專利名稱：以貝殼基質(zhì)為原料制備人工皮膚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物組織工程及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以貝殼基質(zhì)為原 料制備人工皮膚的方法。
背景技術(shù)：
對(duì)于重度燒傷患者在臨床上需要為其進(jìn)行人工植皮。采用自體皮膚進(jìn)行植皮是最 佳治療方案。然而，大面積燒傷患者通常無法提供充足的自體皮膚以供移植，故采用同種異 體皮膚進(jìn)行移植。在使用異體皮膚治療燒傷患者的醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，首先需要進(jìn)行配型，而且來 源有限。這就促使人們進(jìn)行人工皮膚的研究。目前，我國(guó)的燒傷治愈率處世界一流水平。然 而被治愈的患者的皮膚缺乏汗腺。所以，目前在人工皮膚的研究中，如何促進(jìn)燒傷患者皮膚 汗腺的再生是研究的前沿問題。利用干細(xì)胞進(jìn)行燒傷患者的治療以促進(jìn)皮膚汗腺的再生是 目前研究的熱點(diǎn)，并得到了大量的研究成果。在這些不同來源的干細(xì)胞中，骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞(bone marrow stem cell, bMSC)由于取材方便、來源充足，在取材過程中不會(huì)對(duì)供體造 成嚴(yán)重傷害，也不會(huì)對(duì)供體的正常生命活動(dòng)造成顯著影響，同時(shí)，關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的 相關(guān)研究非常充分，這就決定了它是一種有望廣泛應(yīng)用于臨床的較為理想的干細(xì)胞種類。 目前已經(jīng)有利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功修復(fù)燒傷患者皮膚汗腺的報(bào)道。人工皮膚是指通過人工方法制作的片狀或膜狀物，在臨床上用于覆蓋皮膚缺損患 者(主要是皮膚燒傷患者)的皮膚缺損部位，從而促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合。這種愈合并不意 味著汗腺的修復(fù)或再生。人工皮膚的功能主要體現(xiàn)在以下方面①覆蓋皮膚創(chuàng)面，與外界環(huán)境隔離開來，以避免感染。②作為藥物的釋放載體，持續(xù)地給創(chuàng)面給藥，以促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。③作為種子細(xì)胞的載體，利用種子細(xì)胞的分泌、遷移，組織重構(gòu)等功能對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行 全面修復(fù)。目前所報(bào)道的人工皮膚的功能一般包含上述功能中的一種或多種。在利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)燒傷患者皮膚汗腺的研究中，一般是將骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞懸液直接涂布于患者皮膚創(chuàng)面，也有將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與材料復(fù)合制備人工皮膚 的報(bào)道。但尚未見將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與貝殼基質(zhì)復(fù)合制備人工皮膚的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種以貝殼基質(zhì)和骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞為材料制備人工皮膚的方法。本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外首次以貝殼基質(zhì)為種子細(xì)胞載體，構(gòu) 建具有生物活性的、可以促進(jìn)患者皮膚汗腺重建的人工皮膚。貝殼是軟體動(dòng)物體外的一種保護(hù)性結(jié)構(gòu)。由5-10% (w/w)的有機(jī)物和90-95% (w/ w)的無機(jī)物構(gòu)成。無機(jī)物主要為碳酸鈣，有機(jī)物即貝殼基質(zhì)主要為糖蛋白及多糖。用稀酸 將貝殼處理后，其中的無機(jī)物被酸溶解，剩余部分即為貝殼基質(zhì)。貝殼基質(zhì)在天然狀態(tài)下， 為由規(guī)整的五邊形或六邊形管狀結(jié)構(gòu)組成的立體網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)格的壁厚為1微米左右。網(wǎng)格多邊形的邊長(zhǎng)為25微米左右。本發(fā)明中所述的貝殼為背角無齒蛘(Anodonta woodiana)貝殼。背角無齒蛘俗稱 “河蛘”，屬軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，蛘科，營(yíng)淡水生，在重慶地區(qū)的資源貯量極其豐富。其貝殼 由相同形狀的兩瓣貝殼組成。成年河蛘的貝殼為扇形，厚度為1毫米左右，縱軸為150毫米 左右，橫軸為90毫米左右。貝殼基質(zhì)的形態(tài)與貝殼形態(tài)基本一致。貝殼基質(zhì)來源豐富，價(jià)格低廉。