專利名稱：嵌合因子Ⅶ分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及嵌合人凝血因子VII (FVII)多肽以及編碼這類多肽的多核苷酸構建體、包含并表達所述多核苷酸的載體和宿主細胞、藥物組合物、治療用途和方法，所述嵌合人凝血因子VII多肽與目前可得到的因子VII多肽相比具有較大的促凝劑活性和較少的血栓形成并發癥。
背景技術：
凝血是由不同的血液組分(或因子)的復雜相互作用構成的過程，其最終產生纖維蛋白凝塊。通常，參與稱為凝結“級聯”的血液組分為酶學上無活性的蛋白質(酶原或原酶)，所述蛋白質通過激活劑(其本身為經激活的凝血因子)的作用轉化為蛋白水解酶。已經歷這種轉變的凝血因子通常稱為“活性因子”，并通過將字母“ a”加至凝血因子的名稱上來命名(例如，經激活的因子VII被命名為因子VIIa或FVIIa)。正常情況下，止血過程的啟動由組織因子和因子VIIa之間復合體的形成介導。然后，該復合體將因子IX(FIX)和X(FX)轉化為其活性形式。在含組織因子的細胞上，因子 Xa(FXa)將有限量的凝血酶原轉化為凝血酶。凝血酶將血小板和因子V(FV)及VIII (FVIII) 激活成因子Va (FVa)和VlIIa(FVIIIa)，兩種輔因子在進ー步的過程中引致全面的凝血酶爆發。該過程包括通過因子IXa(FDCa)(在與因子VIIIa的復合體中)生成因子)(a并在經激活的血小板表面上進行。最后，凝血酶將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，導致纖維蛋白凝塊形成。近幾年，已發現因子VII和組織因子是凝血的主要起始因子。因子VII是血漿糖蛋白，其作為單鏈酶原在血液中循環。酶原具有邊際催化活性。 在體外，因子Xa、因子Xlla、因子IXa、因子VIIa或凝血酶可將單鏈因子VII轉化為雙鏈因子Vila。因子)(a被認為是因子VII的主要生理激活劑。與止血中包含的數種其它血漿蛋白質類似，因子VII的活性依賴于維生素K，在蛋白質氨基末端附近聚簇的多個谷氨酸殘基的Y羧化需要維生素K。金屬離子引起的因子VII和磷脂的相互作用需要這些經γ羧化的谷氨酸。酶原因子VII向激活的雙鏈分子的轉變通過切割內部Arg152-Ileira肽鍵發生。 另外，眾所周知，高濃度的因子VII導致體外自體活化。在組織因子、磷脂和鈣離子的存在下，雙鏈因子VIIa通過有限的蛋白酶解快速激活因子X或因子IX。編碼人FVII(hFVII)的基因映射到染色體13的q34_qter 9處(de Grouchy等人， Hum Genet 1984 ；66 :230-233)。其包含九個外顯子并且跨越 12. 8Kb (0' Hara 等人，Proc Natl Acad Sci USA 1987;84:5158-5162)。FVII的基因組織和蛋白質結構類似于其它維生素K依賴性促凝血蛋白質，其中外顯子Ia和Ib編碼信號序列；外顯子2編碼前肽和GLA 結構域；外顯子3a編碼短的疏水區；外顯子4和5編碼表皮生長因子樣結構域；以及外顯子 6-8編碼絲氨酸蛋白酶催化結構域(Yoshitake等人，Biochemistry 1985 ；24 :3736-3750)。因子IX(克里斯馬斯因子)是在正常止血中有活性的絲氨酸蛋白酶的酶原，酶促活性需要特定谷氨酸殘基的羧化。因子IX、X、VII和蛋白質C是緊密相關的相同絲氨酸蛋白酶家族的種內同源基因，具有高度的氨基酸序列同一性以及編碼這些蛋白質的基因的內含子-外顯子排列。這些緊密相關的蛋白質從氨基末端到羧基末端具有類似的功能結構域結構，包括Y-羧基谷氨酸(GLA)結構域、兩個表皮生長因子樣(EGF)結構域、激活肽和催化結構域。S蛋白為666個氨基酸的維生素K依賴性蛋白質，具有GLA結構域、4個EGF樣結構域、凝血酶敏感區和2個層粘連蛋白結構域。維生素K依賴性凝結血漿蛋白質包含作為蛋白質附著至膜的位點起作用的GLA結構域，GLA結構域在不同的凝結蛋白質(coagulation protein)之間高度保守。盡管它們具有相似性，但GLA結構域對磷脂表現出廣泛的親和力，其中S蛋白的GLA結構域對磷脂具有最高的親和力。(Ellison 等人，Biochemistry, 1998 ；37 :7997-8003)，(McDonald 等人， Biochemistry 1997 ；36 :5120-27)。常需要刺激或改善受試者中的凝結級聯。因子VIIa已用來控制出血障礙，所述出血障礙具有數種成因例如凝血因子缺乏(例如，血友病A和B或凝血因子XI或VII缺乏) 或存在凝血因子抑制劑。因子VIIa也已用來控制具有正常發揮作用的凝血級聯(無凝血因子缺乏或針對任何凝血因子的抑制劑)的受試者內發生的過度出血。這種出血可例如由血小板功能缺陷、血小板減少或馮維勒布蘭德病(von Willebrand' s disease)所導致。出血還是與手術和其它形式的創傷有關的主要問題。例如，因子VII已廣泛用于治療在伊拉克和阿富汗中受傷的士兵。(Perkins JG等人.The Journal of Trauma. 2007 ； 62 :1095-9 ；討論9-101)。其使用已證實挽救了許多生命，但是就像大多數醫學治療一祥， 存在副作用，例如中風或其它治療后的血栓形成事件。但是，使用FVIIa的醫師的總體印象是，其使用所挽救的生命比所失去的生命要多很多。也許對此最好的說明是，在以前的戰爭中，大約30%的傷者死于他們的損傷，而在當前的海灣戰爭中的死亡數目已減少至約 10%。(Gawande A，等人，N Engl J Med. 2004 ；351 :2471-5)。表達因子VIIa的轉基因血友病B小鼠的研究證實，因子VIIa的連續低水平表達 (低于1.5yg/ml)修復血友病B小鼠中的凝血活性。但是，野生型或血友病B小鼠中高于2μ g/ml的因子Vila的水平導致心臟和肺中形成血栓；心臟和肺均為高組織因子表達位點。這表明，當接觸在心臟和肺中于血管損傷時暴露的組織因子吋，循環中高水平的因子 VIIa 引起血栓形成。(Margaritas 等人，J. Clin. Invest. 2004 ；113 :1025-31)。此外， 研究顯示，血友病狗中載體介導的犬因子VIIa的基因轉移在短期和中期既安全又有效。 (Margaritas 等人，Gene Therapy 2009 ；113 :3682-3689)。目前對正在尋求監管部門批準的制品提出了與因子VII治療有關的警告。例如，歐洲藥品管理局人類藥品評估單位(European Medicines Agency, Human Medicines Evaluation Unit)勸告，目前的因子VII療法帶有患血栓形成和彌散性血管內凝血的風險的警告，尤其是在將因子VII給予有冠心病或肝臟疾病歷史的患者、手術后的患者、新生兒以及處于來自血栓形成和彌漫性血管內凝血的風險中的那些患者吋。見，例如，Core SPCfor Human Plasma Derived Coagulation Factor VII ProductsC 用于從人血漿獲得的凝血因子 VII 制品的核心 SPC) (CPMP/BPWG/2048/01)，2004 年 7 月。在此之前已顯示，因子VIIa的EGF-I結構域在因子VIIa對組織因子的親和カ方面發揮關鍵的作用。在組織因子存在和不存在兩種情況下使用合成底物和因子X兩者，帶有因子IX的EGF-I結構域的因子VIIa多肽具有比野生型因子VIIa低的催化活性。(Jin 等人，Biochemistry, 1999,28 =1185-92)。乍看起來，這似乎無須使用嵌合體構建體來治療出血；但是，Monroe (British Journal of Haematology 1997 ；99 :542-549)提出，FVIIa在治療血友病和出血中的機制不依賴于組織因子。但是，本領域中對因子VIIa是否獨立于組織因子而為非活性的的觀點有分歧。人重組FVIIa 的商業制劑以 Novc^even 和 Novc^even RT 出售。Novc^even 和 Novc^even RT適用于治療血友病A或B患者中的出血事件，并且是市面上可獲得的治療出血事件的唯一的rFVIIa。最近，已證實Novokven 可與再水化凍干血小板結合，它們可以聯合給予以使因子VII定位到損傷位點。(Fischer等人，Platelets, 2008 ；19 :182-91)。 另外，據顯示，因子VII的選擇性聚乙ニ醇化可増加血漿半衰期(Stermicke等人，Thromb. Haemost, 2008 ； 100 :920-28)，以及具有3個氨基酸取代的重組人因子VII在血小板表面上的活性増加。(Moss等人，J. Thromb. Haemost.，2009 ；7 =299-305)。本發明嵌合因子VIIa分子的聚乙ニ醇化預期以類似方式運作，從而增加血漿半衰期。同樣，在本發明嵌合因子VIIa 分子中，本領域中已知的其它蛋白質修飾(例如非多肽部分的共價連接以形成綴合物(例如糖基化))預期以類似方式發揮作用，即，由非多肽部分的共價連接賦予蛋白質的性質預期賦予嵌合因子VIIa分子。存在對可以以相對低的劑量給予的具有高促凝劑活性的因子VIIa變體的需要， 以及存在對產生較少與可用的治療有關的不良副作用(例如血栓形成并發癥)的變體的需要。發明ネ既述本申請公開了提供一種或多種所需益處的嵌合FVIIa分子，特別是包含hFVIIa結構域和來自凝血系統(coagulation system)的ー種或多種蛋白質的結構域的嵌合hFVIIa 分子。因此，與市售rFVIIa相比，本發明的嵌合FVIIa分子具有ー種或多種改善的性質，包括具有較高的促凝劑活性和/或能夠以相對低的劑量給予和/或產生較少的血栓形成并發癥。因此，使用本發明嵌合體的醫療提供優于目前可得的rFVIIa化合物的優點，例如潛在較低的劑量和/或較少的不良副作用。本發明代表性的嵌合FVIIa多肽包括這樣的嵌合FVIIa，其包含FVII的EGF-2和催化結構域及維生素K依賴性凝結蛋白質的GLA結構域以及維生素K依賴性凝結蛋白質的EGF-I結構域。在本發明特定的實施方案中，本發明的嵌合FVIIa多肽包括1)以下嵌合FVIIa，其包含FIX的GLA和EGF-I結構域及FVII的EGF-2和催化結構域；2)以下嵌合 FVIIa，其包含FIX的EGF-I結構域和FVII的GLA、EGF_2和催化結構域；3)以下嵌合FVIIa， 其包含S蛋白的GLA結構域、FIX的EGF-I結構域和FVII的EGF-2和催化結構域；4)以下嵌合FVIIa，其包含S蛋白的GLA和EGF-I結構域及FVII的EGF-2和催化結構域；5)以下嵌合FVIIa，其包含S蛋白的EGF-I結構域及FVII的GLA、EGF_2和催化結構域；以及6)以下嵌合FVIIA，其包含S蛋白的EGF-I結構域、FIX的GLA結構域以及FVII的EGF-2和催化結構域。本發明的代表性嵌合FVIIa多肽還可包括野生型FVIIa或任意上述嵌合FVIIa 多肽，其在EGF-I結構域或GLA結構域中具有氨基酸取代。所述取代可以是保守取代或非保守取代。這類取代可包括EGF-I結構域的殘基69處的異亮氨酸被丙氨酸取代和/或殘基79處的精氨酸被丙氨酸取代。其它的取代可包括精氨酸在殘基5處取代賴氨酸，這導致GLA結構域對IV型膠原具有較高的結合親和力，但是似乎并不影響血小板結合(Gui等人，J. Thromb Haemost. 2009 ；7 :1843-1851)；另ー氨基酸、優選為保守氨基酸取代、更優選為丙氨酸在殘基306處取代甲硫氨酸，這進ー步減少對組織因子的親和カ；以及，天冬氨酸在殘基158處取代纈氨酸、纈氨酸在296處取代谷氨酸和/或谷氨酰胺在殘基298處取代甲硫氨酸，這導致因子VIIa具有較高的比活。還提供通過給予ー種或多種本文描述的嵌合FVIIa多肽治療患出血障礙的受試者中的出血障礙的方法。治療出血障礙的方法可包括將核酸分子給予受試者的方法，所述核酸分子包含編碼本發明嵌合因子VIIa多肽的核苷酸序列。另外，本發明提供通過給予包含GLA結構域的蛋白質治療患出血障礙的受試者中的出血障礙的方法，其中相對于該蛋白質在受試者血漿循環中的濃度，該蛋白質靶向和/ 或集中在凝塊部位附近。這可包括利用以比目前可得的因子VII多肽大的親和カ與血小板結合的結構域，所述血小板存在于凝塊形成部位處或附近。