專(zhuān)利名稱：一種靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡及其制備方法，用作超聲造影劑與 整合素α νβ 3受體結(jié)合超聲顯像來(lái)評(píng)估早期肝纖維化。
背景技術(shù)：
迄今，肝活檢仍是評(píng)估肝纖維化的唯一 “金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，肝活檢是有創(chuàng)的， 可引起致命的并發(fā)癥，因此不能被患者普遍接受，這造成了很大一部分慢性肝病患者在 診斷和治療上的延誤；同時(shí)，在無(wú)明顯癥狀的患者中，很難重復(fù)進(jìn)行肝活檢，這就無(wú)法 準(zhǔn)確地隨訪慢性肝病患者病情的變化；此外，樣本取樣誤差和病理觀察的不一致性都影 響了肝活檢的準(zhǔn)確性。因此，需要一種精確的無(wú)創(chuàng)傷性的方法來(lái)診斷和評(píng)估肝纖維化。 目前，肝纖維化無(wú)創(chuàng)傷性的評(píng)估方法有1纖維化血清標(biāo)記物。器官特異性差，易受炎 癥和機(jī)體代謝的干擾，標(biāo)準(zhǔn)化困難，組合指標(biāo)更多反映炎癥，對(duì)纖維化分期較困難；2 生化指標(biāo)。需多項(xiàng)組合(如Fibrotest)。由于肝臟極強(qiáng)的儲(chǔ)備功能，只在嚴(yán)重肝纖維化 時(shí)改變明顯，并且生化指標(biāo)影響因素多，解釋困難，不同病因、不同時(shí)期的肝纖維化評(píng) 估的準(zhǔn)確性不同；3常規(guī)影像。目前常規(guī)B超、CT、MRI難于反映肝纖維化早期改變， 評(píng)估多限于肝硬化及并發(fā)癥；4發(fā)展中的影像技術(shù)。近年推出超聲檢測(cè)低頻彈性波的瞬 時(shí)彈性記錄儀(Fibroscan)和運(yùn)用MRI彌散加權(quán)成像(DWI)、31磷波譜成像(31MRS)及 彈性成像變化等新技術(shù)，通過(guò)測(cè)量肝組織硬度和彈性來(lái)評(píng)估肝臟纖維化程度，優(yōu)于其他 的無(wú)創(chuàng)的方法，具有一定的應(yīng)用前景。然而，近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)也存在一定的局限性，如 腹壁脂肪的含量在很大程度上影響Fibroscan等對(duì)肝纖維化的檢測(cè)準(zhǔn)確性，并且這些方法 在對(duì)早期肝纖維化的診斷上也存在困難。綜上所述，目前診斷和評(píng)估肝纖維化的方法都未能較好反映慢性肝損傷修復(fù)過(guò) 程中活化細(xì)胞表型和數(shù)量變化等分子病理改變，并在可靠性、敏感性、可操作性等方面 存在不一致性，尚難達(dá)到臨床對(duì)肝纖維化早期診斷和治療效果實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)評(píng)估的要求。不 能對(duì)肝纖維化做出正確評(píng)估一直以來(lái)是制約基礎(chǔ)研究走向臨床的“瓶頸”，也是不能開(kāi) 發(fā)抗纖維化藥物與臨床試驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能提高超聲顯影的靈敏度的脂質(zhì)體微泡及其制備方 法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡，包括帶有 鏈酶親和素的脂質(zhì)體微泡，其特征在于，所述脂質(zhì)體微泡通過(guò)鏈酶親和素與生物素的親 和作用連接生物素-聚乙二醇-可與肝纖維化或肝硬化中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的受體 相結(jié)合的靶向環(huán)肽。脂質(zhì)體微泡中包裹氮?dú)夂腿嫉幕旌衔铮鸬匠曪@影作用。所述的肝纖維化或肝硬化中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的受體為至少一種在病理 狀態(tài)下上調(diào)的受體，如整合素α νβ 3受體。