與目前所有應(yīng)用于人工皮膚研究中的材料相比，貝 殼基質(zhì)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下方面①貝殼基質(zhì)的成分以多糖為主，與其他應(yīng)用于人工皮膚的生物組織來源的材料相 比，具有更低的免疫原性，同時(shí)還具有促細(xì)胞增殖的功能。②貝殼基質(zhì)具有規(guī)整的空間網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。目前報(bào)道的人工皮膚也具有空間網(wǎng)格狀結(jié) 構(gòu)，但是孔徑的大小及分布極不均勻，這種結(jié)構(gòu)的人工皮膚與種子細(xì)胞復(fù)合后，種子細(xì)胞一 般僅在表面粘附，少數(shù)進(jìn)入人工皮膚空隙的種子細(xì)胞，在人工皮膚移植于患者創(chuàng)面后，很難 向外生長(zhǎng)以參與創(chuàng)面的修復(fù)。與目前所報(bào)道的人工皮膚相比，貝殼基質(zhì)所具有的這種規(guī)整 的空間網(wǎng)格薄壁結(jié)構(gòu)，為種子細(xì)胞的立體粘附提供了有利條件。同時(shí)，在本人工皮膚移植于 患者創(chuàng)面后，這種規(guī)整的空間網(wǎng)格薄壁結(jié)構(gòu)還可以為汗腺腺泡的發(fā)育提供一種三維支架， 以引導(dǎo)皮膚組織重建。③貝殼基質(zhì)具有親水性，可以避免在患者體溫作用下，由于人工皮膚中水分的揮 發(fā)而變干乃至連帶創(chuàng)面皸裂。貝殼基質(zhì)具有可降解性，隨著創(chuàng)面的修復(fù)，貝殼基質(zhì)逐步被降 解吸收，可避免清創(chuàng)過程給患者所導(dǎo)致的痛苦。本發(fā)明以貝殼基質(zhì)為原料制備人工皮膚的方法依次通過下列步驟實(shí)現(xiàn)(1)貝殼的準(zhǔn)備取河蛘，去除內(nèi)臟團(tuán)和閉殼肌，40°C烘干，去角質(zhì)層，沿貝殼外周去除5毫米寬度；(2)貝殼基質(zhì)的制備將貝殼浸泡于v/v濃度為1-5%的鹽酸和v/v濃度為5-20%的戊二醛混合溶液 中，1周，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗3次，每次2小時(shí)，75%醫(yī)用酒精浸泡2分鐘，得貝殼基 質(zhì)，置于磷酸鹽緩沖溶液密封保存?zhèn)溆茫?3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的準(zhǔn)備常規(guī)方法取骨髓1毫升，流式細(xì)胞儀分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，置于含v/v濃度為 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，常規(guī)方法制成細(xì)胞懸液；(4)人工皮膚的制備將步驟(2)所得貝殼基質(zhì)置于含明膠基底的培養(yǎng)皿中，展平，胎牛血清表襯8-12 小時(shí)，加入細(xì)胞濃度為lX106-lX107ml的步驟(3)所得細(xì)胞懸液，至淹沒貝殼基質(zhì)為止， 培養(yǎng)12小時(shí)，沿培養(yǎng)皿邊緣吸出培養(yǎng)基，添加DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)至淹沒貝殼基質(zhì)， 每隔3天換液一次，培養(yǎng)至15-20天為止，得人工皮膚。人工皮膚的保存及運(yùn)輸更換新鮮完全培養(yǎng)基后，連同培養(yǎng)皿一起密封，平置，低溫保存(0_8°C )及運(yùn)輸， 保質(zhì)期3-7天。人工皮膚的使用臨床移植前，可根據(jù)患者創(chuàng)部的形態(tài)將人工皮膚任意切割成所需形態(tài)，單層覆蓋
4在患者創(chuàng)部。若創(chuàng)面較大，可將多張人工皮膚一起使用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明所制備的人皮膚與報(bào)道的相關(guān)研究相比，具有材料來源豐富價(jià)廉物美的優(yōu) 點(diǎn)。同時(shí)，具有較低的免疫原性，可以為患者皮膚的修復(fù)提供種子，引導(dǎo)皮膚的重構(gòu)和汗腺 的形成。本人工皮膚具有可降解性，隨著創(chuàng)面的修復(fù)，貝殼基質(zhì)逐步被降解吸收，可避免清 創(chuàng)過程中給患者所導(dǎo)致的痛苦。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (1)貝殼的準(zhǔn)備取河蛘，去除內(nèi)臟團(tuán)和閉殼肌，40°C烘干，去角質(zhì)層，沿貝殼外周去除5毫米寬度；(2)貝殼基質(zhì)的制備將貝殼浸泡于v/v濃度為的鹽酸和v/v濃度為20%的戊二醛混合溶液中，1 周，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗3次，每次2小時(shí)，75%醫(yī)用酒精浸泡2分鐘，得貝殼基質(zhì)， 置于PBS密封保存?zhèn)溆茫?3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的準(zhǔn)備常規(guī)方法取骨髓1毫升，流式細(xì)胞儀分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，置于含v/v濃度為 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，常規(guī)方法制成細(xì)胞懸液；(4)人工皮膚的制備將步驟(2)所得貝殼基質(zhì)置于含明膠基底的培養(yǎng)皿中，展平，胎牛血清表襯8小 時(shí)，加入細(xì)胞濃度為1X106個(gè)/ml的步驟(3)所得細(xì)胞懸液至淹沒貝殼基質(zhì)為止，培養(yǎng)12 小時(shí)，沿培養(yǎng)皿邊緣吸出培養(yǎng)基，添加20ml完全培養(yǎng)基，每隔3天換液一次，培養(yǎng)至15天為 止，得人工皮膚。