專利名稱：一組下調(diào)Mortalin/HSPA9/Grp75表達(dá)的siRNA分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一組SiRNA分子，具體的說，是關(guān)于一組能有效下調(diào)Mortalin/HSPA9/Grp75表達(dá)的siRNA分子及其在抑制卵巢癌細(xì)胞增殖方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卵巢癌(Ovarian Carcinoma)是目前死亡率最高的婦科惡性腫瘤，治療原則主要是以手術(shù)為主，輔以化療的綜合治療。以鉬類為主的聯(lián)合化療提高了卵巢癌患者的總體反應(yīng)率、臨床緩解率和中位生存率。然而隨之而來的腫瘤細(xì)胞原發(fā)或獲得性多藥耐藥 (Multidrug Resistance, MDR)現(xiàn)象成為臨床治療的障礙，是大多數(shù)卵巢癌患者化療失敗、 預(yù)后不良的主要原因之一。多藥耐藥問題不僅僅是卵巢癌，也是所有腫瘤臨床化學(xué)藥物治療的一大瓶頸，不僅導(dǎo)致化療藥物治療的最終失敗，而且耐藥腫瘤細(xì)胞往往侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，縮短患者的生存期。因而尋找可行的、能對(duì)其進(jìn)行干預(yù)的靶分子，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥和阻止侵襲轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生，以達(dá)到不斷提高療效的目的，無(wú)疑具有重要理論意義和臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。已有的研究發(fā)現(xiàn)，某些分子伴侶，特別是應(yīng)激蛋白和熱休克蛋白(Hsp27、Hsp90和 Hsp70等)在許多腫瘤中呈上調(diào)表達(dá)，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥。由于分子伴侶異常表達(dá)與腫瘤耐藥的直接相關(guān)性，抑制分子伴侶將為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥開創(chuàng)新的思路。分子伴侶(molecular chaperone)是一類與其他蛋白的不穩(wěn)定構(gòu)象相結(jié)合并使之穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，通過控制結(jié)合和釋放來幫助被結(jié)合多肽在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)或降解等。分子伴侶由一些進(jìn)化上非常保守的蛋白質(zhì)家族組成，廣泛分布于各種生物體內(nèi)。Mortalin/HSPA9/Grp75基因是Hsp70分子伴侶家族成員之一，首先在小鼠的成纖維細(xì)胞中被克隆出來。最初的研究發(fā)現(xiàn)其前體帶有一段線粒體蛋白的信號(hào)肽，被認(rèn)為是一類線粒體蛋白，因而早期的研究主要圍繞在其對(duì)線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程中所發(fā)揮的作用，以及它在線粒體內(nèi)的分子伴侶功能展開。隨后的研究發(fā)現(xiàn)Mortalin/HSPA9/Grp75廣泛分布于多個(gè)細(xì)胞器和胞漿，具有多個(gè)結(jié)合配體(DJ-1、ILR-la、VDAC、HSP60等)，與細(xì)胞增殖和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控有關(guān)。迄今為止，針對(duì)于M0rtalin/HSPA9/Grp75的研究發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)功能主要包括分子伴侶功能、抗凋亡的細(xì)胞保護(hù)功能和穩(wěn)定細(xì)胞骨架等。已有的研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤組織(如結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌)和幾乎所有的腫瘤起源的體外細(xì)胞系Mortalin/HSPA9/Grp75均呈上調(diào)表達(dá)。而且過表達(dá) MortalinHSPA9/Grp75可以增加乳腺癌細(xì)胞的惡性程度，從而提出Mortalin/HSPA9/Grp75 有可能成為腫瘤治療的一個(gè)候選基因。與腫瘤相關(guān)性的研究還發(fā)現(xiàn)，Mortalin/HSPA9/ Grp75具有兩個(gè)特點(diǎn)①M(fèi)ortalin/HSPA9/Grp75的mRNA和蛋白表達(dá)水平在永生化和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平增加；②Mortalin/HSPA9/Grp75在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的分布不同正常細(xì)胞中Mortalin/HSPA9/Grp75分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)(pancytoplasmic)；在腫瘤細(xì)胞中主要分布于核周(perinuclear)。詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。抑癌基因P53 (凋亡調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子之一)的突變或缺失在多種腫瘤的形成和發(fā)展過程中起到了重要的作用，包括卵巢癌。而且與其他婦科惡性腫瘤如宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌相比，P53基因在卵巢癌中的突變頻率最高。P53基因與卵巢癌的耐藥也密切相關(guān)。