與pT-Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，委托上海生工 生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，將插入了 Fc全長(zhǎng)cDNA序列(SEQ ID No 2)的陽性 克隆質(zhì)粒命名為重組載體PT-Fc。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳 道為PCR產(chǎn)物，可見PCR產(chǎn)物在約1200bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(3) HBcAg和Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建根據(jù)HBcAg和Fc全長(zhǎng)cDNA兩端所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，先將HBcAg全長(zhǎng)cDNA插入 含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES的雙基因共表達(dá)真核載體pStar的IRES上游，再將FC全 長(zhǎng)cDNA插入pStar載體的IRES下游。具體方法為先將重組載體pT-HBcAg用Pst I和 EcoR I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)Pst I和EcoR I 雙酶切的真核載體PStar連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉 素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，Pst I和EcoR I雙酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為 重組載體pStar-HBcAg ；再將重組載體pT_FC用BamH I和Sal I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝 膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-HBcAg 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克 隆，提取質(zhì)粒，BamH I和Sal I雙酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為HBcAg和FC雙基因共 表達(dá)重組真核載體pStar-HBcAg-IRES-FC。2、HBcAg-Fc雙基因免疫刺激復(fù)合物ISCOM的制備將HBcAg和Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體pStar-HBcAg-IRES-Fc用磷酸鹽緩沖 液即PBS溶解后，加入皂苷QuilA，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg和 Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. Img和卵磷脂0. ImgJjC 浴超聲處理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的免疫刺激復(fù) 合物ISCOM。3、透射電鏡分析將新鮮制備的免疫刺激復(fù)合物ISCOM滴于200目銅網(wǎng)上，吸附3min。吸水紙吸干， 晾干30s。以(W/V)水溶性醋酸鈾負(fù)染30s，吸水紙吸干，晾干30s。80kV透射電鏡觀
6察，結(jié)果如圖3，復(fù)合物呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數(shù)顆粒長(zhǎng)徑小于25nm。4、樹突狀細(xì)胞疫苗的制備無菌條件下提取小鼠股骨骨髓細(xì)胞，放入PRMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血 清，0. Iml青-鏈霉素)中吹打混勻，3h后取貼壁細(xì)胞加入IL-4(終濃度為500U/ml)和 GM-CSF (終濃度為1000U/ml)，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天半量更換1次培養(yǎng)液， 同時(shí)加入GM-CSF和IL-4，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的生成。并用0. Img的免疫刺激復(fù)合物ISCOM與 1 χ IO6的樹突狀細(xì)胞共孵育，370C，24h，所活化的樹突狀細(xì)胞即為樹突狀細(xì)胞疫苗，光鏡觀 察結(jié)果如圖4。二、樹突狀細(xì)胞疫苗的抗病毒活性研究效應(yīng)細(xì)胞的制備將30只6 8周齡雌性HBV轉(zhuǎn)基因Babl/c小鼠隨機(jī)分為3組 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，每組10只；將HBcAg-Fc雙基因免疫刺激復(fù)合物ISCOM和HBcAg 免疫刺激復(fù)合物ISCOM活化的樹突狀細(xì)胞1 X IO6于小鼠背側(cè)尾根部皮下注射免疫原，每只 100 μ L，之后每間隔1周，以同樣方法加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次。實(shí)驗(yàn)組以HBcAg-FC雙 基因免疫刺激復(fù)合物ISCOM活化的樹突狀細(xì)胞為免疫原，對(duì)照組以HBcAg免疫刺激復(fù)合物 ISCOM活化的樹突狀細(xì)胞為免疫原，空白組以濃度為0. lmol/L、pH為7. 4的PBS為免疫原。1、ELISP0T法檢測(cè)樹突狀細(xì)胞激發(fā)CTL分泌IFN- γ的能力 末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，在無菌條件下取脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨，收集細(xì) 胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，用含有質(zhì)量百分濃 度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為IX IO6個(gè)/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞； 采用ELISP0T檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒說明書操作在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入 體積百分濃度為70%的乙醇100 μ L，室溫放置10分鐘，PBS洗滌，再加入IFN-γ捕獲抗體 (稀釋度為1 100) 100yL，溫度4°C孵育過夜，PBS洗滌，再加入質(zhì)量百分濃度為2%的脫 脂奶粉100 μ L，室溫封閉2小時(shí)，PBS洗滌，再加入效應(yīng)細(xì)胞100 μ L，溫度37°C孵育48小時(shí)， PBST (即含有質(zhì)量百分濃度為0. 的吐溫20的PBS)洗滌，再加入生物素標(biāo)記的抗IFN-γ 抗體(稀釋度為1 100) 100 μ L，溫度37°C孵育1.5小時(shí)，PBST洗滌，再加入鏈霉親和素 標(biāo)記的堿性磷酸酶(稀釋度為1 5000) 100 μ L，溫度37°C孵育1小時(shí)，PBST洗滌，拍干培 養(yǎng)板，再加入即用型BCIP/NBT底物反應(yīng)液100 μ L，室溫避光顯色2 10分鐘至斑點(diǎn)形成， 用蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(不加入效應(yīng)細(xì)胞)，各組斑 點(diǎn)數(shù)以3個(gè)復(fù)孔的均值表示。