專利名稱：用于乳糜瀉的乳酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防乳糜瀉(coeliac disease)的乳酸桿菌或鏈球菌。
背景技術(shù)：
乳糜瀉是一種小腸自身免疫性病癥，發(fā)生于始自嬰兒期所有年齡段的遺傳易感人群。乳糜瀉由對(duì)麥醇溶蛋白(gliadin)的反應(yīng)引起，所述麥醇溶蛋白是存在于小麥(和小麥族(Triticeae，例如大麥以及黑麥)的相似蛋白)的谷蛋白中相關(guān)的富脯氨酸和谷氨酰胺蛋白家族。當(dāng)暴露于麥醇溶蛋白時(shí)，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾蛋白質(zhì)，且易患乳糜瀉的受試者的免疫系統(tǒng)與小腸組織反應(yīng)和交叉反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。之后，炎癥引起絨毛萎縮且干擾包括礦物質(zhì)和脂溶性維生素的營養(yǎng)素的吸收。乳糜瀉的典型癥狀包括腹脹、嘔吐、腹瀉、體重減輕(或兒童發(fā)育障礙)、貧血以及疲乏。免疫系統(tǒng)對(duì)于麥醇溶蛋白的最強(qiáng)且最常見的反應(yīng)是針對(duì)長度為33個(gè)氨基酸的α 2-麥醇溶蛋白片段(本文中表示為SEQ ID NO:1)(Shan et al.2005 J.Proteome Res.4:1732-1741;Moron et al.2008;Am.J.Cl in.Nut87(2): 405-14)。經(jīng)臨床診斷的乳糜瀉的發(fā)病率為0.05-0.27%。然而，來自歐洲、印度、南美、澳大利亞以及美國地區(qū)的人群研究顯不兒童的發(fā)病率為0.33%-1.06%,成人的發(fā)病率為0.18-1.2%。數(shù)據(jù)表明許多人未被診斷出，僅具有輕度的胃腸不適癥狀。至今為止，已知的唯 一有效治療是終生無谷蛋白飲食。Siegel 等(Siegel M.et al., 2006, Chem Biol 13 (6): 649-58)揭不了十二指腸中降解α2_麥醇溶蛋白的推定33-mer肽表位的酶組合(脯氨酰內(nèi)肽酶和大麥谷氨酰胺特異性半胱氨酸內(nèi)妝酶(EP-B2)) ο Piper 等(Piper et al., 2004, J Pharm Exper.Therap311:213-219)揭示了脯氨酰內(nèi)肽酶降解麥醇溶蛋白肽的用途。TO 2007/108763揭示了用于促進(jìn)乳糜灣或特應(yīng)性皮炎的免疫耐受的植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株和鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。WO 2006/097415揭不了一種由于細(xì)菌間的互補(bǔ)蛋白水解活性而能夠降解麥醇溶蛋白肽的8種酸面團(tuán)(sourdough)乳酸菌和雙歧桿菌的混合物，所述麥醇溶蛋白肽例如A-麥醇溶蛋白的片段62-75和表位33-mer肽。從這些乳酸菌和雙歧桿菌獲得的焙烤食品可用于患有乳糜瀉的受試者。W003/028745揭示了具有能夠降解外啡肽A5(衍生自谷蛋白的5-mer肽)的內(nèi)肽酶的乳酸菌菌株。這些菌株能夠降低腸病原性肽的濃度。

發(fā)明內(nèi)容
進(jìn)行體外研究以選擇具有益生菌特性的乳酸菌菌株。選擇了大量屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的菌株在培養(yǎng)上清中能夠降解與乳糜瀉有關(guān)的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)的肽酶活性。之后，對(duì)于最初所選的菌株，選擇其在胃腸道存活的能力和上清肽酶活性在胃腸道中的穩(wěn)定性，即其到達(dá)乳糜瀉作用位點(diǎn)(即小腸)且在此仍具有活躍的降解33-mer肽的肽酶活性的能力。接下來，檢測(cè)所選的菌株降解推定與乳糜瀉有關(guān)的其他肽的能力，所述肽即來自α-麥醇溶蛋白的20-mer肽QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2)和來自A-麥醇溶蛋白的 13-mer 肽 LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:3) 令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)33-mer肽在模擬人消化道的條件下被緩慢降解，產(chǎn)生對(duì)人消化酶的進(jìn)一步降解具有完全抗性的18-mer肽降解產(chǎn)物PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)。