順鉬能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞經(jīng)P53依賴的途徑發(fā)生凋亡從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，p53的調(diào)控失衡將導(dǎo)致凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失常，出現(xiàn)對(duì)順鉬的耐藥。Kaul SC 等的研究發(fā)現(xiàn) Mortal in/HSPA9/Grp75 可以通過其 N-terminal 氨基酸殘基253-282與p53直接結(jié)合J Zuo等的研究則發(fā)現(xiàn)Mortalin/HSPA9/Grp75可以抑制P53的線粒體易位和核轉(zhuǎn)位，從而抑制其抗凋亡轉(zhuǎn)錄活性。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng) p53-Mortalin/HSPA9/Grp75復(fù)合物的相互作用被過表達(dá)截短的p53打斷后，p53活化后入核，從而引起人骨肉瘤和乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)遲滯。提示Mortalin/HSPA9/Grp75對(duì)p53活性的抑制可能在腫瘤的發(fā)生與耐藥過程中起到了一定的作用。由于細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及化療耐藥過程中發(fā)揮了重要的作用； 且多種分子伴侶(Hsp27，Hsp70和Hsp90等)在腫瘤發(fā)生和耐藥過程中的作用與其抗凋亡的特性有關(guān)。基于分子伴侶進(jìn)化上的保守性，推測(cè)Mortalin/HSPA9/Grp75的上調(diào)表達(dá)在腫瘤發(fā)生和耐藥中所發(fā)揮的作用，可能與其抗凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)。Mortalin/HSPA9/ Grp75可能通過其分子伴侶功能和p53結(jié)合，抑制p53凋亡誘導(dǎo)功能的發(fā)揮；抑或通過對(duì) PI3K/Akt, Raf/Mek/Eek等通路的激活發(fā)揮其凋亡抑制功能。而下調(diào)Mortalin/HSPA9/ Grp75將導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力的喪失、衰老和細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)Northern Blot檢測(cè)的卵巢癌標(biāo)本中約30% Mortalin/HSPA9/Grp75 表達(dá)量明顯增高。且Mortalin/HSPA9/Grp75在人耐藥卵巢癌細(xì)胞株A2780/cis中的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯高于人卵巢癌細(xì)胞株A2780。提示Mortal in/HSPA9/Grp75上調(diào)表達(dá)可能與卵巢癌耐藥具有一定的相關(guān)性。 RNA干擾(RNA interference, RNAi )是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post - transcriptional gene silencing，PTGS)，它是生物體抵御病毒感染及防止重復(fù)序列和突變引起基因組不穩(wěn)定性的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。 當(dāng)病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)， 并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對(duì)這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中RNaseIII核酶家族的Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA (大約21 23 bp),即小干擾RNA(siRNA)。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與胞內(nèi)的一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC具有核酸酶的功能，能與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，在結(jié)合部位切割mRNA， 切割位點(diǎn)是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA依賴的RNA聚合酶(RNA_cbpendent RNA polymerase, RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。2002年，Brmnmelkamp等首次使用小鼠Hl啟動(dòng)子構(gòu)建了小發(fā)卡RNA (small hairpin RNA, shRNA)表達(dá)載體pSUPER，并證實(shí)轉(zhuǎn)染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)，為利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。RNAi技術(shù)目前主要應(yīng)用于基因功能的研究，病毒感染性疾病以及腫瘤的基因治療。在腫瘤的治療中，通過使用針對(duì)某些抗凋亡分子如survivin或與耐藥相關(guān)分子如MDRl 的siRNA或shRNA，可以特異性殺傷腫瘤細(xì)胞或提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。盡管前期的研究表明Mortalin/HSPA9/Grp75上調(diào)表達(dá)可能與卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感有關(guān)，但是目前尚未有關(guān)于其小干擾RNA序列用于增加耐藥卵巢癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一組能有效下調(diào)Mortalin/HSPA9/Grp75表達(dá)的siRNA分子， 通過RNAi技術(shù)下調(diào)Mortalin/ HSPA9/Grp75表達(dá)后，耐藥卵巢癌細(xì)胞是否對(duì)藥物的敏感性增加，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥以及卵巢癌分子靶向治療提供依據(jù)。