專利名稱：山竹總氧雜蒽酮類提取物及其在制備tr3受體誘導(dǎo)劑中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥品和食品領(lǐng)域，特別涉及一種山竹總氧雜蒽酮提取物及其制備方 法以及在制備TR3受體誘導(dǎo)劑中的用途。
背景技術(shù)：
山竹(Garcinia mangostana L.)又稱莽吉柿、羅漢果、倒捻子、鳳果，其幽香氣 爽，滑潤而不膩滯，與榴蓮齊名，號稱“果中皇后”。原產(chǎn)于馬來西亞群島，中國南方大部 分地區(qū)已有引種。其主要成分是以α-倒捻子素、β-倒捻子素和Y-倒捻子素為代表 的氧雜蒽酮類(xanthones)化合物(Journal ofNatural Products，1997，60 :519_524， Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2006，54，301-305)。在東南亞，山竹果皮作為 傳統(tǒng)藥物用于治療皮膚感染、創(chuàng)傷和腹瀉已有多年歷史。山竹的藥用價值已引起各國科學(xué) 家的關(guān)注=Nakatani K等研究表明，莽吉柿果皮中含有的倒捻子素有抑制環(huán)氧化酶活性的 作用(Biochemical pharmacology, 2002,63 (1) :73_79) ；Chanarat P 等發(fā)現(xiàn)山竹中的多糖 能激發(fā)吞噬細胞的吞噬功能(Journal of the Medical Associationof Thailand, 1997, 80(1) 149-154) ；Iinuma M等研究表明山竹中的黃酮衍生物對敏感性金黃色葡萄球菌及 耐藥金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用，為山竹果皮治療感染提供了科學(xué)依據(jù)(Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1996,48 (8) :861_865) ；Chen S-X等研究發(fā)現(xiàn)山竹提取物 具有抗HIV-I蛋白酶的活性(Planta Medica, 1996,62 (4) :381_382)。以上研究結(jié)果顯示 山竹具有廣泛的藥用價值，對其進行深入研究是非常有意義的。TR3(Nur77)是由立早基因NR4A1編碼的核受體。其在細胞漿合成后，進入核內(nèi)作 為轉(zhuǎn)錄因子，通過其中央的DNA結(jié)合域與特定的DNA八聚體序列——Nur77/NGFI-B結(jié)合反 應(yīng)元件相互作用，或與視黃醇受體RXR形成異源二聚體，結(jié)合到DNA應(yīng)答元件上，調(diào)控靶基 因的轉(zhuǎn)錄活性，在細胞生長、分化和凋亡過程發(fā)揮重要作用。TR3家族成員的結(jié)構(gòu)都具有核 受體的典型特征N端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)AF1，高度保守的DNA結(jié)合區(qū)，C端配體結(jié)合區(qū)。許多外 界信號，包括各種生長因子(如神經(jīng)生長因子、表皮生長因子、成纖維生長因子、血清生長 因子)、鈣離子載體、KC1、佛波酯、視黃酸家族、Tax蛋白等都能夠刺激細胞，誘導(dǎo)或抑制TR3 的表達。TR3不但可以介導(dǎo)多種人腫瘤細胞的凋亡，并與多種癌癥相關(guān)。TR3也是肝炎病毒 蛋白作用的靶分子之一，肝炎病毒蛋白對于TR3轉(zhuǎn)錄因子蛋白正常調(diào)節(jié)功能的干擾，與慢 性病毒性肝炎、肝纖維化、肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。另外，TR3亞家族成員在血管 壁高表達可能促進動脈粥樣硬化發(fā)病，Nur77調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活參與巨噬細胞炎癥反應(yīng)何 血管平滑肌細胞增值；可以推測，Nur77位于細胞核內(nèi)可能促進動脈粥樣硬化，位于細胞核 外時轉(zhuǎn)錄激活功能被抑制，可能抑制動脈粥樣硬化病變進展。因此，調(diào)控核受體TR3表達的 化合物，可能在核受體TR3相關(guān)的癌癥、肝炎、動脈粥樣硬化等疾病的預(yù)防和治療中顯示出 廣闊的前景。經(jīng)過專利檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?00610016501. 4的中國專利申請《山竹果皮提取物及其提取方法及其藥物用途》公開了一種山竹果皮提取物及其提取方法，該方法將山竹果 皮粉碎后用30% 95%乙醇提取，回收乙醇可得到用于中藥新藥研究的原料藥；申請?zhí)枮?200710090207. 