這類結構域的實例為不同凝結蛋白質的GLA結構域，其與位于血小板表面的帶負電荷的磷脂層結合。這類GLA結構域的非限制性實例包括FIX的GLA結構域和S蛋白的GLA結構域，所述FIX的GLA結構域比FVIIa的GLA結構域更緊得多地結合血小板和磷脂(Melton等人.“Location of the platelet binding site in zymogen coagulation factor IX( _原凝皿因于 IX 中皿小板結合位點的位置)” Blood Coagul Fibrinolysis 12 :237-243 Q001))，所述 S 蛋白的 GLA結構域比任意其它已知的GLA結構域更緊地結合磷脂((McDonald等人.“Comparison οι naturally occurring vitamin K-dependent proteins !correlation of ammo acia sequences and membrane binding properties suggests a membrane contact site ι, TC 然存在的維生素K依賴性蛋白質的比較氨基酸序列和膜結合性質的相關性表明膜接觸位點)biochemistry :36 :5120-5127 (1997)))。包含GLA結構域的蛋白質的非限制性實例包括包含FIX或S蛋白的GLA結構域的重組蛋白質、包含FIX或S蛋白的GLA結構域的嵌合蛋白質和/或包含FIX或S蛋白的GLA結構域的本發明的嵌合FVIIa多肽。在另ー個實施方案中，本發明提供通過給予本發明嵌合因子VIIa多肽治療患出血障礙的受試者的方法，所述本發明嵌合因子VIIa多肽包含從因子VII多肽獲得的催化結構域和ー個或多個血小板靶向結構域。這類血小板靶向結構域包括來自與血小板表面相互作用或結合的蛋白質的結構域。這種與血小板表面的相互作用或結合可通過血小板的膜磷脂或通過血小板細胞表面蛋白質和/或受體來介導。這類結構域的非限制性實例包括馮維勒布蘭德因子(von Willebrand Factor)的Al結構域，其為血小板糖蛋白Λ的主要結合位點(Emsley等人，JBC，273 10396-10401 (1998))；和與血小板膜蛋白質和/受體結合的抗體(例如與血小板膜磷脂結合的抗體)的Fab片段(結構域)(Out等人，Blood, 77 2655-2659(1991))ο這類利用以下結構域將凝結蛋白質靶向至凝塊部位具有降低與目前因子VII療法有關的并發癥例如血栓形成性(thrombogenicity)的風險的額外但意想不到的益處，所述結構域與血小板結合并具有對組織因子降低的親和力。這種方法還可用來將其它治療上有用的多肽或其它分子靶向到血小板或凝塊部位。這類治療上有用的分子可包括抗凝劑寸。本發明還提供通過給予受試者多肽來治療患出血障礙的受試者中的出血障礙的方法，所述多肽具有與因子VII的血栓形成性相比減少的血栓形成性(例如，與天然因子 VII的血栓形成性相比減少至少約1%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,15%, 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%等)。“減少的血栓形成性”可以根據本領域已知的方法以多種方式來確定，包括但不限干與對照相比較，確定減少的凝塊數目、較小的凝塊、凝塊出現所需要的時間較長(體內或體外試驗中)、較少的由于血栓形成而導致的受試者死亡和/或生存時間延長。與因子VII相比血栓形成性減少的多肽，可例如為本發明的嵌合因子VII多肽或其活性片段。這類多肽的非限制性實例包括以下嵌合FVIIa，其包含FIX的GLA和EGF-I結構域及FVII的EGF-2和催化結構域；以及以下嵌合FVIIa，其包含S蛋白的GLA結構域、FIX的EGF-I結構域和FVII的 EGF-2和催化結構域。附圖簡述

圖1顯示了可用于本發明中的嵌合FVIIa分子的圖示。FVII 因子VII ；FIX:因子 IX圖2顯示了對于不同的野生型因子VIIa濃度，在基于細胞的血友病模型系統中正常情況和血友病情況(移除因子IX和因子VIII)下的凝血酶生成(nM)。圖3顯示了給予50nM野生型因子VIIa或IOnM嵌合因子VIIa時，在基于細胞的血友病模型系統中正常情況和血友病情況(移除因子IX和因子VIII)下的凝血酶生成(nM)。圖4顯示了相對于對照值的峰值凝血酶，所述凝血酶在給予50nM野生型VIIa或 IOnM嵌合因子VIIa后在基于細胞的血友病模型系統中產生。圖5顯示了凝固試驗中無處理的血友病B小鼠、給予ang/kgNovoSeven 的血友病 B小鼠、給予ang/kg嵌合FVIIa分子的血友病B小鼠和無處理的野生型小鼠的中斷止血時丨、日」(disruption hemostasis time)。圖6顯示了本發明示例性嵌合因子VII的序列，其包含因子IX的信號、前肽、GLA 和EGFl結構域(帶下劃線的)(SEQ ID NO :1)。圖7顯示了本發明示例性嵌合因子VII的序列，其包含因子IX的信號、前肽和 EGFl結構域(帶下劃線的)，以及S蛋白的GLA結構域(粗體)(SEQ ID NO 2)。發明描述現在將在下面更充分地描述本發明。但是，本發明可以以不同的形式表達，并且不應解釋為受限于本文給出的實施方案。相反，提供這些實施方案使得本公開內容全面而完整，并將本發明的范圍充分地傳遞給本領域的技術人員。本文中，本發明的說明書中使用的術語僅出于描述特定實施方案的目的，并不意圖限制本發明。如本發明說明書和所附權利要求所使用的，単數形式的“一”、“ー個”和“該” 也意圖包括復數形式，除非上下文另有明確地指出。除非另有定義，否則本文使用的所有術語(包括技術和科學術語)具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。還將理解的是，術語例如在常用字典中定義的那些術語，應理解為具有與其在本申請和相關技術的內容中的含義一致的含義，并且不應在理想化或過于正式的意義上進行理解，除非本文明確地定義。本文中，本發明的說明書中使用的術語僅出于描述特定實施方案的目的，并不意圖限制本發明。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻通過引用以其整體結合到本文中。同樣如本文所使用，“和/或”是指和包括一個或多個相關列出項的任意和所有可能的組合，以及當以或者(“或”)理解時是指不存在組合。除非上下文另有說明，否則特別地意圖的是，本文描述的發明的不同特征可以以
任意組合使用。此外，本發明還考慮，在本發明的一些實施方案中，可排除或省略本文給出的任意特征或特征的組合。為了說明起見，如果說明書指出復合體包含組分A、B和C，則特別意圖的是，可省略和単獨或以任意組合放棄A、B或C中的任一個或其組合。如本文所使用，過渡性短語“基本上由…組成”(以及語法上的變體)應理解為包含列舉的材料或步驟，以及不會實質上影響要求保護的發明的基本和新的特征的那些材料或步驟。參見 In re Herz, 537F. 2d 549，551-52，190U. S. P. Q. 461，463 (CCPA 1976)(原文中的強調)；亦參見MPEP §2111. 03。因此，如本文所使用的術語“基本上由…組成”不應理解為與“包含”等同。如本文所使用，當指可計量的值例如量或濃度等吋，術語“約”意指包括指定量的 20%,10%,5%,1%>0. 5%或甚至 0. 的變化。如本文所使用，術語“活性”意指因子VII多肽將其底物因子X轉化成活性因子fe 的能力。術語“固有活性”也包括在組織因子存在時在經激活的血小板表面上生成凝血酶的能力。術語“N末端GLA結構域”包括氨基酸序列SEQ ID NO 18的約氨基酸殘基61至約氨基酸殘基105的氨基酸序列、氨基酸序列SEQ ID NO: 19的約氨基酸殘基47至約氨基酸殘基92的氨基酸序列、經鑒定的氨基酸序列的任何翻譯后修飾、經鑒定的氨基酸序列中任何保守的氨基酸取代、向經鑒定的氨基酸序列添加氨基酸殘基、自經鑒定的氨基酸序列缺失氨基酸殘基或來自與磷脂膜結合的凝結級聯蛋白質的任何其它氨基酸序列。術語“EGF-1”描述包含六個半胱氨酸的30-40個氨基酸的區，其最初在EGF(表皮生長因子)發現，還在參與細胞信號傳導的多種蛋白以及在凝結蛋白質中發現，其中幾乎所有已知的EGF樣結構域都包含ニ硫鍵1-3、2-4和5-6。因子VII的EGF-I結構域為SEQ ID NO :18氨基酸序列的約氨基酸殘基106至約氨基酸殘基142。因子IX的EGF-I結構域為SEQ ID NO :19氨基酸序列的約氨基酸殘基93至約氨基酸殘基129。S蛋白的EGF-I結構域為SEQ ID NO :20氨基酸序列的約氨基酸殘基117至約氨基酸殘基155。這些氨基酸序列可包含任何對經鑒定的氨基酸序列的翻譯后修飾、經鑒定的氨基酸序列中的任何保守氨基酸取代、向經鑒定的氨基酸序列的任何氨基酸殘基添加和/或自經鑒定的氨基酸序列的任何氨基酸殘基缺失。術語“EGF-2”意指(兩個或更多個EGF樣結構域)串聯中的第二個EGF樣結構域。 因子VII的EGF-2結構域為氨基酸序列SEQ ID NO 18的約氨基酸殘基147至約氨基酸殘基188。因子IX的EGF-2結構域為氨基酸序列SEQ ID NO 19的約氨基酸殘基130至約氨基酸殘基171。S蛋白的EGF-2結構域為氨基酸序列SEQ ID NO 20的約氨基酸殘基157至約氨基酸殘基200。這些氨基酸序列可包含任何對經鑒定的氨基酸序列的翻譯后修飾、經鑒定的氨基酸序列中的任何保守氨基酸取代、向經鑒定的氨基酸序列的任何氨基酸殘基添加和/或自經鑒定的氨基酸序列的任何氨基酸殘基缺失。如本文所用，術語“催化結構域”意指介導肽鍵切割的蛋白質中的結構域。因子VII的催化結構域為氨基酸序列SEQ ID NO :18的約氨基酸殘基213至約氨基酸殘基452。因子IX的催化結構域為氨基酸序列SEQ ID NO :19的約氨基酸殘基227至約氨基酸殘基459。這些氨基酸序列可包含任何對經鑒定的氨基酸序列的翻譯后修飾、經鑒定的氨基酸序列中的任何保守氨基酸取代、向經鑒定的氨基酸序列的任何氨基酸殘基添加和/或自經鑒定的氨基酸序列的任何氨基酸殘基缺失。三個字母表示“GLA”意指4-羧基谷氨酸(Y-羧化谷氨酸)。術語“蛋白酶結構域”意指介導肽鍵切割的蛋白質中的結構域，通常認為是SEQ IDNO 18的約氨基酸殘基213至羧基末端的氨基酸殘基(因子VIIa的重鏈)。如本文所使用，術語“因子VII多肽”是指包含天然人因子VII (SEQ ID NO 18)的氨基酸序列61-466的任何蛋白質或其變體或片段。這包括但不限于人因子VII、人因子VIIa及其變體。如本文所使用，術語“因子VII”意圖包括無活性的一條鏈的酶原因子VII分子和激活的雙鏈因子VII分子(因子Vila)。這包括具有天然人因子VII或因子Vila的氨基酸序列61-466 (SEQ IDNO 18)的蛋白質。本領域的技術人員意識到，可預期微小的序列變化以類似的方式進行，以及在不背離本發明的情況下，涉及的結構域、多肽和因子VII可稍微縮短或延長，或包含取代。因此，該定義還包括具有稍經修飾的氨基酸序列例如經修飾的N末端(包括N末端氨基酸缺失或添加)的蛋白質和肽，使得在一些實施方案中，那些蛋白質基本上保留因子VIIa的活性(例如，保留天然因子VIIa活性的約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %等)。如本文所使用，術語“因子Vila”或“FVIIa”意指由激活形式(因子Vila)構成的產物。上述定義內的“因子VII”或“因子Vila”還包括可在個體之間存在或發生的天然等位基因變化。此外，糖基化或其它翻譯后修飾的程度和位置可根據所選的宿主細胞、組織或表達動物物種和宿主細胞或組織環境的性質而變化。如本文所使用，術語“結構域”意圖包括蛋白質序列和結構的一部分，其可獨立于蛋白鏈的其余部分進化、發揮作用和存在。結構域能夠形成緊湊的三維結構并常可為獨立地穩定和折疊的。一個結構域可以以多種進化相關蛋白質出現。結構域的長度在約25個氨基酸至多達約500個氨基酸之間變化。“結構域”還可包括來自野生型蛋白質的結構域，其具有經由保守取代置換的一個或多個氨基酸殘基。因為它們在蛋白質環境中自穩定，所以結構域可通過蛋白質之間的遺傳工程來“交換”，以產生嵌合蛋白質。