該新發(fā)現(xiàn)使得能夠通過選擇乳酸菌菌株降解18-mer肽的能力而實(shí)現(xiàn)改進(jìn)的進(jìn)一步選擇。最終從大量菌株中選擇了三種單菌株和兩種菌株的混合物。這些菌株對(duì)于胃腸道條件具有抗性，產(chǎn)生在胃腸道條件下穩(wěn)定的高肽酶活性，并且有利地降解與乳糜瀉有關(guān)的33-mer、20-mer、13-mer肽且還降解具有抗性18_mer肽。從這些菌株純化負(fù)責(zé)肽降解的酶，并將其表征、測(cè)序，在干酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)中，其被鑒定為與延長因子Tu相同的蛋白；在嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)中，其被鑒定為延長因子G。這些特異性乳酸菌菌株或這些具有肽酶活性的細(xì)菌所產(chǎn)生的酶可有利地用于患有乳糜瀉的人或處于患乳糜瀉危險(xiǎn)的人，例如具有乳糜瀉家族史的人或具有與乳糜瀉有關(guān)的輕度胃腸問題的人。優(yōu)選地，以新鮮產(chǎn)品、發(fā)酵產(chǎn)品施用所述菌株，更優(yōu)選地，以發(fā)酵乳制品施用所述囷株。
具體實(shí)施例方式因此，本發(fā)明提供了一種用于治療和/或預(yù)防乳糜瀉的乳酸菌菌株和/或經(jīng)乳酸菌菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中所述乳酸菌和/或經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的培養(yǎng)基能夠降解 33-mer 肽 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO:1),20-mer 肽QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF(SE Q ID NO:2)、13_mer 肽 LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID N0:3)和 / 或18-mer肽PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)，并且，其中所述乳酸菌選自乳酸桿菌屬和鏈球菌屬組成的組。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述乳酸菌和/或經(jīng)所述乳酸菌發(fā)酵的所述培養(yǎng)基能夠降解 SEQ ID NO: 3 的 33-mer 肽和 SEQ ID NO:4 的 18-mer 肽。本發(fā)明還提供了一種用于治療和/或預(yù)防乳糜瀉的兩種乳酸菌菌株的混合物和/或經(jīng)兩種乳酸菌菌株的混合物發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中，所述乳酸菌和/或經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的培養(yǎng)基能夠降解 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的13-mer 肽和 / 或 SEQ ID NO: 4 的 18-mer 肽、優(yōu)選 SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 SEQ ID NO: 4的18-mer肽，且其中所述乳酸菌選自乳酸桿菌屬和鏈球菌屬組成的組。本發(fā)明還提供了一種組合物，所述組合物包含選自瑞士乳酸桿菌CNCM1-4279(Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279)、德氏乳酸桿菌乳亞種CNCM1-4280 (L.delbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280)、干酪乳酸桿菌CNCM1-4270、嗜熱鏈球菌CNCM 1-4269以及嗜熱鏈球菌CNCM 1-2776和保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787 (L.bulgaricus CNCM 1-2787)的混合物組成的組中的至少一種菌株。本發(fā)明還提供了選自乳酸桿菌屬和鏈球菌屬組成的組中的至少一種乳酸菌菌株的用途，所述菌株產(chǎn)生蛋白延長因子，所述蛋白延長因子用于降解SEQ ID N0:1的33-mer肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 / 或 SEQ ID NO:4 的 18-mer肽，優(yōu)選 SEQ ID NO: 3 的 33-mer 肽和 SEQ ID NO:4 的 18-mer 肽。本發(fā)明還提供了一種選擇用于治療和/或預(yù)防乳糜瀉的乳酸菌菌株的方法，所述方法包括選擇具有降解SEQ ID NO:4的18mer肽的能力的菌株的步驟，此時(shí)，在所述菌株培養(yǎng)上清的存在下至少45%、優(yōu)選至少70%的所述肽被水解。乳麼瀉