2的中國專利申請《一種山竹提取物及其制備方法及其應(yīng)用》公開了一種提 取純化的山竹果皮提取物，及其在高血脂癥、冠心病、心絞痛、抗心肌缺血等疾病的作用。上 述發(fā)明都只是通過簡單的乙醇提取及純化得到的山竹提取物，技術(shù)含量低，活性物質(zhì)不明。 本發(fā)明提供了一種山竹中總氧雜蒽酮部位及其制備方法，以及該總氧雜蒽酮部位在制備 TR3受體誘導(dǎo)劑中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足和缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種山竹總氧 雜蒽酮提取物。本發(fā)明的另一目的在于提供上述山竹總氧雜蒽酮提取物的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述山竹總氧雜蒽酮提取物在制備TR3受體誘導(dǎo)劑 中的用途。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種山竹總氧雜蒽酮提取物，其所 述山竹總氧雜蒽酮提取物中含有如下化合物倒捻子醇(mangostanol)、3-異倒捻 -f· M (3-isomangostin) >8-去 _ ■ H ^f (8-desoxygartanin)、■！t ^f (gartanin)、 α -倒捻子素(α -mangostin)、藤黃酮E(garcinone Ε)、9_羥基印度藤黃酮 (9-hydroxycalabaxanthone)禾口 β -倒搶子素(β-mangostin)。所述α -倒捻子素的質(zhì)量百分含量不低于40%。所述的山竹總氧雜蒽酮提取物中，倒捻子醇的質(zhì)量百分含量為0. 24 1. 24%, 3_異倒捻子素的質(zhì)量百分含量為0. 99 2. 01 %，8_去氧藤黃苷的質(zhì)量百分含量為 10. 06 30. 30%，藤黃苷的質(zhì)量百分含量為0. 98 3. 88%，α -倒捻子素的質(zhì)量百分含量 為40. 15 80. 21 %，藤黃酮E的質(zhì)量百分含量為0. 71 1. 57%，9-羥基印度藤黃酮的質(zhì) 量百分含量為0. 75 5. 13%, β-倒捻子素的質(zhì)量百分含量為1.83 8. 09%。上述山竹總氧雜蒽酮提取物的制備方法，包括以下操作步驟將藤黃科植物山竹 (Garcinia mangostana L.)的全果或果皮粉碎，浸入提取溶劑中冷提或在提取溶劑中加熱 回流提取，過濾或離心除去不溶物，再對所得提取溶液進行減壓濃縮，干燥成干浸膏，得到 山竹提取物；將山竹提取物經(jīng)過溶劑萃取分離或大孔吸附樹脂分離，得到山竹總氧雜蒽酮 提取物；所述溶劑萃取分離是將山竹提取物分散于水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇進行等 體積萃取3次，分別真空減壓干燥，乙酸乙酯萃取部位，即為山竹總氧雜蒽酮提取物。所述大孔吸附樹脂分離是將山竹提取物溶于水中，過濾，取濾液經(jīng)大孔樹脂HP-20 開放柱色譜，依次采用水、體積百分比濃度為30%的乙醇-水溶液、體積百分比濃度為50% 的乙醇_水溶液和體積百分比濃度為90%的乙醇-水溶液進行梯度洗脫，體積百分比濃度 為90%的乙醇-水溶液的洗脫部位即為山竹總氧雜蒽酮提取物。所述提取溶劑為水、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一種以上；所述提取的溫度 為20 100°C，提取的時間為1 48小時；所述分離是采用層析分離法和/或萃取法進行 分離。
所述提取的溫度為40 80°C，提取的時間為4 16小時。上述的一種山竹總氧雜蒽酮提取物在制備TR3受體誘導(dǎo)劑中的用途。如上鎖述的山竹總氧雜蒽酮提取物作為TR3受體誘導(dǎo)劑應(yīng)用于制備預(yù)防或治療 癌癥、肝炎或動脈粥樣硬化的食品或藥物。所述山竹總氧雜蒽酮提取物在食品或藥物中的質(zhì)量含量以干品計為0. 1 50%。所述TR3受體誘導(dǎo)劑和藥學(xué)上可接受的載體混合制成散劑、片劑、膠囊劑、丸劑、 栓劑、滴丸劑、腸溶劑、注射劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、酊劑、膏劑或噴霧劑。當(dāng)將山竹總氧雜 蒽酮提取物制備成飲料時，添加濃度一般在0.01%-10% (W/W)范圍較為適宜。當(dāng)山竹總 氧雜蒽酮部位的加入量增大，可能會出現(xiàn)苦澀感覺。其解決方法可以根據(jù)市場需要及消費 者的要求改換劑型，如用片劑、顆粒劑、膠囊劑等?？诜o藥制成片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等常用劑型時，可以選擇淀粉、乳糖、蔗 糖、甘露糖、羥甲基纖維素等作為賦形劑。