所述的靶向環(huán)肽為環(huán)(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-賴氨酸)，即 C(RGDyK)，其可以特異性結(jié)合肝星狀細(xì)胞，從而達(dá)到特異性肝纖維化診斷并提高診斷 靈敏度的目的。環(huán)肽中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是新生血管內(nèi)皮細(xì)胞 多種整合素受體結(jié)合位點(diǎn)。其中，y代表右旋酪氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基且不影響 與靶向受體結(jié)合。本發(fā)明還提供了上述靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡的制備方法，其特征在于，具 體步驟為
第一步將摩爾比為1.1 1.3: 1的靶向環(huán)肽與生物素-聚乙二醇-N-羥基琥珀 酰亞胺酯共同溶解于pH=8的磷酸鹽緩沖液中，室溫?cái)嚢?-5小時(shí)，過(guò)濾，得到靶向環(huán) 肽-聚乙二醇-生物素粗品，用制備型HPLC純化，冷凍干燥得純品；
第二步在冰上將第一步得到的靶向環(huán)肽-聚乙二醇-生物素純品和帶有鏈酶親和 素的脂質(zhì)體微泡分別溶解于生理鹽水中，將上述兩種生理鹽水溶液混合，得到靶向環(huán)肽 修飾的脂質(zhì)體微泡。所述的C(RGDyK)的制備方法如下利用芴甲氧羰基固相多肽合成方法，以 0-(ΙΗ-苯并三唑-1-基)-Ν,Ν,Ν',Ν’-四甲基異脲六氟化磷和二異丙基乙胺為縮合劑，依 次在芴甲氧羰基-甘氨酸-二氯三苯甲基樹(shù)脂上(Fmoc-Gly-2-CKTrt resin)接入側(cè)鏈 保護(hù)的精氨酸(R)、賴氨酸(K)、d_酪氨酸(y)和天冬氨酸(D)，經(jīng)1%三氟乙 酸(TFA)切割后得到側(cè)鏈保護(hù)的線狀肽鏈D (otBu) -Y (tBu) -K (Boc) -R (Pbf) -G。再在 DIEA的催化下，用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)進(jìn)行環(huán)化而 得。本發(fā)明的原理如下
1.精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(arginine-glycine-asparagic acid, RGD)系列是整合素
結(jié)合配基的最常見(jiàn)識(shí)別位點(diǎn)。整合素α ν β 3能識(shí)別ECM中特異構(gòu)象的RGD配體。人 工合成含RGD肽鏈高通量篩選發(fā)現(xiàn)，首尾環(huán)合的精氨酸-甘氨酸_天門(mén)冬氨酸-(右旋) 酪氨酸-賴氨酸(C(RGDyK))、精氨酸_甘氨酸_天門(mén)冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-賴 氨酸(RGDfK)等五肽分子也能和整合素α νβ 3受體特異結(jié)合，對(duì)五肽中賴氨酸側(cè)鏈上 活性氨基進(jìn)行小分子修飾并不會(huì)顯著影響受體與配基結(jié)合活性。在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)活化HSCs中整合素ανβ3表達(dá)明顯上調(diào)， C(RGDyK)多肽在早期肝纖維化的診斷中可以做為一種潛在的示蹤劑。這部分研究 結(jié)果已經(jīng)發(fā)表 SCI 文章Biochemical characterization of the binding of cyclic RGDyK to hepatic stellate cells. Xiao-wei Huang, Ji-Yao Wang, et al. Biochemical Pharmacology. 2010, 80: 136-143. (IF=4.8,2008)
另外，我們也發(fā)現(xiàn)在硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)和膽總管結(jié)扎(bile duct ligation, BDL)誘導(dǎo)的兩種大鼠肝纖維化模型中，整合素α νβ 3和a_平滑肌肌動(dòng)蛋白 (a-smooth muscle actin, α-SMA)表達(dá)在程度和部位上密切相關(guān)，它和肝纖維化的發(fā)展 趨勢(shì)是一致的。并已經(jīng)進(jìn)行了 SPECT顯像的初步體內(nèi)研究。2.