如本文所使用，術語“變體”意指具有天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466 (SEQ ID NO 18)的因子VII，其中親本蛋白質的一個或多個氨基酸已被另一氨基酸取代，和/或其中親本蛋白質的一個或多個氨基酸已被缺失，和/或其中一個或多個氨基酸已插入蛋白質中，和/或其中一個或多個氨基酸已添加到親本蛋白質，和/或其中GLA結構域已被來自不同蛋白質的GLA結構域(例如，結合到血小板膜或磷脂膜上的GLA結構域)取代，和/或其中GLA結構域已被來自不同蛋白質的血小板結合結構域(例如，馮維勒布蘭德因子的Al結構域，其為血小板糖蛋白Λ的主要結合位點(Emsley等人，JBC, 273 10396-10401(1998))；和與血小板膜蛋白和/或受體結合的抗體(例如與血小板膜磷脂結合的抗體)的Fab片段(結構域)(Out等人，Blood，77 =2655-2659 (1991)))取代，和/或其中因子VII的EGF-I結構域已被來自不同蛋白質的EGF-I結構域(例如，以較低的親和力與組織因子結合的EGF-I結構域，例如因子IX的EGF-I結構域)取代。這類添加可發生在親本蛋白質的N末端或C末端或兩者，以及在內部發生。因此，在一些實施方案中，本發明的“變體”仍可以以其激活形式具有FVII的凝血活性。在一些實施方案中，本發明的變體可不具有凝血活性。因此，在一些實施方案中，變體與天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466 (SEQ ID NO 18)具有至少 40%、50%、60%或 70% 的同一性。例如，FVII 的 EGF-1 結構域與FIX的EGF-I結構域具有65. 7%同一性，FVII的GLA結構域與FIX的GLA結構域具有58. 6%同一性和與S蛋白的GLA結構域具有51%同一性。在一個實施方案中，變體與天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466 (SEQ ID NO 18)具有至少80%同一性。在另一個實施方案中，變體與天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466 (SEQ ID NO:18)具有至少90%同一性。在又一個實施方案中，變體與天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466 (SEQ ID NO 18)具有至少95%同一性。如本文所使用，術語“任何其它氨基酸”意指與天然存在于該位置的氨基酸不同的一個氨基酸。這包括但不限于可由多核苷酸編碼的氨基酸。優選地，不同的氨基酸呈天然的L形式并可由多核苷酸編碼。特定的實例為L-半胱氨酸(Cys)。如本文所使用，術語“可操作地連接”是指兩個或更多個核苷酸序列通過酶促連接或者以其它方式相對于彼此呈使得可發揮序列的正常功能的構型的共價連接。例如，將編碼前序列或分泌前導序列的核苷酸序列與編碼多肽的核苷酸序列可操作地連接，如果其表達為參與多肽分泌的前蛋白將啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接，如果其影響目標序列的轉錄；將核糖體結合位點與編碼序列可操作地連接，如果將其定位以促進翻譯成目標蛋白質或肽。通常，“可操作地連接”意指連接的核苷酸序列是連續的，在分泌前導序列情況下是連續的并呈閱讀相。連接最容易通過在適宜限制性位點處的連接來完成。如果不存在這種位點，那么與標準的重組DNA方法聯用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。如本文所使用，術語“載體”意指能夠在宿主細胞中擴增的任何核酸實體。因此，載體可為自主復制型載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質粒。或者，載體可為這樣的載體當引入宿主細胞時，其整合到宿主細胞基因組中并隨其所整合到的染色體一起復制。載體的選擇常取決于其將被引入的宿主細胞。載體包括但不限于質粒載體、噬菌體載體、病毒或粘粒載體。載體通常包含復制原點和至少一個選擇基因，即編碼以下產物的基因，所述產物容易檢測或者其存在對于細胞生長是必要的。如本文所使用，術語“宿主細胞”表示可表達異源DNA的任何細胞，包括雜交細胞。典型的宿主細胞包括但不限于昆蟲細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞包括人細胞，例如BHK、CH0、HEK和COS細胞。在實施本發明時，培養的宿主細胞優選為哺乳動物細胞，更優選為確立哺乳動物細胞系，包括但不限于CHO(例如，ATCC CCL 61)、C0S-1 (例如，ATCC CRL1650)、幼倉鼠腎(BHK)和 HEK293 (例如，ATCC CRL 1573 ；Graham 等人，J. Gen. Virol. 36 59-72,1977)細胞系。合適的 BHK 細胞系為 t!Ttsl3BHK 細胞系(Waechter 和 Baserga，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 79 :1106_1110，1982)，以下稱為 BHK 570 細胞。BHK 570 細胞系可從 American Type Culture Collection (美國典型培養物保藏所)，10801University，Boulevard, Manassas, Va. 20110 獲得，ATCC 登記號為 CRL 10314。tk-tsl3BHK 細胞系也可從ATCC獲得，登記號為CRL 1632。其它合適的細胞系包括但不限于Rat Hep 1(大鼠肝癌；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCCCCL 9. 1)禾口 DUKX 細胞(Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 77 :4216-4220,1980) 同樣有用的有3T3細胞、Namalwa細胞、骨髓瘤和骨髓瘤與其它細胞的融合物。如本文所使用，術語“合適的生長培養基”意指包含細胞生長和編碼本發明因子VII多肽的核酸序列表達所需的營養和其它組分的培養基。術語“綴合物”(或可互換地，“綴合多肽”)意指通過一個或多個多肽與一個或多個非多肽部分的共價連接形成的異源(在復合或嵌合的意義上)分子，所述非多肽部分為例如聚合物分子、親脂化合物、糖部分或有機衍生劑。優選地，綴合物在相關濃度和條件下可溶，即，可溶于生理流體例如血液中。本發明綴合多肽的實例包括經糖基化和/或聚乙二醇化多肽。術語“共價連接”意指多肽和非多肽部分彼此直接共價連接，或通過一個或多個間插部分彼此間接共價連接，所述間插部分為例如一個或多個橋、間隔基或連接部分。可使用術語“非綴合多肽”來指綴合物的多肽部分。當在本文中使用時，術語“非多肽部分”意指能夠與本發明多肽的連接基團綴合的分子。這類分子的合適實例包括聚合物分子、糖部分、親脂化合物或有機衍生劑。當在本發明綴合物的上下文中使用時，將理解的是，非多肽部分通過多肽的連接基團連接到綴合物的多肽部分。如上面所解釋，非多肽部分可直接共價連接到連接基團，或可通過一個或多個間插部分間接共價連接到連接基團，所述間插部分為例如一個或多個橋、間隔基或連接部分。“聚合物分子”為通過兩個或更多個單體的共價連接形成的分子，其中沒有單體是氨基酸殘基，除了在聚合物為人白蛋白或另一豐富的血漿蛋白質時。術語“聚合物”可與術語“聚合物分子”互換使用。該術語意圖包括通過體外糖基化連接的糖類分子，體外糖基化即，體外進行的通常包括將糖類分子與多肽的連接基團共價連接的合成糖基化，其任選使用交聯劑。通過體內糖基化例如N-或0-糖基化(如下面進一步所描述)連接的糖類分子在本文中被稱為“糖部分”。除了明確指出綴合物中非多肽部分例如聚合物分子或糖部分的數目時以外，每次對包含于綴合物中或者以其它方式用在本發明中的“非多肽部分”的提及應指提及一個或多個非多肽部分，例如聚合物分子或糖部分。術語“連接基團”意指多肽的官能團，特別是其氨基酸殘基或糖類部分的官能團，其能夠連接非多肽部分例如聚合物分子、親脂分子、糖部分或有機衍生劑。對于體內N-糖基化，術語“連接基團”以非傳統方式使用，是指構成N-糖基化位點(序列為N-X-S/T/C，其中X為除脯氨酸外的任意氨基酸殘基，N為天冬酰胺以及S/T/C為絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸，優選為絲氨酸或蘇氨酸，以及最優選為蘇氨酸)的氨基酸殘基。盡管N-糖基化位點的天冬酰胺殘基為糖部分在糖基化過程中與之連接的殘基，但是，除非存在N-糖基化位點的其它氨基酸殘基，否則這種連接不能實現。
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因此，當非多肽部分為糖部分以及綴合將通過N-糖基化來實現時，如與目標多肽的氨基酸序列變化有關地使用的術語“包含用于非多肽部分的連接基團的氨基酸殘基”應理解為如下的含義構成N-糖基化位點的一個或多個氨基酸殘基將以使得功能性N-糖基化位點引入氨基酸序列中或從所述序列中移除的這樣的方式改變。在本文中，術語“處理”或“治療”意在包括控制和/或預防預期出血例如在手術中，以及調節已發生的出血，例如在創傷中或在按需治療血友病患者中，其目的在于抑制或最小化出血。因此術語“治療”包括本發明因子VIIa多肽的預防給予。術語“出血事件”意在包括失控的和過度的出血。出血事件可為與手術和其它形式的組織損傷有關的主要問題。失控的和過度的出血可發生在具有正常凝血系統的受試者中以及患有凝血或出血障礙的受試者中。如本文所使用，術語“出血障礙”反映出血中表現出的細胞、生理或分子起源的任何先天性、獲得性或誘導性缺陷。實例為凝血因子缺乏(例如，血友病A和B或凝血因子XI或VII缺乏)、凝血因子抑制劑、血小板功能缺陷、血小板減少、馮維勒布蘭德病或由手術或創傷引起的出血。過度出血還發生在具有正常發揮作用的凝血級聯(無凝血因子缺乏或針對任何凝血因子的抑制劑)的受試者中以及可由血小板功能缺陷、血小板減少或馮維勒布蘭德病引起。在這些情況中，出血可比作由血友病導致的那些出血，因為如在血友病中，止血系統缺乏必要的凝固“化合物”(例如血小板或馮維勒布蘭德因子蛋白質)或具有異常的必要的凝固“化合物”，導致大出血。在經歷與手術或創傷有關的大量組織損傷的受試者中，正常的止血機制可被立即止血的需求壓倒，并且盡管具有正常的止血機制，但他們可能形成出血。當出血發生在手術止血的可能性有限的器官例如腦、內耳區域和眼時，獲得滿意的止血也是問題。相同的問題可在對不同的器官(肝、肺、腫瘤組織、胃腸道)進行活組織檢查的過程中和在腹腔鏡手術中出現。對所有這些情況相同的是難以通過手術技術(縫線、夾緊等)提供止血，當出血是彌漫性的時(出血性胃炎和血崩)也是這種情況。急性和大出血還可發生在進行抗凝療法的受試者中，在所述受試者中，缺陷性止血由給予的療法引起。這種受試者在不得不快速抵消抗凝效果情形中可能需要手術介入。恥骨后前列腺根治切除術是常對患有局限性前列腺癌的受試者進行的程序。該手術常因顯著失血和有時大量失血而復雜化。前列腺切除術過程中大量失血主要與具有許多密集的血管化部位的復雜解剖情況相關，所述部位對于手術止血來說不容易接近，并且可導致大面積的彌漫性出血。同樣，腦內出血是中風最不可治療的形式并與高死亡率和腦內出血后最初幾個小時內的血腫生長相關。用rFVIIa進行治療可限制血腫的生長、減少死亡率并改善在90天時的功能性結果。但是，使用目前可獲得的rFVIIa有發生血栓栓塞性不利事件的風險。具有較低血栓形成性的本發明嵌合因子VII分子，可克服中風療法中的此問題。在不滿意止血的情況中可導致問題的另一情形是給予具有正常止血機制的受試者抗凝療法以防止血栓栓塞性疾病時。這類療法可包括肝素、其它形式的蛋白聚糖、華法林或其它形式的維生素K拮抗劑以及阿司匹林和其它血小板聚集抑制劑。在本發明的一個實施方案中，出血與血友病相關。在另一個實施方案中，出血與具有獲得性抑制劑的血友病相關。在另一個實施方案中，出血與血小板減少相關。在另一個實施方案中，出血與馮維勒布蘭德病相關。