已有的研究表明Mortalin/HSPA9/Grp75上調(diào)表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感有關(guān)。而通過干擾Mortalin/HSPA9/Grp75的表達(dá)逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的研究尚未見報(bào)道。 因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列干擾序列，用于篩選具有明顯干擾活性并且能夠逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的序列。首先，必須把表達(dá)干擾序列的載體轉(zhuǎn)染到人耐藥的卵巢癌細(xì)胞A2780/cis中，然后才能判斷每一條干擾序列的干擾活性。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以通過多種方法獲得，例如磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔以及病毒方法。其中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較高，且通過抗性藥物 G418的篩選可以獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株，為此我們比較后選擇了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，并通過無(wú)限稀釋法挑取了單克隆。免疫印記檢測(cè)結(jié)果顯示設(shè)計(jì)的三條干擾序列均有明顯的干擾活性。本發(fā)明提供了一組下調(diào)Mortalin/HSPA9/Grp75表達(dá)的siRNA分子，所述的siRNA 分子靶點(diǎn)位于Mortalin/HSPA9/Grp75 mRNA的編碼區(qū)。Mortalin/HSPA9/Grp75基因是Hsp70分子伴侶家族成員之一，首先在小鼠的成纖維細(xì)胞中被克隆出來。針對(duì)于Mortalin/HSPA9/Grp75的研究發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)功能主要包括分子伴侶功能、抗凋亡的細(xì)胞保護(hù)功能和穩(wěn)定細(xì)胞骨架等。其序列可參見http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/。所述的siRNA分子靶點(diǎn)選擇位點(diǎn)的序列如SEQ ID NO 11_13中任意一條序列所示。所述的siRNA分子靶點(diǎn)選擇位點(diǎn)可以為第129-147 bp的堿基序列 GCGGGATTATGCATCAGAAC SEQ ID NO 11)、第 463-481 bp 的堿基序列GAGGCTCATGGGAAATTGT (SEQ ID NO 12)或者第 685-703 bp 的堿基序列GCCTATGGTCTAGACAAATCSEQ ID NO 13)。例如，所述的siRNA分子的序列如SEQ ID NO 5_10中任意一條序列所示。其中， SEQ ID NO 5 與 SEQ ID NO 6 為一對(duì)，稱為 Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNAl ；SEQ ID N07 與 SEQ ID NO 8 為一對(duì)，稱為 Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2 ；SEQ ID NO 9 與 SEQ ID NO 10 為一對(duì)，稱為 Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA3。本發(fā)明還提供了含有上述的siRNA分子的載體。可以采用市售的常規(guī)載體，較好的采用減毒或者改造的病毒載體，例如，商品化的慢病毒載體等。上述的SiRNA分子可以應(yīng)用于增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。MTT檢測(cè)表明，用上述的siRNA分子下調(diào)Mortalin/ HSPA9/Grp75的表達(dá)后，耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780/cis對(duì)化療藥物順鉬的敏感性明顯增加。相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)藥物敏感性的方法，即在對(duì)卵巢癌細(xì)胞加藥之前、同時(shí)或者之后，加入上述siRNA分子或者其載體。所述“之前”包括在加藥之前若干小時(shí)至幾天，例如1小時(shí)到48小時(shí)、72小時(shí)甚至96小時(shí)。所述“之后”包括在加藥之后若干小時(shí)至幾天，例如1小時(shí)到48小時(shí)、72小時(shí)甚至96小時(shí)。還包括對(duì)卵巢癌細(xì)胞加入上述siRNA分子，待其在上述卵巢癌細(xì)胞中穩(wěn)定存在后再加藥。上述siRNA分子可以用于降低卵巢癌細(xì)胞侵襲性。體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示， 用上述的siRNA分子下調(diào)Mortalin/ HSPA9/Grp75的表達(dá)后，耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780/cis 的侵襲性降低。克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果則表明，用上述的siRNA分子下調(diào)Mortalin/ HSPA9/ Grp75的表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的克隆形成能力降低。