目前，國(guó)外已有不少通過(guò)以RGD環(huán)肽標(biāo)記的對(duì)比劑對(duì)整合素α νβ 3受體表達(dá) 進(jìn)行顯像的分子影像學(xué)研究。主要工作集中在腫瘤新生血管、血管損傷重塑、破骨細(xì)胞 參與的骨重建等方面。雖然常規(guī)超聲難以在早期診斷肝纖維化，但是超聲微泡的應(yīng)用極大地改善了聲學(xué)圖像，而且靶向超聲微泡的應(yīng)用可使超聲影像拓展到分子影像領(lǐng)域，造 影定量分析軟件可采集研究區(qū)域內(nèi)的序列動(dòng)態(tài)造影影像，分析其內(nèi)各像素及造影劑氣泡 回波的量的變化，從而可獲得反映細(xì)胞功能變化的血流參數(shù)。國(guó)外曾應(yīng)用此技術(shù)了解整 合素α νβ 3在實(shí)驗(yàn)性腫瘤血管新生時(shí)的表達(dá)及干預(yù)后改變。而在肝纖維化中，目前未見(jiàn) 相關(guān)的研究報(bào)道。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
1.分子成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于它能從空間和時(shí)間上對(duì)活體生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行量化，避免 抽樣誤差并彌補(bǔ)組織學(xué)分析不能提供功能信息的缺陷；另外，由于分子影像學(xué)手段可以 對(duì)同一動(dòng)物的分子表達(dá)模式進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，所以可以大大減少對(duì)動(dòng)物的需求并增加研究 結(jié)果的可信度。2.超聲波成像技術(shù)在若干方面優(yōu)于其他成像模式。例如，超聲成像是瞬間和實(shí) 時(shí)的，而其他大多數(shù)成像程序的完成時(shí)間通常要以分鐘計(jì)算。與核醫(yī)學(xué)及CT技術(shù)不同， 超聲成像無(wú)需使用電離輻射。盡管核磁共振成像技術(shù)(MRI)可提供與顯微超聲系統(tǒng) (Vevo770)相似的空間分辨率，但對(duì)于呼吸或心跳引起的運(yùn)動(dòng)樣本進(jìn)行核磁共振成像是困 難和耗時(shí)的。最新的高頻微超聲波成像技術(shù)(VeVO770)可達(dá)到與核磁共振成像相接近的 空間分辨率，并能實(shí)現(xiàn)在同一平臺(tái)上無(wú)創(chuàng)傷性地進(jìn)行實(shí)時(shí)的解剖學(xué)，血流動(dòng)力學(xué)及分子 數(shù)據(jù)采集和量化分析研究。微型超聲波成像可運(yùn)用在各種不同的物質(zhì)上，而且對(duì)成像理 論與經(jīng)驗(yàn)要求很低。3.超聲成像造影劑應(yīng)用了微氣泡的散射特性。最常用的造影劑是被稱為微氣泡 (microbubbles)的氣體壓縮微粒。由于氣/液臨界界面的阻抗差較高，再加上固有的相
互作用，所以，超聲造影劑易于造成比血液或者其他組織更大的超聲波反向散射。包膜 氣泡造影劑微粒對(duì)常規(guī)超聲以及高頻顯微超聲均適用。這些造影劑外殼很薄，殼內(nèi)含有 少量生物相容氣體。通過(guò)靶分子配體造影劑外殼的接合可容易的實(shí)現(xiàn)造影劑對(duì)分子靶標(biāo) 的鎖定。當(dāng)前的技術(shù)允許多種潛在靶分子配體參與這種接合作用，包括單克隆的抗體， 多肽，糖蛋白，和核酸。微氣泡作為一種超聲造影劑，它的直徑通常在0.5-5微米之間， 這正是一般條件下血管的空間。這使得對(duì)血管內(nèi)部分子目標(biāo)的檢測(cè)成為可能，但是對(duì)細(xì) 胞內(nèi)分子的成像還不能達(dá)到。微氣泡可被超聲波的高壓脈沖擊破。這種簡(jiǎn)單快速地將造 影劑氣泡摧毀的過(guò)程使得將這些造影劑迅速地從血液里清除，以及對(duì)結(jié)合分子靶標(biāo)的造 影劑與循環(huán)造影劑的辨別成為可能。與其他種類(lèi)的影像設(shè)備相比，顯微超聲可實(shí)現(xiàn)在單 次成像過(guò)程中快速檢測(cè)若干分子標(biāo)志物的表達(dá)。4.本發(fā)明中，我們首先對(duì)c (RGDyK)進(jìn)行PEG和Biotin修飾，然后把 Biotin-PEG-c (RGDyK)連接在帶有strepavidin涂層外殼的脂質(zhì)體微泡表面。這種延