在另一個實施方案中，出血與嚴重的組織損傷相關。在另一個實施方案中，出血與嚴重創傷相關。在另一個實施方案中，出血與手術相關。在另一個實施方案中，出血與腹腔鏡手術相關。在另一個實施方案中，出血與出血性胃炎相關。在另一個實施方案中，出血與血崩相關。在另一個實施方案中，出血發生在機械止血的可能性有限的器官中。在另一個實施方案中，出血發生在腦、內耳區域或眼中。在另一個實施方案中，出血與進行活組織檢查的過程相關。在另一個實施方案中，出血與抗凝療法相關。如本文所使用，術語“受試者”意指任何動物，特別是哺乳動物例如人，以及適當時可與術語“患者”互換使用。術語“正常止血系統的增強”意指提高產生凝血酶或產生功能性凝塊的能力。術語“基因療法”是指通過基因的外源給予改變內源基因的表達的方法。如本文所使用，“基因療法”還指編碼缺陷蛋白質的缺陷基因的置換，或缺失基因的置換，其通過將對應于缺陷或缺失基因的功能性基因引入有需要的個體的體細胞或干細胞中來進行。基因療法可通過離體方法完成，其中將分化的干細胞或體干細胞從個體機體中移除，接著利用病毒載體作為基因遞送載體將缺陷基因的正常拷貝引入外植的細胞中。另外，體內直接基因轉移技術允許利用大范圍的病毒載體、脂質體、蛋白質DNA復合體或裸DNA將基因原位轉移入個體的細胞中，以達到治療結果。術語“基因療法”還指通過引入多核苷酸至有需要的個體的體細胞或干細胞中來置換編碼缺陷蛋白質的缺陷基因，所述多核苷酸基本上與缺陷基因或蛋白質在其非缺陷時應發揮的作用一樣地發揮作用。在本發明中，在給予受試者核酸分子的情形中使用基因療法，所述核酸分子包含編碼本發明嵌合FVII的核苷酸序列。因此，本發明提供分離的核酸分子，其包含編碼本發明嵌合FVII蛋白質的核苷酸序列。這類核酸分子可存在于核酸構建體(例如，載體或質粒)中。這類核酸構建體可存在于細胞中。本文還提供將本發明嵌合FVII蛋白質遞送至細胞的方法，包括將包含編碼嵌合FVII蛋白質的核苷酸序列的核酸分子在表達核苷酸的條件下引入細胞中，以在細胞中產生嵌合FVII蛋白質。細胞可為引入受試者內的細胞和/或細胞可為已存在于受試者內的細胞。嵌合因子VII的制備本文描述的嵌合因子VII多肽可通過重組核酸技術產生。一般來說，將克隆的野生型因子VII核酸序列修飾以編碼所需蛋白質。然后將該經修飾的序列插入表達載體中，接著將該載體轉化或轉染到宿主細胞內。高等真核細胞特別是培養的哺乳動物細胞適合作為宿主細胞。已知人因子VII的完整核苷酸和氨基酸序列(見美國專利第4，784，950號，在此描述了重組人因子VII的克隆和表達；以及GenBank 登記號J(^933和AAA51983，和SwissProt登記號P08709-1)，本文將該氨基酸序列作為SEQ ID N0:18提供。牛因子VII序列描述于Takeya等人，J. Biol. Chem. 263 14868-14872 (1988)中。已知因子IX的完整核苷酸和氨基酸序列(見 Davie 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1982 ；79 :6461-6464 ；Jaye 等人，Nucleic Acids Res. 1983 ；11 :2325-2335 ；和 McGraw 等人，Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. Α. 1985 ；82 :2847-2851 以及 GenBank 登記號 J00136 和 AAA98726 及 SwissProt登記號P00740)，本文將該氨基酸序列作為SEQ ID NO :19提供；S蛋白的完整核苷酸和氨基酸序列亦是如此(見 Hoskins 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 1987 ；84 :349-353 以及GenBank. 登記號M15036和AAA36479及SwissProt登記號P0722Q，本文將該氨基酸序列作為SEQ ID NO :20提供。還已知其它凝結蛋白質的完整核苷酸和氨基酸序列，并可利用SwissProt或在NCBI網頁處查看。氨基酸序列改變可通過多種技術完成。核酸序列的修飾可通過位點特異性誘變來進行。位點特異性誘變技術是本領域熟知的并描述于例如化^吐和Smith(DNA 3 479-488,1984)或“Splicing by extension overlap (通過延伸重疊的剪接)”，Horton 等人，Gene 77，1989，第61-68頁中。因此，利用因子VII的核苷酸和氨基酸序列，可引入選擇的改變。類似地，本領域技術人員熟知使用利用特定引物的聚合酶鏈反應制備DNA構建體的程序(見，PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, Calif. ,USA) 另外，本發明嵌合因子VII多肽可通過將獨特限制性位點引入編碼不同多肽的核苷酸序列中來制備，其可用于分離編碼不同多肽的完整結構域的核苷酸序列的片段。隨后，可重組這些不同的核苷酸序列以產生不同的本發明的嵌合因子VII多肽。例如，可將獨特限制性位點引入編碼不同的凝結蛋白質的核苷酸序列中，使得GLA、EGF-1、EGF-2和催化結構域可在不同的凝結蛋白質之間自由地互換。EGF-I結構域可圍繞 EGF-2 結構域自由地旋轉(Pike 等人.Proc Natl. Acad. Sci. 1999 ；96 :8925-8930)，而當鈣存在時，GLA和EGF-I結構域不可圍繞彼此自由地旋轉(Sunnerhagen等人.NatureStructural Biology 1995;2:504-509)。在此實施方案中，GLA和EGF-1結構域可來自相同的凝結蛋白質，但來自與EGF-2和催化結構域不同的蛋白質。因此，假如一個結構域的至少50%為因子VII的結構域，那么本發明嵌合因子VIIa多肽可包含來自任何凝結蛋白質的結構域。此外，本發明嵌合因子VIIa多肽可包含來自相同蛋白質或來自不同蛋白質的GLA和EGF-I結構域。編碼本發明嵌合因子VII多肽的核酸構建體可適合地為基因組或cDNA來源的構建體，其例如通過制備基因組或cDNA文庫和篩選編碼不同多肽的全部或部分的DNA序列來獲得，所述篩選按照標準技術通過利用合成寡核苷酸探針的雜交來進行(見，Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第二版.ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989)。編碼嵌合因子VII多肽的核酸構建體還可通過已建立的標準方法合成制備，所述標準方法為例如 Beaucage 和 Caruthers，Tetrahedron Letters 22 (1981)，1859-1869 中描述的亞磷酰胺(phosphoamidite)方法，或 Matthes 等人，EMBO Journal 3 (1984)，801-805中描述的方法。根據亞磷酰胺方法，將寡核苷酸例如在自動DNA合成儀中合成、純化、退火、連接并克隆入合適的載體中。此外，核酸構建體可為合成和基因組混合來源的、合成和cDNA混合來源的或基因組和cDNA混合來源的構建體，其依照標準技術，通過連接合成來源、基因組來源或cDNA來源(根據合適的情況)的片段，即與完整核酸構建體的各部分對應的片段來制備。用于產生本發明嵌合因子VII多肽的DNA序列將通常在因子VII的氨基末端編碼前多肽原(pre-pro polyp印tide)，以獲得合適的翻譯后加工(例如，谷氨酸殘基的Y羧化)以及從宿主細胞中分泌。前多肽原可為因子VII或另一種維生素K依賴性血漿蛋白質(例如因子IX、因子X、凝血酶原、蛋白質C或S蛋白)的前多肽原。本領域技術人員將意識到，可在嵌合因子VII多肽氨基酸序列的以下地方進行其它修飾其中那些修飾不會顯著地損害蛋白質充當促凝劑的能力。
用于表達因子VIIa變體的表達載體包含能夠引導克隆的基因或cDNA轉錄的啟動子。適用于培養的哺乳動物細胞中的啟動子包括病毒啟動子和細胞啟動子。病毒啟動子包括SV40 啟動子(Subramani 等人，Mol. Cell. Biol. 1 :854-864,1981)和 CMV啟動子(Boshart等人，Cell 41:521-530,1985)。尤其合適的病毒啟動子為來自腺病毒2的主要晚期啟動子(Kaufman 和 Sharp，Mol. Cell. Biol. 2 1304-1319，1982)。另一尤其優選的啟動子為中國倉鼠延伸因子-1-α (CHEFl)啟動子。細胞啟動予包括鼠κ基因啟動子(Bergman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :7041_7045，1983)和鼠 Vh啟動子(Loh等人，Cell 33:85-93，1983)。尤其合適的細胞啟動子為鼠金屬硫蛋白-I啟動子O^almiter等人，Science 222 809-814，1983)。表達載體還可包含一組位于啟動子下游和用于嵌合因子VII序列本身的插入位點上游的RNA剪接位點。合適的RNA剪接位點可從腺病毒和/或免疫球蛋白基因中獲取。包含于表達載體中的還有位于插入位點下游的多腺苷酸化信號。尤其合適的多腺苷酸化信號包括來自SV40的早期或晚期多腺苷酸化信號(Kaufman和Smrp)、來自腺病毒5的Elb區的多腺苷酸化信號、人生長激素基因終止子(DeNoto等人Nucl. Acids Res. 9 3719-3730,1981)或來自人因子VII基因或牛因子VII基因的多腺苷酸化信號。表達載體還可包含位于啟動子和RNA剪接位點之間的非編碼病毒前導序列，例如腺病毒2三聯前導序列；以及增強子序列，例如SV40增強子。通過例如磷酸鈣介導的轉染(Wigler等人，Cell 14 =725-732,1978 ；Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7 :603-616,1981 ;Graham禾口Van der Eb,Virology 52d 456-467,1973)或電穿孔(Neumann 等人，EMBO J. 1 =841-845,1982)將克隆的 DNA序列引入培養的哺乳動物細胞內。為鑒定和選擇表達外源DNA的細胞，通常將賦予選擇性表型(選擇性標記)的基因與目標基因或cDNA—起引入細胞內。合適的選擇性標記包括賦予藥物抗性的基因，所述藥物為例如新霉素、潮霉素和甲氨蝶呤。選擇性標記可為可擴增的選擇性標記。合適的可擴增的選擇性標記為二氫葉酸還原酶(DHFR)序列。另一合適的選擇性標記為組氨酉享。Thilly (Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，Mass.，通過引用結合到本文中)對選擇性標記進行了綜述。本領域技術人員能夠容易地挑選合適的選擇性標記。可將選擇性標記在單獨的質粒上與目標基因同時引入細胞內，或它們可在相同的質粒上引入細胞內。如果在相同的質粒上，選擇性標記和目標基因可處于不同啟動子或相同啟動子的控制下，后者的安排產生雙順反子信息。這種類型的構建體在本領域已知(例如，Levinson和Simonsen的美國專利第4，713，339號)。將稱為“載體DNA”的其它DNA加入到引入細胞的混合物中也可為有利的。在細胞攝取DNA后，使細胞在合適的生長培養基中生長通常1-2天以開始表達目標基因。用于培養細胞的培養基可為任何適合生長宿主細胞的常規培養基，例如包含合適補充物的最小或復合培養基。合適的培養基可從商業供應商獲得或可根據公布的配方制備(例如，在美國典型培養物保藏所的目錄中)。培養基利用本領域已知的程序制備(見，例如，關于細菌和酵母的文獻；Bennett，J. W.和 LaSure，L.，編者，More Gene Manipulationsin FunRi (真菌中更多的基因操作)，Academic I^ress，CA，1991)。生長培養基通常包含碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖類、維生素、鹽、磷脂、蛋白質和生長因子。為產生Y羧化的嵌合因子VII多肽，培養基將含有維生素K，其濃度優選為約0. lng/ml至約20 μ g/ml。