除賦形劑外，還可以使用月桂醇硫酸鈉、硬脂酸 鎂、滑石粉等作為潤滑劑，糊精、結(jié)晶纖維素、玉米淀粉、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯膠等 作為粘合劑，馬鈴薯淀粉、羥己基纖維素作為崩解劑。此外，還可以制成糖漿劑、乳劑、混懸 劑等。對于這些劑型，可加入矯味劑。外用劑型包括栓劑、軟膏劑、外用散劑、噴霧劑、灌腸劑、乳劑等。這里所使用的固 體或液體添加劑是在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)經(jīng)常使用的。對于軟膏劑，選用由水、脂肪油、羊毛脂、凡 士林、甘油、蜂蠟、石蠟、樹脂、高級醇、表面活性劑組成的疏水性基質(zhì)或親水性基質(zhì)等在內(nèi) 的添加劑。制成注射劑時，一般是用注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、 丙二醇、聚乙二醇等。必要時，可以加入適宜的等張劑、助溶劑、抗氧化劑、防腐劑等。本發(fā)明基于機理TR3可能是篩選抗腫瘤及心腦血管藥物的一個理想的分子靶 點，發(fā)現(xiàn)并發(fā)展具有選擇性調(diào)控TR3表達途徑的化合物或有此先進治療特點的藥物組合具 有現(xiàn)實的意義。本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果本發(fā)明提供了一種具有TR3 受體誘導(dǎo)作用的山竹總氧雜蒽酮部位，該部位可作為TR3受體轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)劑，并可用于制 備預(yù)防或治療癌癥、肝炎或動脈粥樣硬化等疾病的食品或醫(yī)藥品，或?qū)⑸鲜錾街窨傃蹼s蒽 酮部位與其他確有相關(guān)用途的化合物、提取物混合，用于制備預(yù)防或治療癌癥、肝炎或動脈 粥樣硬化等疾病的食品或醫(yī)藥品。


圖1是山竹總氧雜蒽酮部位的HPLC特征圖譜及主要色譜峰的指認(rèn)圖譜，其中a為 山竹總氧雜蒽酮部位的HPLC特征圖譜，b為主要色譜峰的指認(rèn)圖譜。圖2是山竹提取物及部分化合物(1，10 μ Μ)的TR3轉(zhuǎn)錄活性圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細的描述，但本發(fā)明實施方式不 限于此。實施例1 山竹總氧雜蒽酮部位的制備
5
山竹果皮3kg，粉碎后，加入90% (ν/ν)乙醇-水25L加熱回流提取2次，每次2小 時，合并二次的提取液經(jīng)紗布過濾后，經(jīng)IOOOrpm離心5分鐘，取上清液濃縮，冷凍干燥成干 浸膏即得山竹提取物GM(360g)。取山竹提取物290g，溶解于適量水中，過濾，取濾液經(jīng)大孔 樹脂HP-20開放柱色譜，乙醇-水梯度洗脫。分別減壓回收，得水洗脫部分(109.0g)，30% (ν/ν)乙醇-水洗脫部分(69.0g)，50% (ν/ν)乙醇-水洗脫部分(16. Og)，以及90% (ν/ ν)乙醇-水洗脫部分(88. 0g)。其中，90% (ν/ν)乙醇-水洗脫部分即為山竹總氧雜蒽酮 部位GMD。實施例2 山竹總氧雜蒽酮部位HPLC特征圖譜的建立取實施例1中所得的山竹總氧雜蒽酮部位以適量甲醇溶解，制成5. Omg/mL的溶 液，過0. 45 μ m濾膜后，即得山竹總氧雜蒽酮部位的供試品溶液。精密取上述供試品10 μ L，參考國家藥典附錄中規(guī)定的高效液相分析方法，注 入高效液相色譜儀進行色譜分析，記錄色譜圖(圖1)。液相色譜條件為采用十八烷 基硅氧鍵合硅膠為固定相；以含有0. 甲酸的甲醇-水溶液作用流動相，梯度洗脫； 流速為lmL/min;檢測波長為360nm;色譜柱溫度為35°C。獲得的山竹總氧雜蒽酮部位 的HPLC特征圖譜中共有八個色譜峰。將實施例3中分離得到的化合物分別采用相同的 色譜條件分析，記錄色譜圖并與HPLC特征圖譜比對得知，八個色譜峰依次為倒捻子醇 (mangostanol)，3_ 異^ijfe子素(3-isomangostin), 8-(8-desoxygartanin)，· 黃苷(gartanin)，α -倒捻子素(α -mangostin)，藤黃酮 E (garcinone E)，9-羥基印度藤 黃酮(9-hydroxycalabaxanthone), β -倒捻子素(β-mangostin)。它們的保留時間及峰 面積如表1所示表1山竹總氧雜蒽酮部位HPLC圖譜中八個色譜峰的信息
_NO._Name_fe_Area%
1mangostanol11.2670.714
23-isomangostin13.1160.987
3 8-desoxygartanin 16.108 16.105
4 gartanin 19.119 2.753 _5__q-mangostin_19.765_74.152
6garcinone E20.7400.714
79-hydroxycalabaxanthone22.2560.751