伸的PEG鏈接不僅改善了超聲微泡的藥代動(dòng)力學(xué)，延長(zhǎng)了靶向微泡循環(huán)時(shí)間，同時(shí)也盡 可能減少了脂質(zhì)體微泡對(duì)結(jié)合的c (RGDyK)的結(jié)合受體能力的空間位阻。


圖1為靶向超聲造影流程示意圖2為纖維化大鼠肝臟靶向超聲微泡增強(qiáng)造影代表性影像圖； 圖3為感興趣區(qū)域(ROI)內(nèi)的平均信號(hào)強(qiáng)度(MPA)與時(shí)間關(guān)系曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1 C(RGDyK)的合成
利用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成方法，以0-(ΙΗ-苯并三 唑-1-基)-Ν,Ν,Ν',Ν’-四甲基異脲六氟化磷(HBTU) / 二異丙基乙胺(DIEA)為縮合 劑，依次在芴甲氧羰基-甘氨酸_ 二氯三苯甲基樹(shù)脂上(Fmoc-Gly-2-Cl-Trt resin)接入 側(cè)鏈保護(hù)的精氨酸(R)、賴氨酸(K)、d_酪氨酸(y)和天冬氨酸(D)，經(jīng)1%三 氟乙酸(TFA)切割后得到側(cè)鏈保護(hù)的線狀肽鏈D (otBu)-Y (tBu)-K(B0C)-R(Pbf)-G。 再在DIEA的催化下，用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)進(jìn)行環(huán) 化而得。具體過(guò)程如下0.25g Fmoc-Gly-2-CKTrt resin (取代度lmmol/g)置于多肽合
成管中，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶脹后，20%哌啶DMF溶液脫去Fmoc保護(hù)基， 加入精氨酸反應(yīng)液(2.2mmol 2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸溶于4ml 0.5mol/L HBTU的DMF溶液與ImlDIEA中)，于室溫振蕩30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后抽濾除 去反應(yīng)液，并以DMF洗滌樹(shù)脂。樹(shù)脂再以20%哌啶DMF溶液脫去Fmoc保護(hù)基，以 同樣的方法依次反應(yīng)叔丁氧羰基-賴氨酸、叔丁基-酪氨酸和叔丁氧基-天冬氨酸，最 后一個(gè)氨基酸接入樹(shù)脂并脫去Fmoc保護(hù)基后，樹(shù)脂用二氯甲烷洗滌數(shù)次，然后加入2ml 1%TFA反應(yīng)2分鐘，抽濾收集濾液，重復(fù)處理10次，合并濾液。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后， 加入蒸餾水析出沉淀，冷凍干燥得側(cè)鏈保護(hù)的線狀肽。所得的線性肽溶于DMF中，加入 1.1倍于多肽量的PyBop與DIEA于室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，反應(yīng)后加水析出沉淀，抽濾得沉淀。 所得沉淀用95%TFA反應(yīng)脫側(cè)鏈保護(hù)，加水稀釋后，與制備型HPLC純化(色譜柱C18 300A,洗脫方法5%乙腈含0.1%TFA水溶液至25%乙腈含0.1%TFA水溶液1小時(shí)梯度 洗脫)，冷凍干燥得c (RGDyK)。實(shí)施例2
(1) c (RGDyK) -PEG-Biotin 合成 將制得的0.012mol C(RGDyK)與O.Olmol生物素-聚乙二醇_N_羥基琥珀酰亞胺酯 (biotin-PEG-NHS)溶解于5ml磷酸鹽緩沖液(pH=8)，于室溫?cái)嚢?小時(shí)，過(guò)濾，制 得C(RGDyK)-PEG-Biotin粗品，經(jīng)制備HPLC純化(色譜柱C18 300九洗脫方法 35%乙腈含0.1%TFA水溶液至55%乙腈含0.1%TFA水溶液1小時(shí)梯度洗脫)，冷凍干燥 得純品。(2) Biotin-PEG-C(RGDyK)修飾的靶向超聲微泡的制備