乳糜灣(coeliac disease或celiac disease)有時(shí)還被稱為腹型斯?jié)姳R腹灣(c(o)eliac sprue)、非熱帶性乳糜灣、地方性乳糜灣、谷蛋白(gluten)性腸病、谷蛋白敏感性腸病以及谷蛋白不耐癥。如本領(lǐng)域已知，該疾病可由醫(yī)生進(jìn)行診斷，涉及血清學(xué)血液檢測(cè)，以及常見的內(nèi)窺鏡檢查/胃鏡檢測(cè)和活組織檢查。乳糜瀉是由對(duì)麥醇溶蛋白反應(yīng)所引起的小腸病癥，所述麥醇溶蛋白是存在于小麥、大麥以及黑麥的谷蛋白中相關(guān)的富脯氨酸和谷氨酰胺蛋白家族。當(dāng)暴露于麥醇溶蛋白時(shí)，免疫系統(tǒng)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，所述炎癥反應(yīng)引起絨毛萎縮且干擾營養(yǎng)素(包括礦物質(zhì)和脂溶性維生素)吸收。乳糜瀉患者常患有腹脹、嘔吐、腹瀉、體重減輕(或兒童發(fā)育障礙)、貧血以及疲乏。乳酸菌本發(fā)明的乳酸菌、乳酸菌混合物或經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的培養(yǎng)基能夠降解如上所述的肽，此時(shí)在所選乳酸菌或所選的乳酸菌混合物的培養(yǎng)上清的存在下至少45%、且按照遞增的優(yōu)選順序至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%以及90%的所述肽被水解。可如下通過存在于在對(duì)數(shù)期和靜止期培養(yǎng)物中獲得的所選乳酸菌或所選的乳酸菌混合物的培養(yǎng)上清中的酶促蛋白水解活性來進(jìn)行肽降解測(cè)定:測(cè)定在37° C使用含有PBS (例如IOOmM, pH 7.3)、所述肽(例如l_2mM)以及培養(yǎng)上清(例如20-30 μ I)的混合物經(jīng)48小時(shí)進(jìn)行；然后，煮沸樣品、過濾(例如通過0.45 μ m)且通過高效液相色譜進(jìn)行分析。進(jìn)行體外研究以選擇具有所述特性的乳酸菌菌株。選擇了大量屬于乳酸桿菌屬、鏈球菌屬或雙歧桿菌屬的菌株在培養(yǎng)上清中能夠降解與乳糜瀉有關(guān)的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)的肽酶活性。初選的具有該能力的菌株均屬于乳酸桿菌屬和鏈球菌屬。之后，選擇其在胃腸道存活的能力和上清肽酶活性在胃腸道中的穩(wěn)定性，即其到達(dá)乳糜瀉作用位點(diǎn)(小腸)且仍具有活躍的降解33-mer肽的肽酶活性的能力。接下來，檢測(cè)所選的菌株降解推定與乳糜瀉有關(guān)的其他肽的能力，所述肽即來自α-麥醇溶蛋白的20-mer肽QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2)和來自A-麥醇溶蛋白的 13-mer 肽 LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:3) 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)33-mer肽在模擬人消化道的條件下被緩慢降解，產(chǎn)生對(duì)人消化酶的進(jìn)一步消化具有完全抗性的18-mer肽降解產(chǎn)物PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)。該新發(fā)現(xiàn)使得能夠通過選擇乳酸菌菌株降解18-mer肽的能力而改進(jìn)進(jìn)一步的選擇。最終從大量菌株中選擇了五種單菌株和兩種菌株的混合物。這些菌株將33-mer麥醇溶蛋白肽降解達(dá)最高程度(在所選的乳酸菌菌株或如上所述的混合物的培養(yǎng)上清的存在下至少45%、優(yōu)選至少70%的所述肽被水解)。在所述選擇中，優(yōu)選三種單菌株和兩種菌株的混合物的子選擇(sub-selection)，原由是它們對(duì)胃腸道條件具有最高抗性，在胃腸條件下產(chǎn)生穩(wěn)定的高肽酶活性，且還降解與乳糜瀉有關(guān)的20-mer肽和13-mer肽，還降解由33-mer肽生成的具有抗性的18-mer肽。