8/J-mangostin22.6121.834 Total Area0/。98.01實施例3 山竹總氧雜蒽酮部位HPLC特征圖譜重現(xiàn)性考察取四批購自不同時間(2007-05-05，2008-05-15)，不同產(chǎn)地(廣東，泰國)的山 竹，按照實施例1中的制備方法依次處理，得到四批山竹總氧雜蒽酮部位(⑶2007，TG2007， ⑶2008，TG2008)，按照實施例2中的處理方法和液相條件，分別進行HPLC分析，得到四批山 竹總氧雜蒽酮部位的HPLC特征圖譜，以其中α _倒捻子素的色譜保留時間為1計算得到的 各色譜峰的相對保留時間及各色譜峰對應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)依次為1 號峰0. 57士0. 01 (倒捻子醇)2號峰0. 66 士0. 01 (3_異倒捻子素)3號峰0. 81 士0.01 (8-去氧藤黃苷)
4 號峰0. 97士0.01 (藤黃苷)5號峰1. 00 ( α -倒捻子素)6 號峰1. 05士0.01 (藤黃酮 Ε)7號峰1· 13 士0.01 (9-羥基印度藤黃酮)8 號峰1· 14 士 0.01 (β-倒捻子素)表2四批山竹總氧雜蒽酮部位HPLC圖譜中八個色譜峰的信息 由表2可見，采用峰面積歸一化法，倒捻子醇所對應(yīng)的峰面積占0. 24 1. 24%， 3_異倒捻子素所對應(yīng)的峰面積占0. 99 2. 01 %，8_去氧藤黃苷所對應(yīng)的峰面積占 10. 06 30. 30%，藤黃苷所對應(yīng)的峰面積占0. 98 3. 88%，α -倒捻子素所對應(yīng)的峰面積 占40. 15 80. 21%，藤黃酮E所對應(yīng)的峰面積占0.71 1. 57%，9-羥基印度藤黃酮所對 應(yīng)的峰面積占0. 75 5. 13%，β -倒捻子素所對應(yīng)的峰面積占1. 83 8. 09%。實施例4 山竹總氧雜蒽酮部位HPLC特征圖譜中主要色譜峰的富集和結(jié)構(gòu)鑒定取實施例1中的山竹總氧雜蒽酮部位62. 0g，采用硅膠開放柱色譜，氯仿-甲醇梯 度洗脫，得到8個餾分。餾分Fr. 2 (氯仿-甲醇，98 2v/v洗脫部分，10. Og)，經(jīng)硅膠開放 柱色譜，環(huán)己烷-丙酮(9 lv/v)洗脫后，得到化合物GMD-5 (9. 7g)。餾分Fr. 4 (氯仿-甲 醇，95 5v/v洗脫部分，1. lg)，經(jīng)S印hadexLH-20柱色譜，環(huán)己烷-二氯甲烷(1 1)洗 脫，及硅膠開放柱色譜，氯仿_甲醇洗脫得到化合物GMD-8 (22. 6mg)和GMD-6 (12. 6mg)。餾 分Fr. 5(氯仿-甲醇，95 5v/v洗脫部分，2. 5g)經(jīng)硅膠開放柱色譜，環(huán)己烷-乙酸乙酯 梯度洗脫，得到8個子餾分(Fr. 5-1 Fr. 5-8)。子餾分Fr.5_3(98 2洗脫部分)經(jīng) Sephadex LH-20柱色譜，氯仿-甲醇(3 2)洗脫，得到化合物GMD-7 (9. 6mg)。子餾分 Fr. 5-6 (95 5洗脫部分)在氯仿-甲醇中析出結(jié)晶，過濾得到化合物GMD-3 (25. 2mg)。餾 分Fr. 6(9 1洗脫部分，1.5g)經(jīng)硅膠開放柱色譜，環(huán)己烷-乙酸乙酯(8 2)洗脫得到 化合物 GMD-2 (14. 5mg)和 GMD-4 (10. 4mg)。餾分 Fr. 7 (8 2 洗脫部分，0. 8g)經(jīng) S印hadex LH-20柱色譜，氯仿-甲醇(1 1)洗脫及反復(fù)硅膠柱色譜，氯仿-甲醇洗脫，得到化合物 GMD-I (8. 8mg)。通過理化常數(shù)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段(MS、NMR)，結(jié)合文獻相關(guān)數(shù)據(jù)，鑒定了它們的結(jié)
構(gòu)，如下所示。
7 化合物GMD-I，黃色固體，ESI-MS (positive)給出 m/z 449 [M+Na]+, ESI-MS (negative)給出m/z 425 [Μ-ΗΓ，推出化合物分子量為426。結(jié)合1HNMR和13C匪R數(shù) 據(jù)確定化合物分子式為C24H26O7，計算其不飽和度為12。與文獻(Phytochemistry，1996，43， 1099-1102)報道的數(shù)據(jù)比較，基本一致，故該化合物被鑒定為倒捻子醇(mangostanol) /H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表3，其結(jié)構(gòu)式如下 化合物GMD-2，黃色粉末，ESI-MS (negative)給出m/z 409 [M_H]_，提示分子量為 410。結(jié)合1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)，推測其分子式為C24H26O6，計算不飽和度為12。