本發(fā)明的siRNA分子和化療藥物可以組成藥物組合物，應(yīng)用于抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的方法，即在卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)物中加入該藥物組合物。所述的化療藥物可以是各種目前常用的化療藥物，包括影響DNA結(jié)構(gòu)與功能的、 干擾轉(zhuǎn)錄和阻止RNA合成的以及抑制蛋白質(zhì)合成與功能的抗腫瘤藥物。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施中采用的化療藥物是順鉬。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于通過使用本發(fā)明的SiRNA分子，可以有效下調(diào)耐藥卵巢癌細(xì)胞中Mortalin/HSPA9/Grp75基因表達(dá)。Mortalin/ HSPA9/Grp75表達(dá)下調(diào)后，耐藥卵巢癌細(xì)胞侵襲性降低，對(duì)化療藥物順鉬的敏感性增加。一系列的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了 Mortalin/ HSPA9/Grp75表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞耐藥相關(guān)，下調(diào)Mortalin/HSPA9/Grp75可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥，Mortalin/HSPA9/Grp75可作為淋巴瘤治療的新靶點(diǎn)，通過RNA干擾進(jìn)行分子靶向治療。同時(shí)也說明我們?cè)O(shè)計(jì)的三條序列干擾效果明顯。使用本發(fā)明可以克服卵巢癌對(duì)順鉬的耐藥，提高卵巢癌的治療效果和預(yù)后，使用方便且易被患者接受。


圖1 人耐藥卵巢癌細(xì)胞株A2780/cis中Mortalin/HSPA9/Grp75的mRNA表達(dá)水平明顯高于人卵巢癌細(xì)胞株A2780的復(fù)制曲線部分(amplication curves).其中，橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)是熒光值(fluorescence )。圖2 人耐藥卵巢癌細(xì)胞株A2780/cis中Mortalin/HSPA9/Grp75的mRNA表達(dá)水平明顯高于人卵巢癌細(xì)胞株A2780的熔解曲線部分(melting curves).其中，橫坐標(biāo)是溫度， 縱坐標(biāo)是熒光值(fluorescence)。與圖 1 結(jié)合，A2780/cis 與 A2780 中 Mortalin/HSPA9/ Grp75的mRNA表達(dá)水平的相對(duì)差異2 ("ΔΔεΟ=20. 11。圖3 人耐藥卵巢癌細(xì)胞株A2780/cis中Mortalin/HSPA9/Grp75的蛋白表達(dá)水平明顯高于人卵巢癌細(xì)胞株A2780。圖4 :Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNAl測(cè)序圖譜表明載體構(gòu)建成功。
圖5 :Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2測(cè)序圖譜表明載體構(gòu)建成功。圖6 :Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA3測(cè)序圖譜表明載體構(gòu)建成功。圖7 免疫印跡結(jié)果鑒定Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA的干擾活性，顯示挑取的三個(gè)克隆均有明顯干擾活性，其中Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2的干擾活性最強(qiáng)。圖8 =MTT結(jié)果顯示在人耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780/cis中，Mortalin/HSPA9/Grp75下調(diào)后腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉬敏感性增加。圖9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯示在人耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780/cis中，Mortalin/ HSPA9/Grp75下調(diào)表達(dá)后腫瘤細(xì)胞侵襲性降低。圖10 圖9相應(yīng)的細(xì)胞顯微鏡下圖。圖11 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，顯示在人耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780/cis中， Mortalin/HSPA9/Grp75下調(diào)表達(dá)后腫瘤細(xì)胞克隆形成能力明顯降低。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)來比較差異。/7 < 0. 05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有數(shù)據(jù)采用SpssV13. 0軟件分析。
(一)細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)
人耐藥卵巢癌細(xì)胞株A2780/cis，人卵巢癌細(xì)胞株A2780均購(gòu)自ECACC公司。所有細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5%C02-95%空氣，飽和濕度以及37° C的條件下培養(yǎng)。(二)試劑
RNA抽提試劑Trizol購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 Fermentas 公司，pSlencer 4. 1- Hl neo Vector 購(gòu)自 Ambion 公司，高保真 DNA 聚合酶購(gòu)自 TAKARA 公司，抗-GAPDH，抗 _ Mortalin/HSPA9/Grp75，抗 _Hsp70，抗 _Hsp72 單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Sybr Green購(gòu)自 Τ0Υ0Β0公司，MTT粉劑購(gòu)自Amresco公司。(三)RNA的抽提及逆轉(zhuǎn)錄PCR