發(fā)現(xiàn)下述乳酸菌菌株的培養(yǎng)上清(經(jīng)發(fā)酵的培養(yǎng)基)在降解與乳糜瀉有關(guān)的肽中最有效。-干酪乳酸桿菌菌株DN_114001，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1994年9月28日以保藏號(hào)1-1518保藏于法國國家微生物保藏中心(CNCM,Collection Nationale de Culturesde Microorganisms, 25Rue du Docteur Roux, Paris)。該菌株的詳細(xì)特征在 PCT 申請(qǐng)W096/20607 中公開；-干酪乳酸桿菌菌株DN_114077，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2009年12月16日以保藏號(hào)1-4270保藏于法國國家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL試劑盒(Biomerieux, France)測(cè)定的生物化學(xué)活性,該菌株被鑒定屬于干酪乳酸桿菌。根據(jù)API50CHL的結(jié)果，1-4270菌株發(fā)酵下述糖和醇:核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖(弱反應(yīng))、甘露醇、山梨醇、α -甲基-D葡萄糖苷、N-乙酰基葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、水楊苷、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、松三糖、淀粉(弱反應(yīng))、龍膽二糖、松二糖、塔格糖、L-阿拉伯糖醇以及葡萄糖酸；-瑞士乳酸桿菌菌株DN_1190118，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2010年2月25日以保藏號(hào)1-4279保藏于法國國家 微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL試劑盒(Biomerieux, France)測(cè)定的生物化學(xué)活性,該菌株被鑒定屬于瑞士乳酸桿菌。根據(jù)API50CHL的結(jié)果，1-4279菌株發(fā)酵下述糖和醇:半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺和乳糖；-嗜熱鏈球菌菌株DN_001343，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2002年I月24日以保藏號(hào)1-2776保藏于法國國家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL試劑盒(Biomerieux, France)測(cè)定的生物化學(xué)活性，該菌株被鑒定屬于嗜熱鏈球菌。根據(jù)API50CHL的結(jié)果，1-2776菌株發(fā)酵下述糖和醇:葡萄糖、乳糖以及蔗糖；-保加利亞乳酸桿菌菌株DN_100290，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2002年I月24日以保藏號(hào)1-2787保藏于法國國家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL試劑盒(Biomerieux, France)測(cè)定的生物化學(xué)活性,該菌株被鑒定屬于保加利亞乳酸桿菌。根據(jù)API 50CHL的結(jié)果，1-2787菌株發(fā)酵下述糖和醇:葡萄糖、果糖、甘露糖以及乳糖；-嗜熱鏈球菌菌株DN_001546，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2009年12月16日以保藏號(hào)1-4269保藏于法國國家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL試劑盒(Biomerieux, France)測(cè)定的生物化學(xué)活性，該菌株被鑒定屬于嗜熱鏈球菌。根據(jù)API50CHL的結(jié)果，1-4269菌株發(fā)酵下述糖和醇:葡萄糖、乳糖以及蔗糖；和-德氏乳酸桿菌乳亞種菌株DN_1110272，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2010年2月25日以保藏號(hào)1-4280保藏于法國國家微生物保藏中心。基于PCR分型和使用API 50CHL試劑盒(Biomerieux, France)測(cè)定的生物化學(xué)活性,該菌株被鑒定屬于德氏乳酸桿菌乳亞種。