然后施加藥物選擇以針對細胞生長進行選擇，所述細胞以穩定方式表達選擇性標記。對于已用可擴增的選擇性標記轉染的細胞，可增加藥品濃度以針對克隆序列的拷貝數增加進行選擇，從而增加表達水平。然后篩選表達所需嵌合因子VII多肽的穩定轉染細胞的克隆。合適的哺乳動物細胞系包括CHO(ATCC CCL 61)、C0S-1 (ATCC CRL 1650)、幼倉鼠腎(BHK) CRL 1573 ；Graham 等人，J. Gen. Virol. 36 :59-72,1977)細胞系。合適的 BHK 細胞系為 tk-ts13 BHK 細胞系(Waechter 和 Baserga，Proc. Natl. Acad. ki. USA 79:1106-1110，1982)，下文將其稱為BHK 570細胞。BHK 570細胞系可從美國典型培養物保藏所，12301 Parklawn Dr. ,Manassas，Va. 20852 獲得，其 ATCC登記號為 CRL 10314。tk-tsl3BHK細胞系還可從ATCC以登記號CRL1632獲得。另外，可使用許多其它細胞系，包括Rat HepI (大鼠肝癌；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1)禾口 DUKX 細胞(Urlaub 和 Chasin，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220,1980)。本發明嵌合因子VII多肽可經綴合以延長多肽的體內半衰期。這種綴合可降低腎清除率并增加存在于體內的因子VII的量，同時降低嵌合因子VII多肽的給予頻率。制備綴合的因子VII多肽的合適綴合物和方法在美國專利第7，442，524號中描述，該專利通過引用以其整體結合到本文中。轉基因動物轉基因動物技術可用于產生本發明嵌合因子VII多肽。優選在雌性哺乳動物宿主的乳腺內產生蛋白質。乳腺中的表達和目標蛋白質隨后分泌到乳汁中克服了在分離來自其它來源的蛋白質中遇到的許多困難。乳汁容易收集、可大量地獲得并在生物化學上良好地表征。此外，主要的乳蛋白質以高濃度(通常約l_15g/l)存在于乳汁中。本發明嵌合因子VII多肽還可產生于宿主動物的尿中，這比產生于乳汁中更為有利，因為雄性和雌性動物兩者都會產生尿，并且對于分離目的，尿中的蛋白質少于乳汁中的蛋白質。從商業觀點來看，當考慮使用乳汁作為本發明嵌合因子VII多肽的來源時，清楚的是，優選使用具有大的乳產量的物種作為宿主。盡管可使用較小的動物例如小鼠和大鼠(并且優選在證實原理階段)，但優選使用家畜哺乳動物，包括但不限于豬、山羊、綿羊和牛。由于這類因子在此物種中的轉基因既往史、乳產量、成本和用于收集綿羊乳汁的設備的隨時可用性，綿羊尤其合適(見，例如，PCT公布號WO 88/00239關于影響宿主物種的選擇的因素的對比)。通常理想的是，選擇已培育用于乳制品用途的宿主動物品種例如festFriesland棉羊，或通過在日后培育轉基因系來引入奶畜。在任何情況下，都應使用健康狀況良好的已知動物。為獲得在乳腺中的表達，使用來自乳蛋白質基因的轉錄啟動子。乳蛋白質基因包括編碼酪蛋白(見美國專利第5，304，489號)、β -乳球蛋白、a-乳清蛋白和乳清酸性蛋白的那些基因。乳球蛋白(BLG)啟動子是合適的。在綿羊乳球蛋白基因的情況中，通常使用基因的至少5'側翼序列近端406bp的區域，但較大部分的5'側翼序列(高達約51Λρ)是合適的，例如包含β-乳球蛋白基因5'側翼啟動子和非編碼部分的約4.251ΛρDNA區段(見Whitelaw等人，Biochem. J. 286 :31-39 (1992))。來自其它物種的類似的啟動子DNA片段也是合適的。為獲得在尿中的表達，使用尿路上皮特異性啟動子。例如，可使用驅動尿空斑蛋白(uroplakin)相關基因的表達的啟動子(見，例如美國專利第6，001，646號，該專利通過引用以其整體結合到本文中)。β-乳球蛋白基因的其它區域也可納入構建體中，待表達的基因的基因組區域亦可如此。本領域通常認可的是，缺少內含子的構建體，例如與包含這類DNA序列的那些構建體相比表達差(見 Brinster 等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 85:836-840(1988)；Palmiter 等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 88 :478-482(1991) ；Whitelaw 等人，TransgenicRes. 1 :3-13(1991) ；PCT 公布號 WO 89/01343 ；以及 PCT 公布號 WO 91/02318，每一個均通過引用結合到本文中)。在這點上，通常優選(當可能時)使用包含編碼目標蛋白質或多肽的基因的全部或一些天然內含子的基因組序列，因此優選進一步包含來自例如β -乳球蛋白基因的至少一些內含子。一種這類區域為來自綿羊乳球蛋白基因的3'非編碼區的提供內含子剪接和RNA多腺苷酸化的DNA區段。當取代基因的天然3'非編碼序列時，該綿羊乳球蛋白區段可既增強又穩定目標蛋白質或多肽的表達水平。在其它實施方案中，使用來自乳特異性蛋白質基因的相應序列置換嵌合因子VII序列的啟動ATG周圍的區域。這種置換提供假定的組織特異性啟動環境以增強表達。使用例如BLG基因的那些置換整個嵌合因子VII前原序列(pre-pro sequence)和5'非編碼序列是方便的，但可置換較小的區域。對于轉基因動物中嵌合FVIIa多肽的表達，將編碼嵌合因子VIIa的DNA區段與其表達所需的其它DNA區段可操作地連接，以產生表達單元。這類其它區段包括上述啟動子和提供轉錄終止和mRNA的多腺苷酸化的序列。表達單元還可包含編碼分泌信號序列的DNA區段，其與編碼嵌合因子VIIa的區段可操作地連接。分泌信號序列可為天然因子VII分泌信號序列，或可為另一蛋白質例如乳蛋白質的分泌信號序列(見，例如，von Heijne, Nucl.Acids Res. 14:4683-4690(1986)；和Meade等人的美國專利第4，873，316號，其通過引用結合到本文中)。通過將嵌合因子VII序列插入包含其它DNA區段的質粒或噬菌體載體中，來適宜地進行用于轉基因動物的表達單元的構建，但表達單元可通過基本上任何連接序列來構建。尤其適宜的是提供包含編碼乳蛋白質的DNA區段的載體，以及用嵌合因子VII多肽的編碼序列代替乳蛋白質的編碼序列；從而產生包含乳蛋白質基因的表達調控序列的基因融合物。在任何情況下，表達單元在質粒或其它載體中的克隆都促進嵌合因子VII序列的擴增。擴增適宜在細菌(例如，大腸桿菌)宿主細胞中進行，因此，載體通常包含在細菌宿主細胞內有功能的復制起點和選擇性標記。然后將表達單元引入選定宿主物種的受精卵(包括早期胚胎)中。異源DNA的引入可通過幾種途徑之一來完成，包括微注射(例如，美國專利第 4，873，191 號)、反轉錄病毒感染(Jaenisch, Science 240 :1468-1474(1988))或利用胚胎干(ES)細胞的位點定向整合(由Bradley等人在Bio/Technology 10 534-539(1992)中綜述)。然后將卵植入假孕雌性的輸卵管或子宮內并使其發育至足月。在其種系中攜帶引入的DNA的后代可將DNA以正常的孟德爾方式傳遞到其子代，使轉基因群發展。本領域已知產生轉基因動物的一般程序(見，例如，Hogan等人，Manipulatingthe Mouse Embryo :A Laboratory Manual (操作小鼠胚胎實驗室手冊)，Cold SpringHarbor Laboratory,1986 ；Simons 等人，Bio/Technology 6:179-183(1988) ；Wall 等人，Biol. R印rod. 32 :645-651(1985) ；Buhler 等人，Bio/Technology 8 :140-143(1990)；Ebert ^A, Bio/Technology 9 :835-838(1991) ；Krimpenfort ^A, Bio/Technology 9 844-847(1991) ；Wall 等人，J. Cell. Biochem. 49 :113-120(1992)；美國專利第 4，873，191號；美國專利第4，873，316號；PCT公布號WO 88/00239 ;PCT公布號WO 90/05188 ;PCT公布號WO 92/11757 ；以及英國公布號GB 87/00458)。用于將外來DNA序列引入哺乳動物及其生殖細胞中的技術最初在小鼠中開發(見，例如，Gordon等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 77 :7380-7384(1980) ；Gordon 和 Ruddle，Science 214:1244-1246(1981) ；Palmiter和 Brinster，Cell 41 :343-345(1985) ；Brinster 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 4438-4442(1985)；和Hogan等人)。隨后調整這些技術以用于較大的動物，包括家畜物種(見,例如,PCT 公布號 WO 88/00239,WO 90/05188 和 WO 92/11757 ；以及 Simons 等人，Bio/Technology 6 :179-183 (1988))。總之，到目前為止用于產生轉基因小鼠或家畜的最高效途徑中，按照已建立的技術將數百個目標DNA線性分子注射入受精卵的原核之一中。還可采用將DNA注射入合子的胞質中。還可采用在轉基因植物中的產生。表達可普遍化或定向到特定器官例如塊莖中(見，Hiatt, Nature 344 :469-479(1990) ；Edelbaum 等人，J. Interferon Res. 12 449-453(1992) ；Si jmons 等人，Bio/technology 8:217-221(1990)；以及 EP 0 255 378)。本發明嵌合因子VII多肽的產生還可通過體外翻譯來獲得，例如通過兔網織紅細胞裂解物、麥胚抽提物以及大腸桿菌無細胞系統。體外翻譯還可連接或偶聯。連接的體外翻譯基于用噬菌體聚合酶的轉錄后接兔網織紅細胞裂解物或麥胚裂解物系統中的翻譯。偶聯的體外翻譯基于大腸桿菌無細胞系統。回收和和激活從細胞培養基或乳汁中回收本發明嵌合因子VII多肽。本發明嵌合因子VII多肽可通過多種本領域已知的程序來純化，所述程序包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳程序(例如，制備型等電聚焦(IEF))、溶解度差異(例如，硫酸銨沉淀)、或提取(見，例如，Protein Purification(蛋白質純化)，J_C. Janson和Lars Ryden，編者，VCH Publishers,New York，1989)。其它純化可通過常規化學純化方法例如高效液相層析來進行。其它純化方法(包括檸檬酸鋇沉淀)為本領域已知，并可用于純化本文描述的新的嵌合因子VII多肽(見，例如，Scopes，R.，Protein Purif ication (蛋白質純化)，Springer-Verlag, N. Y.，1982)。對于治療目的，優選本發明嵌合因子VII多肽基本上是純的。因此，在本發明的一個實施方案中，將本發明因子VII變體純化到至少約90-95%的純度，優選純化到至少約98%的純度。純度可通過例如凝膠電泳、氨基末端氨基酸測序和反相HPLC來評價。嵌合因子VII多肽在其激活位點被切割以轉化為其雙鏈形式。激活可按照本領域已知的程序進行，例如以下公開的程序=Osterud等人，Biochemistry 11 2853-2857(1972) ； Thomas,美國專利第 4, 456, 591 號；Hedner 和 Kisiel, J.Clin·Invest.71 :1836-1841 (1983)；或 Kisiel 禾口 Fujikawa， Behring Inst. Mitt.73 29-42 (1983) 0或者，嵌合因子VII多肽可通過濃縮嵌合因子VII多肽并接觸帶正電的表面或樹脂來激活，例如，如 Bjoern 等人(Research Disclosure, 269 1986 年 9 月，第 564-565頁)所描述，因子VII可通過使其穿過離子交換層析柱例如Mono Q⑧(Pharmacia fineChemicals)等來激活。