與文獻(趙 巖，莽吉柿果皮化學(xué)成分及其生物活性研究，吉林大學(xué)博士學(xué)位論文，P 103-106)報道的數(shù) 據(jù)比較，基本一致，故該化合物被鑒定為3-異倒捻子素(3-isomangostin) /H NMR和13CNMR 數(shù)據(jù)見表3，其結(jié)構(gòu)式如下 化合物 GMD-3，黃色粉末，ESI-MS(positive)給出 m/z 403[M+Na]+， ESI-MS (negative)給出m/z 379 [Μ-ΗΓ，推出化合物分子量為380。結(jié)合1HNMR和13C匪R 數(shù)據(jù)確定化合物分子式為C23H24O5,計算其不飽和度為12。與文獻(Phytochemistry， 2003，63，467-470)報道的數(shù)據(jù)比較，基本一致，故該化合物被鑒定為8-去氧藤黃苷 (8-desoxygartanin), 1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表3，其結(jié)構(gòu)式如下
化合物GMD-4，黃色粉末，ESI-MS (positive)給出m/z 419 [M+Na]+，推出化合物分 子量為396。結(jié)合1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)確定化合物分子式為C23H24O6，計算其不飽和度為 12。與文獻(特產(chǎn)研究，2009，1，37-39)報道的數(shù)據(jù)比較，基本一致，故該化合物被鑒定為藤 黃苷(gartanin)，1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表3，其結(jié)構(gòu)式如下 化合物GMD-5，黃色粉末，三氯化鐵顯示呈陽性，提示有酚羥基存在。 ESI-MS (negative)給出 m/z 409 [Μ-ΗΓ，提示分子量為 410。結(jié)合1H NMR 和 13C NMR 數(shù)據(jù)， 推測其分子式為C24H26O6，計算不飽和度為12。與文獻(Food and Chemical Toxicology, 2008,46:688-693)報道的數(shù)據(jù)比較，基本一致，故該化合物被鑒定為α-倒捻子素 (Q^angostin)j1H NMR禾口 13C NMR數(shù)據(jù)見表4，其結(jié)構(gòu)式如下 化合物GMD-6，黃色粉末，ESI-MS (positive)給出m/z 501 [M+Na]+，推出化合物分 子量為478。結(jié)合1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)確定化合物分子式為C29H34O5，計算其不飽和度為 13。與文獻(Chemical and PharmaceuticalBulletin，1993，41，958-960)報道的數(shù)據(jù)比較， 基本一致，故該化合物被鑒定為藤黃酮E(garCinone Ε), 1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表4，其結(jié) 構(gòu)式如下
據(jù)，推測其分子式為C24H24O6，計算不飽和度為13。與文獻(Natural Product Research, 2006，20，1067-1073)報道的數(shù)據(jù)比較，基本一致，故該化合物被鑒定為9-羥基印度藤黃酮 (9-hydroxycalabaxanthone), 1H NMR 和 13C NMR 數(shù)據(jù)見表 4，其結(jié)構(gòu)式如下
化合物GMD-8，棕黃色粉末，UV (CH3OH) nm :314，258，243，204 ；IR(KBr)Vmax3402cm_1 提示結(jié)構(gòu)中有羥基存在，1600CHT1提示結(jié)構(gòu)中有羰基存在。ESI-MS(Positive)給出m/z 447 [M+Na]+，ESI-MS (negative)給出 m/z 423 [Μ-ΗΓ，推出化合物分子量為 424。結(jié)合1H 匪R 和13C NMR數(shù)據(jù)確定化合物分子式為C25H28O6，計算其不飽和度為12。與文獻(靳三林，黃牛 木抗癌活性成分研究，沈陽藥科大學(xué)博士學(xué)位論文，P 77-78)報道的數(shù)據(jù)比較，基本一致， 故該化合物被鑒定為β -倒捻子素(β -mangostin)，1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表4，其結(jié)構(gòu)