所用的帶有鏈酶親和素的脂質(zhì)體微泡為加拿大Visualsonics公司生產(chǎn)的VS-11675 型號(hào)產(chǎn)品。首先用綠針頭接上白蓋注射器，注射500 μ 1生理鹽水至造影劑瓶中，所述造 影劑瓶中裝有上述帶有鏈酶親和素的脂質(zhì)體微泡IO9個(gè)/ml，棄針管，留針頭，平衡數(shù)秒 中后拔除針頭。輕柔振蕩10秒，室溫靜置5分鐘。將20 μ g Biotin-PEG-c (RGDyK)用 生理鹽水稀釋至400 μ 1終體積，儲(chǔ)存在Iml Ep管中。用帶綠色針頭的Iml注射器將多肽 轉(zhuǎn)移至造影劑瓶中，終體積為900 μ 1。輕柔振蕩15min，室溫靜置得到靶向微泡修飾的造影劑。將上述 Biotin-PEG-c (RGDyK)用同型對(duì)照多肽 c (RGAyK) -PEG-Biotin 替換，
同樣方法制備同型對(duì)照造影劑。將灰色針頭接上預(yù)充0.7ml生理鹽水的綠蓋注射器，用于注射后沖洗。用綠針 接上Iml注射器，抽吸大約100 150 μ 1同型對(duì)照造影劑，換灰色針頭備用。同樣的方 法抽吸100 150 μ 1靶向多肽造影劑，換灰色針頭備用。上述操作均在冰上進(jìn)行。應(yīng)用例
使用實(shí)施例2得到的靶向微泡修飾的造影劑以及同型對(duì)照造影劑進(jìn)行靶向超聲微 泡造影如下
1、進(jìn)入VisualSonics Vevo770 高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)，設(shè)置參數(shù):RMV 707B 30MHz, Power 50%, RF cycles 1, Frame rate 20, Sequence Destroy Position 30o/o。2、將大鼠麻醉，體溫維持在37°C，仰臥固定，剔除腹部鼠毛，選擇合適的體位 使肝臟影像在最大截面，行尾靜脈插管。3、進(jìn)行靶向超聲微泡造影流程。4、將靶向微泡修飾的造影劑和同型對(duì)照造影劑通過(guò)大鼠尾靜脈插管注入。注入 微泡的量為100-150 ul (5X IO7微泡&100 ul)，然后用20 ul的生理鹽水沖洗。5、每一只大鼠都以隨機(jī)的順序接受一劑靶向微泡修飾的造影劑和一劑同型對(duì)照 造影劑，前后間隔20分鐘。注射之后立即以10%的低能量確認(rèn)微泡在肝臟中的存在，隨 后停止采樣4分鐘。6、經(jīng)過(guò)4分鐘的積累期之后，圖象采集以50%的能量重新開(kāi)始。采集了大約 200幀圖象之后，用中心頻率為10 MHz的高能破壞脈沖破壞上升峰的微泡。在高能破壞 脈沖之后，圖象采集立即以50%的能量重新開(kāi)始，可以觀察到循環(huán)中殘留的微泡重新充 盈峰值。7、結(jié)果分析
黏附的微泡用破壞一減影影像程序獲取。在應(yīng)用破壞脈沖之前肝臟內(nèi)的像素幅度來(lái) 源于組織、粘附微泡和循環(huán)中的非粘附微泡的聲學(xué)反應(yīng)。破壞脈沖消除了上升峰內(nèi)的微 泡，在破壞脈沖之后的幾秒鐘內(nèi)，像素幅度來(lái)源于組織和重新補(bǔ)充上升峰的循環(huán)中殘留 的非粘附微泡。代表粘附微泡的像素的空間分布通過(guò)數(shù)字減影的方式獲得，即從破壞脈 沖之前的圖象中減去破壞脈沖之后的參考圖象。參考圖象由100幀“7秒)圖象構(gòu)成， 是在破壞脈沖應(yīng)用之后立即采集的，并且預(yù)先以3X3的低通過(guò)濾去除噪音。參考圖象一 張張地與類(lèi)似的經(jīng)過(guò)過(guò)濾的對(duì)比影像相比較，與參考圖象相關(guān)性最好的圖象被選出來(lái)， 這樣做可以使減影之后的圖象中殘留的微泡信號(hào)最少。相關(guān)性最好的參考圖象以數(shù)字減 影的方式從使用破壞脈沖之前和之后所采集的圖象中去除，像素幅度的差異被編碼成彩 色掩碼覆蓋在B超圖象上。如圖1所示，為靶向超聲造影流程示意圖。圖2為纖維化大 鼠肝臟靶向超聲微泡增強(qiáng)造影代表性影像圖。圖3為感興趣區(qū)域(ROI)內(nèi)的平均信號(hào)強(qiáng) 度(MPA)與時(shí)間關(guān)系曲線圖。
權(quán)利要求
1.一種靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡，包括帶有鏈酶親和素的脂質(zhì)體微泡，其特征在 于，所述脂質(zhì)體微泡通過(guò)鏈酶親和素與生物素的親和作用連接生物素-聚乙二醇-可與肝 纖維化或肝硬化中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的受體相結(jié)合的靶向環(huán)肽。