嵌合因子VII多肽還可在溶液中如下被激活通過獲得包含基本上純化的嵌合因子VII多肽的制備物的溶液；向溶液中加入胺化合物、Ca2+至終濃度約5mM至約50mM(例如約IOmM至約30mM)，并將溶液的最終pH調至約7. 2-8. 6 (例如約7. 6至約8. 2)；在約2°C至約25°C之間將所得激活混合物溫育一段時間，該時間足以使至少90%的嵌合FVII多肽轉化為嵌合FVIIa多肽；以及任選地，從激活混合物中分離FVIIa。然后可將所得激活的嵌合因子VII多肽按下面的描述進行配制和給予。基因療法本發明嵌合因子VII多肽還可用在通過基因療法治療出血障礙的方法中。在本發明的該實施方案中，本發明嵌合因子VII多肽由核酸分子編碼，所述核酸分子可通過離體轉移或通過體內轉移引入到受試者細胞內。本領域可用的基因療法的任何方法可按照本發明使用。下面描述示例性方法。對于基因療法的方法的一般綜述，見Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 1993，12 :488-505 ；Wu 禾口 Wu，Biotherapy 1991,3 :87-95 ；Tolstoshev, Ann. Rev.Pharmacol.Toxicol. 1993,32 :573-596 ；Mulligan, Science 1993,260 :926-932 ；以及 Morgan 和Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993,62 :191-217 ；May, TIBTECH 1993，11 :155_215。可使用的重組DNA技術領域公知的方法描述于Ausubel等人，(編輯)，1993, Current Protocolsin Molecular Biology (現代分子牛物學方案)，Tohn Wiley & Sons, NY ;Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual (基因轉移禾口表達實驗室手冊)，，Stockton Press，NY ；以及第 12和 13章，Dracopoli 等人，(編輯)，1994, Current Protocolsin Human Genetics (現代人類遺傳學方案),John Wiley & Sons，NY ;Colosimo 等人，Biotechniques 2000 ；29 (2) :314_8，320-2，324。編碼嵌合因子VII多肽的多核苷酸可插入合適的克隆載體中。適用于基因療法的載體包括病毒例如腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、痘苗、皰疹病毒、桿狀病毒和反轉錄病毒、細小病毒、慢病毒、噬菌體、粘粒、質粒、真菌載體和其它本領域常用的重組載體，其已被描述用于在多種真核和原核宿主中表達，并可用于基因療法和用于簡單的蛋白質表達。在一個實施方案中，載體為病毒載體。病毒載體特別是腺病毒載體可與陽離子親水脂分子復合，所述陽離子親水脂分子例如陽離子脂質、聚L-賴氨酸(PLL)和二乙基氨基乙基葡聚糖(DEAE-葡聚糖)，其為目標細胞的病毒感染提供提高的效率(見，例如，1997年11月20日提交的PCT公布號PCT/US97/21496，通過引用結合到本文中)。適合用于本發明的病毒載體包括從痘苗、皰疹病毒、AAV和反轉錄病毒獲得的載體。關于基因療法中病毒載體的綜述，見 Mah 等人，Clin. Pharmacokinet. 2002 ;41 (12) :901-11 ；Scott 等人，Neuromuscul. Disord. 2002 ； 12 Suppl 1 :S23_9。在一個實施方案中，使用這樣的載體，其中在基因組中的所需位點處促進同源重組的區域側接編碼序列和任何其它所需序列，從而提供自已整合到基因組中的核酸分子表達構建體(Koller 和 Smithies，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989,86 :8932-8935 ；Zijlstra等人，Nature 1989,342 :435-438 ；Zarling 等人的美國專利第 6，M4, 113 號；以及 Pati 等人的美國專利第6，200, 812號，每一個均通過引用以其整體結合到本文中)。載體可直接或間接遞送入患者中，在直接遞送的情況中，患者直接暴露于載體或遞送復合體；在間接遞送的情況中，首先在體外用載體轉化細胞，然后將細胞移植入患者中。這兩種方法分別稱為體內和離體基因療法。
在一個實施方案中，直接體內給予載體，在體內，其進入受試者的細胞并介導基因的表達。這可通過本領域已知的和上述的多種方法的任一種完成，例如通過將其作為合適的表達載體的部分構建并給予，使其變成在細胞內，例如通過利用缺陷型或減毒的反轉錄病毒或其它病毒載體進行感染(見，美國專利第4，980，286號)，或通過直接注射裸DNA，或通過使用微粒轟擊(例如，基因搶；生物射彈(Biolistic)，Dupont)；或用脂質或細胞表面受體或轉染劑包被、包裹于生物聚合物(例如，聚β-Ι-64-N-乙酰氨基葡萄糖多糖；見美國專利第5，635，493號)中、包裹于脂質體、微粒或微膠囊中；通過將其呈與已知進入核的肽或其它配體連接給予；或通過將其呈與經受受體介導的胞吞的配體連接給予(見，例如，mi和mi，J. Biol. Chem. 1987,62 =4429-4432)等。在另一個實施方案中，可形成核酸-配體復合體，其中配體包含融合病毒肽以破壞內體，使核酸避免溶酶體的降解，或包含例如從觸角足(antermapedia)獲得的陽離子12-聚體肽，其可用于將治療性DNA轉移入細胞中((Mi等人，Mol. Therapy 2000，2 :339-47)。在又一個實施方案中，可通過靶定特定受體，在體內靶定核酸用于細胞特異性攝取和表達(見，例如，PCT公布號WO 92/06180、WO 92/22635、WO 92/20316和WO 93/14188)。另外，稱為磁轉染(magnetofection)的技術可用來將載體遞送至哺乳動物。該技術將載體與超順磁納米顆粒結合用于在磁場影響下的遞送。該應用減少了遞送時間并提高了載體的功效(Scherer等人，Gene Therapy 2002 ；9 102-9)。在一個實施方案中，核酸可利用脂質載體進行給予。脂質載體可與裸核酸(例如，質粒DNA)結合以促進穿過細胞膜。陽離子、陰離子或中性脂質可用于該目的。但是，陽離子脂質因為其顯示出與通常具有負電荷的DNA較好地結合而是合適的。陽離子脂質也顯示出介導質粒DNA的細胞內遞送(Feigner和Ringold, Nature 1989 ；337 :387)。據顯示，將陽離子脂質-質粒復合體靜脈注射入小鼠中導致DNA在肺中表達(Brigham等人，Am. J. Med. Sci. 1989 ；298 :278)。亦參見 Osaka 等人，J. Pharm. Sci. 1996 ；85 (6) :612-618 ；San等人，Human Gene Therapy 1993 ；4 :781-788 ；Senior等人,Biochemica et BiophysicaActa 1991 ；1070 :173-179) ；Kabanov 禾口 Kabanov，Bioconjugate Chem. 1995 ；6 :7-20 ；Liu等人，Pharmaceut. Res. 1996 ；13 ；Remy 等人，Bioconjugate Chem. 1994 ；5 :647-654 ；Behr,J-P. ， Bioconjugate Chem 1994 ；5 :382-389 ；Wyman 等)κ, Biochem. 1997 ；36 :3008-3017 ；Marshall等人的美國專利第5，939，401號；Scheule等人的美國專利第6，331，5 號。代表性的陽離子脂質包括在例如美國專利第5，283, 185號和例如美國專利第5，767，099號中公開的那些陽離子脂質，這些公開內容通過引用結合到本文中。在一個實施方案中，陽離子脂質為美國專利第5，767，099號中公開的N4-精胺膽甾醇基氨基甲酸酯(GL-67)。其它合適的脂質包括N4-亞精胺膽留醇基氨基甲酸酯(GL-5;3)和1_(N4-精胺)_2，3-雙十二烷基甘油氨基甲酸酯(GL-89)。對于病毒載體的體內給予，可與病毒載體例如腺病毒載體聯合采用合適的免疫抑制治療，以避免病毒載體和轉染細胞的免疫失活。可給予例如免疫抑制細胞因子例如白細胞介素-12(IL-12)、干擾素-γ (IFN-. Y .)或抗CD4抗體，以阻斷對病毒載體的體液或細胞免疫應答。在那一點上，采用以下病毒載體是有利的，所述病毒載體經改造以表達最少數量的抗原。可利用任何上述方法離體用編碼本發明嵌合因子VII多肽的構建體改造體細胞，并重新植入個體中。這種方法一般在klden等人的PCT公布號WO 93/09222中描述。另外，Payumo 等人在 Clin. Orthopaed. and Related Res. 2002 ；403S :S228_S242 中描述的基于細胞遞送的專有ImPACT技術中使用了這種技術。在這種基因療法系統中，將體細胞(例如，成纖維細胞、肝細胞或內皮細胞)從患者中移出、在體外培養、用治療目標基因轉染、表征并重新引入患者中。可使用初級細胞(從個體或組織獲得，并在傳代前經過改造)和次級細胞(在引入體內前在體外傳代)以及本領域已知的永生化細胞。可用于本發明方法的體細胞包括但不限于體細胞例如成纖維細胞、角質形成細胞、上皮細胞、內皮細胞、肝細胞、血液的構成組分、肌肉細胞、可培養的其它體細胞和體細胞前體。在一個實施方案中，細胞為肝細胞。使用構建體轉染將產生編碼產物的初級或次級細胞，所述構建體包含編碼本發明嵌合FVIIa多肽的多核苷酸和任選編碼選擇性標記的核酸以及在受體初級或次級細胞中表達嵌合FVIIa所需要的其它序列。包括但不限于感染性載體，例如反轉錄病毒、皰疹、腺病毒、腺伴隨病毒、腮腺炎和脊髓灰質炎病毒載體的這類構建體可用于此目的。透皮遞送尤其適合用于使用表皮的細胞類型的直接轉移，所述細胞類型包括角質形成細胞、黑素細胞和樹突細胞(Pfutzner等人，Expert Opin. Investig. Drugs 2000 ；9 2069-83)。在一個實施方案中，用于基因療法的載體為單鏈自我互補的腺伴隨病毒。另外，該自我互補的腺伴隨病毒可包含小的運甲狀腺素蛋白(transhyretin)啟動子-增強子、來自小鼠細小病毒的內含子和來自牛生長激素的多腺苷酸化信號。載體還可包含Margaritis等人描述的RKRRKR序列，其導致因子VII以活性形式即因子VIIa分泌(Margaritis等人，J.Clin. Invest.，2004；113 :1025-31)。給予和藥物組合物本發明嵌合因子VII多肽可用于控制出血障礙，其具有數種起因，例如凝血因子缺乏(例如血友病A和B或者凝血因子XI或VII的缺乏)或凝血因子抑制劑；或它們可用于控制受試者中發生的過度出血，所述受試者具有正常發揮作用的凝血級聯(無凝血因子缺乏或針對任何凝血因子的抑制劑)。出血可由血小板功能缺陷、血小板減少或馮維勒布蘭德病導致。它們還可在由不同刺激物引起纖溶活性增加的受試者中看到。在經歷了與手術或創傷有關的大量組織損傷的受試者中，止血機制可被立即止血的需求壓倒，并且盡管具有正常的止血機制，但他們可能形成出血。當出血發生諸如腦、內耳區域和眼等器官時，獲得滿意的止血也是問題；在彌漫性出血(出血性胃炎和血崩)的情況下當難以鑒定來源時獲得滿意的止血也可以是問題。相同的問題可在對不同的器官(肝、肺、腫瘤組織、胃腸道)進行活組織檢查的過程中和在腹腔鏡手術中出現。對這些情況相同的是難以通過手術技術(縫線、夾緊等)提供止血。急性和大出血還可發生在進行抗凝療法的受試者中，在所述受試者中，缺陷性止血由給予的療法引起。這種受試者在不得不快速抵消抗凝效果情形中可能需要手術介入。不滿意止血的情況中可導致問題的另一情形是給予具有正常止血機制的受試者抗凝療法以防止血栓栓塞性疾病。這類療法可包括肝素、其它形式的蛋白聚糖、華法林或其它形式的維生素K拮抗劑以及阿司匹林和其它血小板聚集抑制劑。對于與有意介入相關的治療，通常在進行介入前約M小時內給予本發明嵌合因子VII多肽，并在之后持續多至7天以上。可通過如本文所述的多種途徑作為促凝劑給予。