結(jié)果見圖5，實(shí)驗(yàn)組的斑點(diǎn)數(shù)明顯高于對(duì)照組、空白組和陰性對(duì)照組，表明本發(fā)明 的HBcAg-Fc雙基因免疫刺激復(fù)合物ISCOM活化的樹突狀細(xì)胞具有良好的免疫原性，能夠有 效激發(fā)CTL分泌IFN- γ。2、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT活性檢測(cè)末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，取眼眶靜脈血，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清ALT活 性。結(jié)果見圖6，實(shí)驗(yàn)組的血清ALT活性明顯高于對(duì)照組、空白組和陰性對(duì)照組，表明 本發(fā)明的HBcAg-Fc雙基因免疫刺激復(fù)合物ISCOM活化的樹突狀細(xì)胞能夠有效激發(fā)CTL產(chǎn) 生細(xì)胞毒效應(yīng)，殺傷HBV感染肝細(xì)胞，從而導(dǎo)致血清ALT活性明顯升高。3、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA抑制率檢測(cè)
末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，取眼眶靜脈血，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清HBV DNA抑制率。結(jié)果見圖7，實(shí)驗(yàn)組的血清HBV DNA抑制率明顯高于對(duì)照組、空白組和陰性對(duì)照 組，表明本發(fā)明的HBcAg-Fc雙基因免疫刺激復(fù)合物ISCOM活化的樹突狀細(xì)胞能夠有效抑制 HBV的復(fù)制，顯著降低血清HBV DNA載量。以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì) 節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
一種乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備方法，其特征在于，包含步驟1)構(gòu)建乙肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體；2)制備免疫刺激復(fù)合物將步驟1)中獲得的乙肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，冰浴超聲處理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的免疫刺激復(fù)合物；3)步驟2)獲得的免疫刺激復(fù)合物活化刺激樹突狀細(xì)胞獲得所述細(xì)胞治療性疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)包括將HBcAg全長(zhǎng)cDNA插 入含有IRES的雙基因共表達(dá)真核載體的IRES上游，再將Fc全長(zhǎng)cDNA插入該真核載體的 IRES下游，獲得HBcAg和Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中所述HBcAg全長(zhǎng)cDNA經(jīng) SEQ ID NO :3-4所示的引物擴(kuò)增獲得；所述免疫球蛋白G的Fc全長(zhǎng)cDNA經(jīng)SEQ ID NO 5-6 所示的引物擴(kuò)增獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)的免疫刺激復(fù)合物中，所述乙 肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil Aji 固醇及卵磷脂的質(zhì)量比為5 10 1 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為pT-Easy載體。
6.由權(quán)利要求1所述的方法制備的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征在于， 其為免疫刺激復(fù)合物活化刺激樹突狀細(xì)胞所得的細(xì)胞治療性疫苗，其中免疫刺激復(fù)合物 主要由乙肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷 QuilA、膽固醇及卵磷脂組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征在于，所述乙肝 病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體是在含有內(nèi)部核糖 體進(jìn)入位點(diǎn)IRES的雙基因共表達(dá)真核載體的IRES上游和下游分別插入HBcAg全長(zhǎng)cDNA 和免疫球蛋白G的Fc全長(zhǎng)cDNA而構(gòu)成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征在于，所述HBcAg 全長(zhǎng)cDNA經(jīng)SEQ ID NO :3_4所示的引物擴(kuò)增獲得；所述免疫球蛋白G的Fc全長(zhǎng)cDNA經(jīng) SEQ ID NO :5-6所示的引物擴(kuò)增獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征在于， 所述表達(dá)載體為pT-Easy載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征在于，所述免疫 刺激復(fù)合物中，乙肝病毒核心抗原HBcAg與免疫球蛋白G的Fc雙基因共表達(dá)重組真核載 體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂的質(zhì)量比為5 10 1 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備方法及其制備的乙肝病毒的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗，包含步驟構(gòu)建HBcAg與Fc雙基因共表達(dá)重組真核載體；將獲得的雙基因共表達(dá)重組真核載體加入皂苷Quil A，加入膽固醇及卵磷脂，冰浴超聲處理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物為形成的免疫刺激復(fù)合物；獲得的免疫刺激復(fù)合物活化刺激樹突狀細(xì)胞獲得所述細(xì)胞治療性疫苗。該疫苗通過高效轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，生成的融合蛋白通過Fc片段再次高效靶向樹突狀細(xì)胞，從而激活樹突狀細(xì)胞，促進(jìn)乙肝病毒核心抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，高效誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的抗病毒復(fù)制的能力，可作為乙肝病毒治療性疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/29GK101897965SQ201010212029
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)