式如下 表3 NMR data of GMD-I GMD-4 (400MHz for'H WR) a :Measured in CD3OD, b Measured in CDCl3, c Measured in Acetone_d6·表4 匪R data of GMD-5 GMD-8 (400MHz for'H WR) a :Measured in Acetone_d6, b Measured in CDCl3, c Measured in DMS0_d6·實施例5 實施例1和實施例2中所得的山竹提取物、總氧雜蒽酮部位及部分化合 物對TR3mRNA表達的影響本實施例采用RT-PCR進行分析。NIH-H460肺癌細胞接種于6孔板中 (5X 105cells/well)，貼壁培養(yǎng)過夜，并且饑餓12h后，加藥培養(yǎng)。按總RNA提取試劑盒說明 提取并純化細胞系的總RNA。并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將細胞總RNA的mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。 PCR 條件20μ L 體系中 cDNA 4μ L, 10XPCR buffer, 25mmol/L MgCl2,10mmol/L dNTPs, 每次加 TR3 引物 ΙΟμπιοΙ/L，Taq 酶 1U，反應(yīng)在 PCR 儀中進行。94 °C 4min，94°C 30sec, 56°C 30sec，72°C 30sec，35 個循環(huán)。PCR 引物序列TR3 上游 5 ' -TCA TGGACG GCT ACA CAG-3 ‘，下游 5' -GTA GGC ATG GAA TAG CTC-3' ； β-actin 上游 5' -CTG GAG AAG AGC TAC GAG-3 ‘，下游5' -TGA TGG AGT TGAAGG TAG-3 ‘。實驗結(jié)果顯示山竹提取物可以誘 導(dǎo)TR3mRNA的表達，并且具有一定的量效關(guān)系。圖2是實施例1及實施例3所得山竹提取 物GM、總氧雜蒽酮部位GMD及其中主要的氧雜蒽酮類化合物在不同濃度下對TR3的mRNA表 達的影響。其中，提取物GM，GMD，化合物GM-5、GM-8可不同程度地誘導(dǎo)TR3mRNA的表達，提 示其為TR3的誘導(dǎo)劑。實施例6 本發(fā)明山竹提取物、總氧雜蒽酮部位及部分化合物對腫瘤細胞增殖的 抑制作用本實施例采用MTT法測試山竹提取物、總氧雜蒽酮部位及部分化合物對腫瘤細胞 增殖的抑制作用。選融合度在80%，對數(shù)期生長的細胞，用胰酶消化，轉(zhuǎn)移，離心，去上清 液，用新配制的含10% (v/v)FBS(滅活的小牛胎血清)的DMEM培養(yǎng)液混懸。各種細胞以 1. OX IO4/孔接種于96孔培養(yǎng)板均同時依次加入5個不同稀釋度的待篩樣品藥液，每個稀 釋度重復(fù)3個孔，同時平行做相同濃度的溶劑對照，及不加藥的陰性對照，37°C培養(yǎng)72小 時，MTT染色，DMSO脫色，測定OD57tl,計算腫瘤生長抑制率IR(%)=(空白OD平均值-給 藥組OD平均值)/空白OD平均值X 100。實驗結(jié)果參見表5。結(jié)果顯示，實施例1和實施 例4中的山竹提取物、總氧雜蒽酮部位及其中主要的氧雜蒽酮類化合物對人體的4種腫瘤 細胞非小肺癌細胞H-460 ；乳腺癌細胞MCF-7 ；肝癌細胞H印G2 ；SMMC-7221的增殖具有不 同程度的抑制作用。表5山竹提取物、總氧雜蒽酮部位及主含化合物對腫瘤細胞增殖的抑制活性 實施例7 山竹總氧雜蒽酮部位顆粒劑的制備取實施例1所得山竹總氧雜蒽酮部位IOg與淀粉IOg混合，加水制成軟材，過12 目篩進行造粒，干燥后得到顆粒劑。本顆粒劑中，每200mg中含總氧雜蒽酮lOOmg。實施例8 山竹總氧雜蒽酮部位泡騰片的制備取實施例1所得山竹總氧雜蒽酮部位10g，加硼酸12g，檸檬酸8g，阿斯巴甜(苯丙 氨酸)，淀粉10g，碳酸氫納8g，微晶纖維素12g混合，混合物用單沖壓片機打成直徑6mm，重 量600mg的片。本片劑中每片含山竹總氧雜蒽酮部位lOOmg。實施例9 山竹總氧雜蒽酮部位膠囊劑的制備取實施例1所得山竹總氧雜蒽酮部位IOg與乳糖34g、硬脂酸鎂6g混合，以每 500mg填充膠囊。本膠囊劑中，每個膠囊含山竹總氧雜蒽酮部位lOOmg。實施例10 山竹總氧雜蒽酮部位和若干中藥組合物的制備取實施例1所得的山竹總氧雜蒽酮部位20g與具有調(diào)血脂的中藥生首烏10g、山楂 log、草決明IOg混合，以每500mg填充膠囊。本膠囊劑中，每個膠囊含山竹總氧雜蒽酮部位 200mgo實施例11 山竹總氧雜蒽酮部位和洛伐他汀混合片劑的制備取山竹總氧雜蒽酮部位20g與洛伐他汀2g，加入蔗糖粉40g，糊精10g，滑石粉8g 混合，混合物用單沖壓片機打成直徑6mm，重量400mg的片。本片劑山竹總氧雜蒽酮部位 lOOmg。實施例12 山竹總氧雜蒽酮提取物在食品中的應(yīng)用(1)山竹草莓汁山竹總氧雜蒽酮提取物2g，新鮮草莓2000g，去果蒂、洗凈、濾干 水分待用。用榨汁機將準(zhǔn)備好的山竹和草莓榨成汁，加入適量的濃糖漿拌勻，即得。