對于70kg的受試者，嵌合因子VII多肽的劑量范圍為從約0. 05mg/天至約500mg/天，優選從約Img/天至約200mg/天，以及更優選從約IOmg/天至約175mg/天作為負荷劑量和維持劑量，這根據受試者的重量和情況的嚴重性而定。對于給定的受試者和給定的情況，本領域技術人員將能夠確定最佳劑量。藥物組合物主要意圖用于腸胃外給予，用于預防和/或治療性治療。優選地，藥物組合物在腸胃外給予，即靜脈內、皮下或肌內，或可通過連續或脈動輸注給予。或者，可配制藥物組合物用于以不同方式給予，包括但不限于經口、皮下、靜脈內、腦內、鼻內、透皮、腹膜內、肌內、肺內、陰道、直腸、眼內或任何其它可接受的方式。用于腸胃外給予的組合物包含與藥學上可接受的載體、優選含水載體組合(優選溶于)的本發明嵌合因子VII多肽。可使用許多含水載體，例如水、緩沖水、0.4%鹽水、0. 3%甘氨酸等。本發明嵌合因子VII多肽還可與延長穩定性和儲存期的組分例如甲硫氨酸和蔗糖一起配制。本發明嵌合因子VII多肽還可制成脂質體制備物用于遞送或靶向到損傷部位。脂質體制備物通常描述于例如美國專利第4，837，028,4, 501，728和4，975，282號中。組合物可通過常規、熟知的滅菌技術滅菌。可將所得水溶液包裝備用或在無菌條件下過濾并凍干，凍干的制備物在給予前與無菌水溶液混合。組合物可包含接近生理條件需要的藥學上可接受的輔助物質，例如PH調節劑和緩沖劑、張力調節劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。組合物還可包含防腐劑、等張劑(isotonifier)、非離子表面活性劑或去污劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。這些制劑中嵌合因子VII多肽的濃度可在大范圍內變化，即，從小于約0.5%重量(通常為或至少約1 %重量)至高達15%或20%重量，并且將主要按照選定的特定給予模式根據流體體積、粘度等進行選擇。因此，通常用于靜脈內輸注的藥物組合物可接近包含250ml無菌林格氏溶液和IOmg嵌合因子VII多肽。用于制備可腸胃外給予的組合物的實際方法是已知的或對本領域技術人員來說是顯而易見的，更多細節參見例如Remimrton' sPharmaceutical Sciences,M 18 片反，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1990)中。可給予包含本發明嵌合因子VII多肽的組合物用于預防和/或治療性治療。在治療應用中，將組合物以足以治愈、減輕或部分阻止疾病及其并發癥的量給予已患如上所述的疾病的受試者。足以實現此目的的量被定義為“治療有效量”。如本領域技術人員將理解的，對于此目的有效的量將依賴于疾病或損傷的嚴重程度及受試者的重量和整體狀態。但是，一般來說，對于70kg的受試者，有效量的范圍為從約0. 05mg直至約500mg嵌合因子VII多肽/天，其中更常用的劑量為約1. Omg至約200mg嵌合因子VII多肽/天。必須記住的是，本發明的物質通常可用于嚴重的疾病或損傷狀況，即威脅生命或潛在地威脅生命的情況。在這類情況中，考慮到最小化外來物質和人中通常缺乏人因子VII的免疫原性，有可能且治療醫師可能覺得有需要的是，給予基本過量的這些嵌合因子VII多肽組合物。在預防應用中，將包含本發明嵌合因子VII多肽的組合物給予易感疾病狀態或損傷或者以其它方式處于疾病狀態或損傷風險中的受試者，以提高受試者自身的促凝固能力。這樣的量被定義為“預防有效量”。在預防應用中，精確的量再次依賴于受試者的健康狀況和重量，但是劑量的范圍對于70千克的受試者通常為約0. 05mg至約500mg/日，更通常地對于70千克的受試者為約1. Omg至約200mg/天。
可用治療醫師選定的劑量水平和模式進行組合物的單次或多次給予。對于需要每日維持水平的能走動的受試者，嵌合因子VII多肽可利用例如便攜式泵系統通過連續輸注進行給予。本發明嵌合因子VII多肽還可制成持續或延長釋放的制劑。配制持續或延長釋放的組合物的方法為本領域已知的，包括但不限于包含多肽的固體疏水顆粒的半滲透基質。本發明嵌合因子VIIa多肽的局部遞送，例如局部施用，可例如通過噴霧、灌注、雙氣囊導管、支架、納入血管移植物或支架中、用于包被氣囊導管的水凝膠或其它良好建立的方法進行。在任何情況下，藥物組合物應提供足以有效地治療受試者的量的因子VII變體。包括以下實施例以闡述本發明。根據本發明的共同發明人發現或預期在實施本發明中運行良好的技術和程序術語來描述以下實施例的某些方面。鑒于本公開內容和本領域技術的一般水平，技術人員將意識到，以下實施例僅旨在示例性，并且在不背離本發明范圍的情況下，可采用眾多改變、修改和變化。
實施例實施例I-嵌合因子VIIa多肽的構建和表達獲取人因子VII和人因子IX兩者的cDNA并引入以下獨特限制性位點以促進結構域交換BstEII位點，其位于EGF-I結構域的5，末端處(因子VII的殘基47_49 ；因子IX的殘基48-50)；Mel位點，其位于EGF-I和EGF-2結構域的連接處(因子VII的殘基82-83 ；因子IX的殘基83-84)；NotI位點，其位于EGF-2結構域的3’末端處(因子VII的殘基135-137 ；因子IX的殘基132-134)。利用這些限制性位點構建不同的嵌合體以在因子VII和因子IX之間交換結構域，不同的嵌合體描繪于圖1中。可使用相同或類似的限制性位點以在因子VII和S蛋白之間交換結構域。所得嵌合體的氨基酸序列在SEQ ID NO :1 (因子IX信號、前肽、GLA和EGFl結構域以及因子VII EGF2和催化結構域)和SEQ ID NO :2 (因子IX信號和前肽結構域、S蛋白GLA結構域、因子IX EGFl結構域以及因子VII EGF2和催化結構域)中給出。將選擇的這些重組DNA亞克隆入表達載體pCMV5中用于轉染哺乳動物細胞。然后將所得重組構建體與pSV2ne0和pCMVhGC —起共轉染到293人腎細胞系(ATCC CRL 1573)中。如前所述選擇和篩選高水平表達每一構建體的克隆(Toomey等人，1991，J.Biol. Chem.，266 19198-19202)。將每一篩選出的克隆放大至900cm2滾瓶用于大規模生產，并通過假親和層析方法利用i^ast Flow Q-kpharose和先為鈣梯度后為NaCl梯度的洗脫純化重組蛋白質。實施例II-因子VIIa多肽的凝血酶生成利用血友病體外模型確定因子VIIa的凝血酶生成。使用單核細胞作為組織因子來源并將其與未激活的血小板和合成血漿結合，所述合成血漿包含血漿濃度的因子V、VII、IX、VIII和XI及血漿濃度的抗凝血酶和TFPI。通過缺省因子VIII和IX產生血友病病況。
通過從健康個體中抽取細1血液并置于檸檬酸鈉管中制備單核細胞。小心地將血液鋪在15ml錐形管中的3ml Accu-Pmp 淋巴細胞分離培養基(Accurate Chemicals,NY,USA)頂部，并以1500rpm離心30分鐘。然后將單核細胞層移出并在4°C下加入等體積的Versene (Lineberger組織培養物)中，以800rpm離心10分鐘。將所得沉淀在4°C下重懸于5ml的Versene中并在800rpm下離心10分鐘。將所得沉淀重懸于的巨噬細胞SFM培養基(Life Technologies,CA,USA)中，補充 500ng/ml 的脂多糖(LPS) (Sigma-Aldrich,MO,USA)并將細胞以200 μ 1/孔鋪板到96孔板中。將該板在37°C、5% CO2下溫育2小時，然后用巨噬細胞SFM培養基沖洗3次，接著溫育過夜。通過從健康個體中抽取細1血液并置于檸檬酸鈉管中制備血小板。小心地將血液鋪在15ml錐形管中的5ml的Accu-Pi^p 淋巴細胞分離培養基(Accurate Chemicals,NY,USA)頂部，并以1500rpm離心30分鐘。然后將血小板層移出并加入等體積的含10 μ g/ml前列腺素El (PGEl) (Sigma-Aldrich, MO, USA)的檸檬酸鹽-葡萄糖-鹽水中，并以800rpm離心10分鐘。棄除所得沉淀并通過瓊脂糖凝膠過濾在補充有lmg/ml卵清蛋白的無鈣的Tyrodes緩沖液中從血漿蛋白質中分離血小板。將回收的血小板于37°C下儲存。通過利用5 μ g/ml濃度的因子XI C_l_酯酶抑制劑并在與前面制備的單核細胞溫育1小時后添加200 μ g/ml的抗凝血酶、0. 07 μ g/ml的TFPI、100mg/ml的凝血酶原、8 μ g/ml的因子X和0.5 μ g/ml的因子VII，來產生用于模擬血友病的體外試驗的合成血漿。過夜溫育后，以7μ g/ml的濃度加入因子V。對于正常條件，在1小時的溫育后以4μ g/ml的濃度加入因子IX，并在過夜溫育后，以lU/ml加入因子VIII。向上面的合成血漿溶液中加入260 μ 1的血小板，并將所得懸液加入單核細胞中以啟動反應。以定時的間隔移出10μ 1樣品并將其加入到90μ 1含ImM EDTA和0. 5mMGly-Pro-Arg-pNA(Centerchem Inc. ,CT,USA)的凝血酶試驗緩沖液中。加入50%的檸檬酸100 μ 1以停止合成底物切割并在405nm處測定0D。使用以下的公式確定凝血酶的濃度[凝血酶]=稀釋度X((A405-背景)/(停止-開始))/(轉化因子)其中轉化因子為InM凝血酶在405nm處產生0. 01170D/min速率時的。正常條件下(包含因子VIII和IX)的凝血酶生成顯示具有短的停滯期的峰值凝血酶產生(圖幻。增加野生型因子VIIa的濃度提高了血友病病況中凝血酶的產生(圖2)。實施例III-嵌合因子VIIa多肽的凝血酶生成利用實施例II中描述的血友病體外模型確定實施例I中產生的嵌合蛋白質的凝血酶生成。加入的IOnM的嵌合因子VIIa具有類似于50nM野生型因子VIIa的活性(圖3)，所述嵌合因子VIIa包含因子VII的EGF-2和催化結構域及因子IX的GLA和EGF-I結構域，或包含因子VII的GLA、EGF-2和催化結構域及因子IX的EGF-I結構域。著眼于相對于對照的峰值凝血酶產生，無論是野生型因子VIIa還是測試的嵌合因子VIIa多肽都不能將峰值凝血酶產生回復到對照的水平。但是，IOnM的嵌合因子VIIa使峰值凝血酶產生回復到類似于50nM野生型因子VIIa所產生的水平(圖4)，所述嵌合因子VIIa包含因子VII的EGF-2和催化結構域及因子IX的GLA和EGF-I結構域，或包含因子VII的GLA、EGF-2和催化結構域及因子IX的EGF-I結構域。實施例IV-嵌合因子VIIa多肽的凝固試驗在如Buyue，Y.，等人，2008，Blood, 112 :3234-3241所描述的凝固試驗中，體內評價嵌合因子VIIa多肽的凝血活性。簡要地說，通過將導管插入腿靜脈將因子VII給予血友病B小鼠(2mg/kg的Novc^even 、2mg/kg包含因子IX的GLA和EGF-I結構域及因子VIIa的EGF-2和催化結構域的嵌合因子Vila，或1. 4mg/kg包含S蛋白的GLA結構域、因子IX的EGF-I結構域和因子VIIa的EGF-2和催化結構域的嵌合因子Vila)。使用野生型小鼠作為對照。將小鼠麻醉，通過將小規針穿過隱靜脈將其它腿的隱靜脈截斷。然后通過將一對剪刀的尖端插入靜脈內并剪斷以產生小杯狀來切斷遠端部分。凝塊形成并記錄直到出血停止的時間。然后用30規針移除凝塊并再次記錄直到出血停止的時間。重復此過程30分鐘。將凝塊的數目記錄為中斷(disruptions)數目。將記錄的時間取平均，并記錄為平均時間。實驗對野生型小鼠中的一只小鼠進行，并且嵌合因子VIIa包含S蛋白的GLA結構域、因子IX的EGF-I結構域及因子VIIa的EGF-2和催化結構域。對于包含因子IX的GLA和EGF-I結構域及因子VIIa的EGF-2和催化結構域的嵌合因子Vila，實驗對兩只血友病B小鼠進行，結果相同。對于不給予任何因子VII的血友病B小鼠，下面的表1中記錄的0.25個中斷表明，僅四分之一帶有初始損傷的小鼠不流血不止。表 1.