實(shí)施例2 (1)貝殼的準(zhǔn)備(如實(shí)施例1)(2)貝殼基質(zhì)的制備將貝殼浸泡于v/v濃度為5%的鹽酸和v/v濃度為10%的戊二醛混合溶液中，1 周，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗3次，每次2小時(shí)，75%醫(yī)用酒精浸泡2分鐘，得貝殼基質(zhì)， 置于PBS密封保存?zhèn)溆茫?3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的準(zhǔn)備(如實(shí)施例1)(4)人工皮膚的制備將步驟(2)所得貝殼基質(zhì)置于含明膠基底的培養(yǎng)皿中，展平，胎牛血清表襯10小 時(shí)，加入細(xì)胞濃度為1X107個(gè)/ml的步驟(3)所得細(xì)胞懸液至淹沒貝殼基質(zhì)為止，培養(yǎng)12 小時(shí)，沿培養(yǎng)皿邊緣吸出培養(yǎng)基，添加20ml完全培養(yǎng)基，每隔3天換液一次，培養(yǎng)至20天為 止，得人工皮膚。實(shí)施例3 (1)貝殼的準(zhǔn)備(如實(shí)施例1)(2)貝殼基質(zhì)的制備將貝殼浸泡于v/v濃度為3 %的鹽酸和v/v濃度為5 %的戊二醛混合溶液中，1周，
5磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗3次，每次2小時(shí)，75%醫(yī)用酒精浸泡2分鐘，得貝殼基質(zhì)，置于 PBS密封保存?zhèn)溆茫?3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的準(zhǔn)備(如實(shí)施例1)(4)人工皮膚的制備將步驟(2)所得貝殼基質(zhì)置于含明膠基底的培養(yǎng)皿中，展平，胎牛血清表襯12小 時(shí)，加入細(xì)胞濃度為1X107個(gè)/ml的步驟(3)所得細(xì)胞懸液至淹沒貝殼基質(zhì)為止，培養(yǎng)12 小時(shí)，沿培養(yǎng)皿邊緣吸出培養(yǎng)基，添加20ml完全培養(yǎng)基，每隔3天換液一次，培養(yǎng)至20天為 止，得人工皮膚。
權(quán)利要求
一種以貝殼基質(zhì)為原料制備人工皮膚的方法，其特征在于，依次通過下列步驟實(shí)現(xiàn)(1)貝殼的準(zhǔn)備取河蚌，去除內(nèi)臟團(tuán)和閉殼肌，40℃烘干，去角質(zhì)層，沿貝殼外周去除5毫米寬度；(2)貝殼基質(zhì)的制備將貝殼浸泡于v/v濃度為1 5％的鹽酸和v/v濃度為5 20％的戊二醛混合溶液中，1周，磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次，每次2小時(shí)，75％醫(yī)用酒精浸泡2分鐘，得貝殼基質(zhì)，置于磷酸鹽緩沖溶液密封保存?zhèn)溆茫?3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的準(zhǔn)備常規(guī)方法取骨髓1毫升，流式細(xì)胞儀分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，置于含v/v濃度為10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，常規(guī)方法制成細(xì)胞懸液；(4)人工皮膚的制備將步驟(2)所得貝殼基質(zhì)置于含明膠基底的培養(yǎng)皿中，展平，胎牛血清表襯8 12小時(shí)，加入細(xì)胞濃度為1×106 1×107/ml的步驟(3)所得細(xì)胞懸液，至淹沒貝殼基質(zhì)為止，培養(yǎng)12小時(shí)，沿培養(yǎng)皿邊緣吸出培養(yǎng)基，添加DMEM培養(yǎng)基至淹沒貝殼基質(zhì)，每隔3天換液一次，培養(yǎng)至15 20天為止，得人工皮膚。
全文摘要
一種以貝殼基質(zhì)為原料制備人工皮膚的方法，將貝殼經(jīng)去角質(zhì)層、鹽酸和戊二醛混合溶液浸泡后得貝殼基質(zhì)、貝殼基質(zhì)于含明膠基底的培養(yǎng)皿中浸泡骨髓細(xì)胞懸液等一系列步驟制得。與報(bào)道的相關(guān)研究相比，具有材料來源豐富價(jià)廉物美的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，具有較低的免疫原性，可以為患者皮膚的修復(fù)提供種子，引導(dǎo)皮膚的重構(gòu)和汗腺的形成。本人工皮膚具有可降解性，隨著創(chuàng)面的修復(fù)，貝殼基質(zhì)逐步被降解吸收，可避免清創(chuàng)過程中給患者所導(dǎo)致的痛苦。
文檔編號(hào)A61L27/60GK101927035SQ201010231979
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者劉彬, 張耀光, 戴麗, 王志堅(jiān), 蒲德永 申請(qǐng)人:西南大學(xué)