(2)清熱解毒山竹湯山竹總氧雜蒽酮提取物20克、豬肚500克、金銀花25克、胎 菊10克、崗梅根20克、蜜棗10粒。將金銀花、胎菊、崗梅根洗凈后用紗布袋裝好，同豬肚、 山竹、蜜棗一起入鍋，加水2500毫升，用旺火煮沸后去掉浮沫，再用小火煲煮3小時即成。實施例13 山竹總氧雜蒽酮部位及含有該總氧雜蒽酮部位的組合物的抗大鼠動 脈粥樣硬化的實驗研究(1)試驗動物健康清潔級雄性SD大鼠62只，8 10周齡，體重180 220g。(2)飼料機制顆粒飼料，基礎(chǔ)飼料配方面粉20% (質(zhì)量百分含量，下同)、米粉 2 %、玉米20 %、麩皮25 %、豆料20 %、骨粉2 %、魚粉2 % ；高脂飼料配方4 %膽固醇、10 % 豬油、0. 2%甲基硫氧嘧啶、86%基礎(chǔ)飼料。(3)儀器與試劑日本日立7060型全自動生化分析儀；德國里奧LE0-1430VP掃描電鏡，膽固醇(上海山浦化工有限公司，化學(xué)純)；甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑 盒、高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒均購自南京建成生 物制品研究所。(4)藥物實施例7中的山竹總氧雜蒽酮部位顆粒劑和實施例11中山竹總氧雜蒽 酮部位和洛伐他汀混合片。(5)實驗方法動物分組與給藥實驗從74只SD大鼠中隨機取12只大鼠，飼喂基礎(chǔ)飼料，作為正 常對照組(A)。其余62只飼喂高脂飼料1個月后，隨機抽樣檢測2只大鼠主動脈，以發(fā)現(xiàn)動 脈粥樣硬化斑塊為造模成功，將其余60只飼喂高脂飼料大鼠隨機分為5組，每組12只，即 高脂模型組(B)、總氧雜蒽酮部位顆粒劑低劑量組，0. 5g/kg(C)、總氧雜蒽酮部位顆粒劑高 劑量組，2g/kg (D)、總氧雜蒽酮部位和洛伐他汀混合片低劑量組，0. 5g/kg(E)、總氧雜蒽酮 部位和洛伐他汀混合片高劑量組，2g/kg (F)。用藥組灌胃相應(yīng)劑量的藥物，同時模型組與正 常對照組均灌胃等量蒸餾水。灌胃量為每只大鼠0. 5ml/d，共8周。觀察指標(biāo)大鼠注射2%戊巴比妥納45mg/kg腹腔麻醉，切開頸部分離頸動脈，插 管取血2. 5mL，分離血清，按各檢測試劑盒的操作方法，測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、 高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。主動脈組織學(xué)觀察打開胸腔分離主動脈，剝?nèi)ネ饽ぶ荆瑥闹鲃用}弓處剪 5mmX 8mm大小1塊，用PBS緩沖液洗凈表面后，立即投入2. 5%戊二醛固定液中，接著用PBS 緩沖液漂洗后，用鋨酸固定，再用PBS緩沖液充分漂洗，然后分別用50%、70%、90%、 100% (V/V)乙醇逐級脫水共4次，用乙酸異戊酯置換乙醇后，將樣品移入臨界點干燥儀用 液態(tài)CO2干燥，樣品干燥后在離子濺射儀中鍍膜，最后掃描電鏡觀察。統(tǒng)計學(xué)分析實驗結(jié)果采用(χ士s)表示，SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進行方差分析。(6)實驗結(jié)果實驗第8周末，高脂飼料組(B組)血清TC、TG、LDL-C水平比正常對照組(A組) 明顯升高，各含有總氧雜蒽酮部位的用藥組與高脂飼料組(B組)比較，均能使血清TC、TG、 LDL-C含量降低，高劑量組有比較明顯的改善作用，且作用優(yōu)于低劑量組，在降低TC、TG、 LDL-C的同時，升高HDL-C，表明有明顯的調(diào)血脂的作用(P < 0.01)，結(jié)果見表6。表6治療后各組大鼠血脂比較(mmol/L，X士 s) 注與A組比較，*P < 0.01，與B組比較，ΔΡ < 0.01
各組大鼠掃描電鏡結(jié)果比較，正常組見主動脈血管結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)皮細胞完整無脫 落，細胞間連接緊密，表面無沉積物。模型組見主動脈內(nèi)膜表面多處不光滑，病變顯著，呈多 樣化，細胞排列變得不規(guī)則，方向性改變，內(nèi)皮細胞間連接遭破壞，表面有大量沉積物，部分 區(qū)域內(nèi)皮細胞出現(xiàn)脫落。加山竹提取物高劑量組(D，F(xiàn)組)見主動脈內(nèi)膜呈修復(fù)狀態(tài)，表面 較光滑，內(nèi)皮細胞排列整齊，有方向性，內(nèi)皮細胞隆起明顯，連接尚緊密，表面可見少量黏附 的小顆粒，但無大量沉積物。低劑量組(C，E組)見主動脈內(nèi)膜表面不光滑，內(nèi)皮細胞的縱 嵴呈不規(guī)則性排列，無方向性，內(nèi)皮細胞呈隆起、增生、脫落，細胞間連接較疏松，表面有沉 積物。