收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0. OlM PBS洗滌2次，加入Iml Trizol冰上裂解細(xì)胞20 min。加入200ul氯仿，漩渦振蕩器混勻(1 min)，靜止10 min，4°C離心(12000 g，15 min)。待液體分為三層，取上層水相至1. 5mlEP管內(nèi)，加入200ul異丙醇，振蕩混勻，室溫靜止10 min，離心12000 g，10 min，棄上清。加入Iml 75%的乙醇，振蕩混勻1 min，離心12000 g，10 min, 棄上清，超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干，根據(jù)RNA沉淀的量加入DEPC水溶解。根據(jù)!^rmentas公司K1622逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取 Iul olig (dT)、模版RNA llul，冰上混勻，70°C 5 min，立即置冰上1 min。輕微離心后加入下列試劑5 X反應(yīng)buffer 4ul、RNA酶抑制劑Iul、IOMm dNTP混合物2ul，輕輕混勻。37°C 5 min后加入逆轉(zhuǎn)錄酶Iul，42°C lh, 70°C IOmin終止反應(yīng)，獲得cDNA進(jìn)行real-time PCR。real-time PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)的引物
18S rRNA (內(nèi)參照)5，-ATCCCTGAAAAGTTCCAGCA-3，(SEQ ID NO 1) 5’-CCCTCTTGGTGAGGTCAATG-3’ (SEQ ID NO 2)
Mortalin/HSPA9/Grp75 5， -ATGGCACTTCAGAGGGTA-3， (SEQ ID NO 3)
5， -GCACGGGTCAACTTCATA-3， (SEQ ID NO 4) real-time PCR反應(yīng)體系如下
SYBRGreenSupermix12. 5μ 1cDNA1μ 1引物10. 5μ 1引物20. 5μ 1滅菌d3H2010. 5μ 權(quán)利要求
1.一組下調(diào)Mortalin/HSPA9/Grp75表達(dá)的siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子靶點(diǎn)位于Mortalin/HSPA9/Grp75 mRNA的編碼區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子靶點(diǎn)選擇位點(diǎn)的序列如SEQ ID NO 11-13中任意一條序列所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子的序列如SEQID NO 5-10中任意一條序列所示。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的siRNA分子。
5.一種增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)藥物敏感性的方法，其特征在于，在對(duì)卵巢癌細(xì)胞加藥之前、 同時(shí)或者之后，加入權(quán)利要求1所述的siRNA分子或者含有權(quán)利要求1所述的siRNA分子的載體。
6.權(quán)利要求1所述的siRNA分子的應(yīng)用，其特征在于，將其應(yīng)用于增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性或者降低卵巢癌細(xì)胞的侵襲率。
7.一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物由權(quán)利要求1所述的siRNA分子和化療藥物組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述的化療藥物是順鉬。
9.權(quán)利要求7所述的藥物組合物的應(yīng)用，其特征在于，將該藥物組合物應(yīng)用于抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。
10.一種抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的方法，其特征在于，在卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)物中加入權(quán)利要求7所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組能有效下調(diào)Mortalin/HSPA9/Grp75表達(dá)的siRNA分子，所述的siRNA分子的靶點(diǎn)位于Mortalin/HSPA9/Grp75mRNA的編碼區(qū)。所述的siRNA分子能夠有效下調(diào)Mortalin/HSPA9/Grp75的表達(dá)。通過該siRNA分子下調(diào)Mortalin/HSPA9/Grp75表達(dá)后，耐藥卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增加，侵襲性降低。該siRNA分子可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌的耐藥，降低卵巢癌細(xì)胞的侵襲性，提高卵巢癌的治療效果。本發(fā)明還提供了含有上述siRNA分子的載體、應(yīng)用以及其與化療藥物的組合物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102399778SQ20101027970
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者劉曉宇, 劉雯, 左伋, 李洪巖, 楊玲 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)