根據(jù)API 50CHL的結(jié)果，1-4280菌株發(fā)酵下述糖和醇:半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺、麥芽糖以及乳糖。優(yōu)選地，將嗜熱鏈球菌CNCM 1-2776和保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787在混合物(例如酸奶起子培養(yǎng)物)中一起使用。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，乳酸菌選自干酪乳酸桿菌、瑞士乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌、德氏乳酸桿菌乳亞種以及嗜熱鏈球菌組成的組。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述乳酸菌菌株或兩種菌株的混合物選自干酪乳酸桿菌CNCM 1-1518、干酪乳酸桿菌CNCM 1-4270、瑞士乳酸桿菌CNCM 1-4279、嗜熱鏈球菌CNCM 1-4269、德氏乳酸桿菌乳亞種CNCM 1-4280以及嗜熱鏈球菌CNCM 1-2776和保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787的混合物組成的組。在胃腸條件下最有效且因此優(yōu)選的菌株選自干酪乳酸桿菌CNCM 1-1518 (菌株DN_114001)、瑞士乳酸桿菌CNCM 1-4279 (菌株DN_1190118)、德氏乳酸桿菌乳亞種CNCM1-4280 (菌株DN_1110272)以及嗜熱鏈球菌CNCM1-2776 (菌株DN_001343)與保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787 (菌株DN_100290)的混合物。本發(fā)明還包括上述菌株，以及衍生自任一親本菌株仍具有抗谷蛋白肽的肽酶活性的突變菌株或基因轉(zhuǎn)化菌株的用于抗乳糜瀉目的的用途。這些突變菌株或基因轉(zhuǎn)化菌株可為其中親本菌株的一種或多種內(nèi)源性基因被突變以例如修飾其某些代謝特性(例如，其發(fā)酵糖的能力、其對(duì)酸的抗性、其經(jīng)胃腸道運(yùn)輸?shù)拇婊盍Α⑵浜笏峄蚱浯x物生成)。它們還可為由一種或多種感興趣的基因?qū)τ谟H本菌株基因轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的菌株，其中，所述基因轉(zhuǎn)化例如用于賦予所述菌株其他生理特性或使其表達(dá)期望通過所述菌株而施用的具有治療或免疫意義的蛋白。然而，本發(fā)明不包括PCT申請(qǐng)WO 2007/108763中所公開的植物乳酸桿菌菌株 LB931(DSM 11918)，LB7c (DSM 17853)和 LB3e (DSM 17852)以及鼠李糖乳酸桿菌菌株LB2 KNCIMB 40564)。培養(yǎng)上清中針對(duì)谷蛋白肽的肽酶活性位于細(xì)胞外的肽酶活性在其中細(xì)胞被培養(yǎng)至中對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)物中最高。這表明所述肽酶活性為初級(jí)代謝的 一部分。在模擬人胃腸道的環(huán)境下，一些菌株的肽酶活性高度穩(wěn)定(至少25%、優(yōu)選至少30%肽降解)。所述肽酶活性導(dǎo)致如上所述的LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)、QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF(SEQ ID NO:2)、LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3)以及具有降解抗性的18-mer肽降解產(chǎn)物PQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:4)的裂解，優(yōu)選 SEQ ID NO: 3 的 33-mer 肽和 SEQ ID N0:4 的 18-mer肽的裂解。自干酪乳酸桿菌菌株DN_114001 (CNCM 1-1518)以及嗜熱鏈球菌菌株DN_001343 (CNCM 1-2776)分離、純化肽酶活性，并進(jìn)行測(cè)序，令人驚訝地，所述肽酶活性為延長因子，即，在乳酸桿菌情況下為延長因子Tu和在嗜熱鏈球菌情況下為延長因子G。延長因子Tu和G為直系同源的基因/蛋白質(zhì)。延長因子為促進(jìn)翻譯延長事件(即蛋白質(zhì)合成中從第一個(gè)肽鍵形成至最后一個(gè)肽鍵形成的步驟)的蛋白質(zhì)。細(xì)菌延長因子Tu可降解η端封閉的蛋白質(zhì)。另外，延長因子為具有粘附因子特征的表面蛋白。