2.如權(quán)利要求1所述的靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡，其特征在于，所述的肝纖維化或 肝硬化中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的受體為整合素。
3.如權(quán)利要求1所述的靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡，其特征在于，所述的整合素為整 合素ανβ30
4.如權(quán)利要求1所述的靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡，其特征在于，所述的靶向環(huán)肽為 帶有精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸序列的環(huán)肽。
5.如權(quán)利要求1所述的靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡，其特征在于，所述的帶有精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的環(huán)肽為環(huán)(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-賴氨酸)。
6.如權(quán)利要求5所述的靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡，其特征在于，所述的環(huán)(精氨 酸_甘氨酸_天冬氨酸_酪氨酸_賴氨酸)的制備方法如下利用芴甲氧羰基固相多肽合成方法，以0-(頂-苯并三唑-1-基)-風(fēng)風(fēng)"3’-四甲基 異脲六氟化磷和二異丙基乙胺為縮合劑，依次在芴甲氧羰基_甘氨酸_ 二氯三苯甲基樹(shù)脂 上接入側(cè)鏈保護(hù)的精氨酸、賴氨酸、d_酪氨酸和天冬氨酸，經(jīng)三氟乙酸切割后得到側(cè)鏈 保護(hù)的線狀肽鏈；再在二異丙基乙胺的催化下，用六氟磷酸苯并三唑-ι-基-氧基三吡咯 烷基磷進(jìn)行環(huán)化而得。
7.權(quán)利要求1所述的靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡的制備方法，其特征在于，具體步驟為第一步將摩爾比為1.1 1.3: 1的靶向環(huán)肽與生物素-聚乙二醇-N-羥基琥珀 酰亞胺酯共同溶解于pH=8的磷酸鹽緩沖液中，室溫?cái)嚢?-5小時(shí)，過(guò)濾，得到靶向環(huán) 肽-聚乙二醇-生物素粗品，用制備型HPLC純化，冷凍干燥得純品；第二步在冰上將第一步得到的靶向環(huán)肽-聚乙二醇-生物素純品和帶有鏈酶親和 素的脂質(zhì)體微泡分別溶解于生理鹽水中，將上述兩種生理鹽水溶液混合，得到靶向環(huán)肽 修飾的脂質(zhì)體微泡。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡及其制備方法。所述的靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡包括帶有鏈酶親和素的脂質(zhì)體微泡，其特征在于，所述脂質(zhì)體微泡通過(guò)鏈酶親和素與生物素的親和作用連接生物素-聚乙二醇-可與肝纖維化或肝硬化中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的受體相結(jié)合的靶向環(huán)肽。本發(fā)明還提供了上述靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡的制備方法。將本發(fā)明的靶向環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體微泡應(yīng)用于超聲造影，具有較高的靈敏度。
文檔編號(hào)A61K49/22GK102008736SQ20101058291
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者王吉耀, 謝操, 陸偉躍, 黃曉偉 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué), 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院