血友病BNovo Seven Cl(1063)C2WT小鼠中斷0.2520291325平均時間 (秒)1712715112554用一只沒有處理的血友病B小鼠、一只給予ang/kg的Novc^even⑧的血友病B小鼠、一只給予ang/kg的嵌合因子VIIa的血友病B小鼠和一只沒有處理的野生型小鼠重復實驗，所述嵌合因子VIIa包含因子IX的GLA和EGF-I結構域及因子VIIa的EGF-2和催化結構域。給予ang/kg嵌合因子VIIa的血友病B小鼠出血停止的平均時間比給予ang/kgNovoSeven⑧的血友病B小鼠和野生型小鼠短，所述嵌合因子VIIa包含因子IX的GLA和EGF-I結構域及因子VIIa的EGF-2和催化結構域。(圖5)。實施例V-嵌合因子VIIa多肽的血栓形成性本發明嵌合因子VIIa多肽的血栓形成性可在高水平表達這些蛋白質的小鼠模型中測試。最近，已顯示表達大于2μ g/ml重組野生型小鼠因子VIIa的50%的小鼠在16個月內死于形成血栓。表達類似水平的因子VIIa的血友病B小鼠具有相同的死亡率，并且當小鼠回交到C57BL/6J小鼠品系中時，形成血栓的時間大大提早(<4個月)。(AljamaliMN 等人· J Clin Invest. 2008 ；118 :1825-1834)。可產生表達2-10 μ g或更多嵌合多肽的血友病B小鼠(品系C57BL/6J)，并且如果嵌合因子VII多肽的表達導致形成血栓，那么這些小鼠應在早期(< 4個月)形成血栓。小鼠品種可通過利用由 Dr. Paul Monahan (the Gene Therapy Center, UNC)開發的新的自我互補腺伴隨載體(AAV)來開發。(Wu Z等人Mol Ther. 2008 ； 16 :280-289)。此載體包含小的運甲狀腺素蛋白啟動子-增強子(TTR啟動子)、來自小鼠細小病毒的內含子、MVM和牛生長激素pA信號。據顯示，基于此載體，將IXlO11個載體基因組注射入門靜脈內導致7 μ g/ml的因子IX在感染8周內持續表達。(Wu Z等人Mol Ther. 2008 ； 16 :280-289)。
可使用小鼠和人因子VIIa的cDNA和本發明嵌合因子VII多肽以評價血栓形成性。還可利用Margaritis等人描述的RKRRKR(SEQ ID NO 21)序列，其引起因子VII以活性形式即因子 VIIa 分泌(Margaritis 等人，J. Clin. Invest.，2004 ；113 :1025-31)。為檢驗此假設，可產生野生型和嵌合因子VII小鼠多肽。據報道，小鼠組織因子不與人因子VII反應，所以使用小鼠多肽以證明組織因子與給予的因子VIIa在創傷中的作用無關，但與血栓形成有關。可用于檢驗此假設的小鼠多肽包括野生型小鼠因子VII (SEQID NO 3)；帶有導致多肽以雙鏈活性形式(FVIIa)分泌的RKRRKR序列的野生型小鼠因子VIKSEQ ID NO 4)；帶有因子VII的EGF2和催化結構域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信號、前肽、GLA和EGFl結構域(SEQ ID NO 5)；以及帶有因子VII的EGF2和催化結構域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信號和前肽結構域、S蛋白的GLA結構域、因子IX的EGFl結構域(SEQ ID NO 6)。嵌合小鼠因子VII多肽(SEQ ID NO :5和6)對組織因子具有減少的親和力(當與野生型FVII分子相比較時，可能低多達100倍)，并且這應足以防止不想要的血栓形成。嵌合因子VII多肽還可經其它修飾以進一步減少對組織因子的親和力。這種突變的一個實例是在殘基306處將甲硫氨酸變成丙氨酸。可包括嵌合因子VII多肽的其它修飾，其導致因子VIIa的比活更高。這類修飾的實例包括以下與人序列殘基158、296和四8的等同物V158D、E296V 和 M298Q。上述野生型和嵌合小鼠因子VII多肽可如下構建通過利用小鼠因子VII的cDNA作為模板并利用寡核苷酸引物擴增不同的結構域，然后將構建體插入pSC-TTR-mvm載體中，該載體的構建描述于等人，Molecular Therapy, 2008 ；16 :280-289中。具體而言，野生型小鼠因子VII可利用以下引物自小鼠因子VII cDNA擴增5，-TGAGGATCCCCACCATGGTTCCACAGGCGCATGGGCT-3’ (SEQ ID NO 7)和 5，-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3，(SEQ ID NO :8)。接著可用BamHI/SphI消化擴增的片段并將其插入pSC-TTR-mvm載體的Bglll/SphI位點之間。隨后，可將BGH多腺苷酸化序列插入所得載體的SphI位點處。可以以類似的方式構建帶有RKRRKR序列的野生型小鼠因子VII構建體。具體而言，帶有RKRRKR序列的野生型小鼠因子VII可利用以下引物自小鼠因子VII的cDNA擴增5，-TGAGGATCCCCACCATGGTTCCACAGGCGCATGGGCT-3，(SEQ ID NO 7)和 5，-ACAATGCGTTTTCGCCGCTTACGGCGGCCTTGGCGGCTGCTGGAGT-3' (SEQ ID NO 9)(產生第一片段)；以及5‘-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3‘(SEQ ID NO 8)和 5，_GCCGCCGTAAGCGGCGAAAACGCATTGTGGGAGGCAACGTGTGCCC-3，(SEQ ID NO 10)(產生第二片段)。然后利用這兩種片段作為模板以及以下引物進行重疊PCR 5‘-TGAGGATCCCCACCATGGTTCCACAGGCGCATGGGCT-3‘(SEQ ID NO 7)和 5，_TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3，(SEQ ID NO :8)。接著可用 BamHI/SphI 消化所得的擴增片段并將其插入pSC-TTR-mvm載體的Bglll/SphI位點之間。隨后，可將BGH多腺苷酸化序列插入所得載體的SphI位點處。類似地構建包含小鼠因子IX信號、前肽、GLA和EGFl結構域以及因子VII的EGF2和催化結構域及RKRRKR序列的構建體(SEQID NO 5)。具體而言，利用小鼠因子IX的cDNA作為模板及以下引物產生第一片段5，-AGGCCTGAAGATCTCCACCATGAAGCACCTGAACACCGTC-3，(SEQ ID NO 11)及
5，-GATCAGCTGCTCATTCTTGCTTTTTTCACAGTTCCTTCCTTCAAATC-3，(SEQ ID NO: 12)。利用小鼠因子VII作為模板及以下引物產生第二片段5，-GATTTGAAGGAAGGAACTGTGAAAAAAGCAAGAATGAGCAGCTGATC-3，(SEQ ID NO 13)及5，-ACAATGCGTTTTCGCCGCTTACGGCGGCCTTGGCGGCTGCTGGAGT-3，(SEQ ID NO :9)。可利用小鼠因子VII作為模板及以下引物產生第三片段5’ -TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3，(SEQ ID NO 8) R5，-GCCGCCGTAAGCGGCGAAAACGCATTGTGGGAGGCAACGTGTGCCC-3，(SEQ ID NO: 10)。然后可利用這三種片段作為模板以及以下引物進行重疊PCR 5'-AGGCCTGAAGATCTCCACCATGAAGCACCTGAACACCGTC-3'(SEQ ID NO: 11)及 5，-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3，(SEQ ID NO :8)。接著用 BamHI/SphI 消化所得的擴增片段并將其插入pSC-TTR-mvm載體的Bglll/SphI位點之間。隨后，將BGH多腺苷酸化序列插入所得載體的SphI位點處。可使用類似的過程產生以下構建體，其包含小鼠因子IX信號和前肽結構域、S蛋白的GLA結構域、因子IX的EGFl結構域以及因子VII的EGF2和催化結構域及RKRRKR序列(SEQ ID NO :6)。具體而言，可利用小鼠因子IX的cDNA及以下引物產生第一片段5，-AGGCCTGAAGATCTCCACCATGAAGCACCTGAACACCGTC-3，(SEQ ID NO :11)及5，-GTTTCTTCGAACAAGGTATTTGCTCTCTTTGGACGGGTAAGAATTTTG-3，(SEQ ID NO :14)。可利用小鼠S蛋白作為模板及以下引物產生第二片段5，-CAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGAGCAAATACCTTGTTCGAAGAAAC-3，(SEQ ID NO 15)及5‘-GATCTCCATCAACATACTGCTTATAAAAATAATCCGTCTCGGGATT-3‘(SEQ ID NO :16)。可利用以下載體作為模板及以下引物產生第三片段，所述載體帶有小鼠因子IX信號、前肽、GLA和EGFl結構域和因子VII的EGF2和催化結構域及RKRRKR序列5，-AATCCCGAGACGGATTATTTTTATAAGCAGTATGTTGATGGAGATC-3，(SEQ ID N0:17)和5，-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGG AAAC-3，(SEQ ID NO :8)。然后利用這三種片段作為模板以及以下引物進行重疊PCR:5‘-AGGCCTGAAGATCTCCACCATGAAGCACCTGAACACCGTC-3‘(SEQ ID NO 11)和 5，-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3，(SEQ ID NO :8)。接著用 BamHI/SphI 消化所得的擴增片段并將其插入pSC-TTR-mvm載體的Bglll/SphI位點之間。隨后，可將BGH多腺苷酸化序列插入所得載體的SphI位點處。將野生型小鼠因子VII (SEQ ID NO⑶和帶有RKRRKR序列的野生型小鼠因子VII (SEQ ID NO 4)載體構建體各自注射入兩只年齡匹配的雄性血友病B小鼠中(5X IO11個載體基因組/小鼠)。將帶有因子VII的EGF2和催化結構域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信號、前肽、GLA和EGFl結構域(SEQ ID NO 5)以及帶有因子VII的EGF2和催化結構域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信號和前肽結構域、S蛋白的GLA結構域、因子IX的EGFl結構域(SEQ ID NO 6)載體構建體各自注射入三只年齡匹配的雄性血友病B小鼠中(5X1011個載體基因組/小鼠)。注射后大約三周，用野生型小鼠因子VII(SEQ ID NO 3)或帶有RKRRKR序列的野生型小鼠因子VII (SEQ ID NO 4)注射的所有小鼠均死亡。在注射后大約五周，注射帶有因子VII的EGF2和催化結構域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信號、前肽、GLA和EGFl結構域(SEQ ID NO 5)或者帶有因子VII的EGF2和催化結構域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信號和前肽結構域、S蛋白的GLA結構域、因子IX的EGFl結構域(SEQ ID NO 6)的小鼠仍然存活，并且未顯示有不良的癥狀。每周從小鼠中采血一次，并在注射后6-8周可測定小鼠因子VII多肽的水平。此外，可通過測定經注射小鼠的血液樣品的體外凝血活性來間接確定小鼠因子VII多肽的抗原水平(Margaritas等人，Gene Therapy 2009 ；113 3682-3689)。 前面是對本發明的闡述，并不應解釋為其限制。本發明由隨附權利要求及其中包括的權利要求的等同物限定。所有出版物、專利申請、專利、專利公布、由GenBank 數據庫
和/或SNP登記號確定的序列以及本文引用的其它參考文獻均通過引用以其整體結合到本文中，用于與該參考文獻所出現的句子和/或段落有關的教導。
權利要求
1.一種通過給予嵌合因子VIIa多肽治療患出血障礙的受試者中的出血障礙的方法。
2.權利要求1的方法，其中所述嵌合因子VIIa多肽包含因子VII的催化結構域。
3.權利要求2的方法，其中所述嵌合因子VIIa多肽還包含因子VII的EGF-2結構域。
4.權利要求3的方法，其中所述嵌合因子VIIa多肽還包含維生素K依賴性凝結蛋白質的GLA結構域。
5.權利要求3的方法，其中所述嵌合因子VIIa多肽還包含維生素K依賴性凝結蛋白質的EGF-I結構域。
6.權利要求4的方法，其中所述GLA結構域選自因子IX的GLA結構域和S蛋白的GLA 結構域。
7.權利要求5的方法，其中所述EGF-I結構域選自因子IX的EGF-I結構域和S蛋白的 EGF-I結構域。
8.—種通過給予嵌合因子VIIa多肽治療患出血障礙的受試者中的出血障礙的方法， 其中所述嵌合因子VIIa多肽包含因子VII的EGF-2和催化結構域；GLA結構域，其選自因子IX的GLA結構域和S蛋白的GLA結構域；以及EGF-I結構域，其選自因子IX的EGF-I結構域和S蛋白的EGF-I結構域。
9.權利要求1的方法，其中所述出血障礙選自凝血因子缺乏；血小板功能缺陷；血小板減少；馮維勒布蘭德病；凝血因子抑制；手術引起的出血；以及創傷引起的出血。
10.權利要求9的方法，其中所述出血障礙為凝血因子缺乏。
11.權利要求10的方法，其中所述凝血因子缺乏為血友病。
12.權利要求1的方法，其中治療所述出血障礙包括將包含編碼所述嵌合因子VIIa多肽的核苷酸序列的核酸分子給予受試者。
13.—種通過給予包含GLA結構域的蛋白質治療患出血障礙的受試者中的出血障礙的方法，其中相對于所述蛋白質在循環中的濃度，所述蛋白質集中凝塊部位附近。
14.ー種嵌合凝結蛋白質，其包含S蛋白的GLA結構域；EGF-I結構域，其選自S蛋白的EGF-I結構域和因子IX的EGF-I結構域；以及因子VII的EGF-2結構域和催化結構域。
15.ー種編碼權利要求14所述的嵌合凝結蛋白質的核酸分子。
16.ー種包含權利要求15所述的核酸分子的載體。
17.ー種包含權利要求14所述的嵌合凝結蛋白質的細胞。
18.—種包含權利要求16所述的載體的細胞。
19.一種通過給予多肽治療患出血障礙的受試者中的出血障礙的方法，相對于因子 VII的血栓形成性，所述多肽具有減少的血栓形成性。
全文摘要
本發明涉及嵌合因子VII多肽及所述嵌合因子VII多肽的使用方法。
文檔編號A61K38/36GK102596231SQ201080038640
公開日2012年7月18日 申請日期2010年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者D·W·斯塔福德, 馮登敏 申請人:北卡羅來納-查佩爾山大學