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種山竹總氧雜蒽酮提取物，其特征在于所述山竹總氧雜蒽酮提取物中含有如下化合物倒捻子醇、3 異倒捻子素、8 去氧藤黃苷、藤黃苷、α 倒捻子素、藤黃酮E、9 羥基印度藤黃酮和β 倒捻子素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹總氧雜蒽酮提取物，其特征在于所述α-倒捻子 素的質(zhì)量百分含量不低于40%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹總氧雜蒽酮提取物，其特征在于所述的山竹總氧 雜蒽酮提取物中，倒捻子醇的質(zhì)量百分含量為0. 24 1. 24%，3-異倒捻子素的質(zhì)量百分含 量為0. 99 2. 01%，8-去氧藤黃苷的質(zhì)量百分含量為10. 06 30. 30%，藤黃苷的質(zhì)量百 分含量為0. 98 3. 88%，α -倒捻子素的質(zhì)量百分含量為40. 15 80. 21 %，藤黃酮E的質(zhì) 量百分含量為0.71 1. 57%，9_羥基印度藤黃酮的質(zhì)量百分含量為0. 75 5. 13%，β-倒 捻子素的質(zhì)量百分含量為1.83 8. 09%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹總氧雜蒽酮提取物的制備方法，其特征在于包括以 下操作步驟將藤黃科植物山竹的全果或果皮粉碎，浸入提取溶劑中冷提或在提取溶劑中 加熱回流提取，過濾或離心除去不溶物，再對所得提取溶液進行減壓濃縮，干燥成干浸膏， 得到山竹提取物；將山竹提取物經(jīng)過溶劑萃取分離或大孔吸附樹脂分離，得到山竹總氧雜 蒽酮提取物；所述溶劑萃取分離是將山竹提取物分散于水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇進行等體積 萃取3次，分別真空減壓干燥，乙酸乙酯萃取部位，即為山竹總氧雜蒽酮提取物；所述大孔吸附樹脂分離是將山竹提取物溶于水中，過濾，取濾液經(jīng)大孔樹脂ΗΡ-20開 放柱色譜，依次采用水、體積百分比濃度為30 %的乙醇-水溶液、體積百分比濃度為50 %的 乙醇_水溶液和體積百分比濃度為90%的乙醇-水溶液進行梯度洗脫，體積百分比濃度為 90%的乙醇-水溶液的洗脫部位即為山竹總氧雜蒽酮提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述提取溶劑為水、甲醇、乙醇、丙酮 和乙酸乙酯中的一種以上；所述提取的溫度為20 100°C，提取的時間為1 48小時；所 述分離是采用層析分離法和/或萃取法進行分離。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述提取的溫度為40 80°C，提取 的時間為4 16小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹總氧雜蒽酮提取物在制備TR3受體誘導(dǎo)劑中的用途。
8.如權(quán)利要求1所述的山竹總氧雜蒽酮提取物作為TR3受體誘導(dǎo)劑應(yīng)用于制備預(yù)防或 治療癌癥、肝炎或動脈粥樣硬化的食品或藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述山竹總氧雜蒽酮提取物在食品或藥 物中的質(zhì)量含量以干品計為0. 1 50%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述TR3受體誘導(dǎo)劑和藥學(xué)上可接受的 載體混合制成散劑、片劑、膠囊劑、丸劑、栓劑、滴丸劑、腸溶劑、注射劑、糖漿劑、乳劑、混懸 劑、酊劑、膏劑或噴霧劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種山竹總氧雜蒽酮提取物及其制備方法以及作為制備TR3受體誘導(dǎo)劑的用途，屬于醫(yī)藥品和食品領(lǐng)域。所述山竹總氧雜蒽酮提取物作為TR3受體誘導(dǎo)劑應(yīng)用于制備預(yù)防或治療癌癥、肝炎或動脈粥樣硬化的食品或藥物。所述TR3受體誘導(dǎo)劑和藥學(xué)上可接受的載體混合制成散劑、片劑、膠囊劑、丸劑、栓劑、滴丸劑、腸溶劑、注射劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、酊劑、膏劑或噴霧劑。本發(fā)明基于機理TR3可能是篩選抗腫瘤及心腦血管藥物的一個理想的分子靶點，發(fā)現(xiàn)并發(fā)展具有選擇性調(diào)控TR3表達途徑的化合物或有此先進治療特點的藥物組合具有現(xiàn)實的意義。
文檔編號A61K36/185GK101904880SQ201010232110
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者姚新生, 張曉坤, 戴毅, 段營輝, 王光輝, 陳海峰 申請人:暨南大學(xué)