所述因子在粘蛋白結(jié)合能力中起作用。鉬合物本發(fā)明還涉及一種組合物，所述組合物包含乳酸菌或兩種乳酸菌菌株的混合物和/或經(jīng)至少一種乳酸菌或兩種乳酸菌菌株的混合物發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中所述乳酸菌選自乳酸桿菌屬和鏈球菌屬組成的組。所述乳酸菌、兩種乳酸菌菌株的混合物和/或經(jīng)發(fā)酵的培養(yǎng)基能夠降解如上所述的 33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)、20-mer 肽 QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2), 13-mer 肽 LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3)和 / 或 18-mer 肽 PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)，優(yōu)選 SEQ ID NO: 3 的 33-mer 肽和SEQ ID NO:4 的 18-mer 肽。優(yōu)選地，具有降解谷蛋白肽能力的本發(fā)明的乳酸菌用于制備適于腸給藥的組合物。在一種實(shí)施方式中，所述組合物包含如上所述的乳酸菌的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述組合物包含選自瑞士乳酸桿菌CNCM 1-4279、德氏乳酸桿菌乳亞種CNCM 1-4280、干酪乳酸桿菌CNCM 1-4270、嗜熱鏈球菌CNCM1-4269以及嗜熱鏈球菌CNCM1-2776和保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787的混合物組成的組中的至少一種菌株，優(yōu)選瑞士乳酸桿菌CNCM 1-4279、德氏乳酸桿菌乳亞種CNCM 1-4280以及嗜熱鏈球菌CNCM 1-2776和保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787的混合物。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為活細(xì)胞。可選地，所述細(xì)胞為滅活細(xì)胞，但為了不以太大程度地破壞酶活性，所述滅活應(yīng)以溫和方式進(jìn)行。如果活細(xì)胞存在于所述組合物中，它們的存在量優(yōu)選為每克干重組合物IO5至IO13集落形成單位(Cfu)，優(yōu)選至少IO6Cfu,更優(yōu)選至少107cfu,還更優(yōu)選至少108cfu,最優(yōu)選至少109cfu。在液體組合物的情況下,這通常對(duì)應(yīng)于IO4至IO12集落形成單位(c fu) / ml、優(yōu)選至少105cfu / ml、更優(yōu)選至少106cfu / ml、還更優(yōu)選至少IO7Cfu / ml以及最優(yōu)選至少IO8Cfu / ml。任選地，活細(xì)胞可存在于組合物中，但沒有包含肽酶活性的上清。當(dāng)在胃腸道中進(jìn)行細(xì)胞的傳代時(shí)，新肽酶活性將在原位產(chǎn)生。因此，僅具有細(xì)胞的組合物仍具有抗谷蛋白活性。優(yōu)選地，細(xì)菌細(xì)胞可被分離并添加至組合物中，例如，以干細(xì)菌細(xì)胞、冷凍細(xì)菌細(xì)胞或凍干細(xì)菌細(xì)胞的形式。在一種實(shí)施方式中，從所述組合物中去除細(xì)菌細(xì)胞，但包含肽酶活性的上清存在于產(chǎn)品中。優(yōu)選地，這樣的組合物是從中去除了細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵產(chǎn)品。去除細(xì)菌細(xì)胞的合適方式為過濾或離心。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含肽酶活性的細(xì)胞和上清均存在于組合物中。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的乳酸菌用于制備發(fā)酵產(chǎn)品。所述發(fā)酵產(chǎn)品通常具有發(fā)酵過程中產(chǎn)生的細(xì)菌的所有細(xì)胞外代謝物，包括谷蛋白肽酶活性。任選地，可存在其他乳酸菌菌株。所述發(fā)酵產(chǎn)品可以以液體形式存在或以通過干燥發(fā)酵液體而獲得的干粉形式而存在。優(yōu)選地，發(fā)酵產(chǎn)品為新鮮產(chǎn)品。未經(jīng)嚴(yán)格加熱處理步驟的新鮮產(chǎn)品具有最高的肽酶活性(至少45%、優(yōu)選至少70%的如上所述的肽被水解)。優(yōu)選地，所述發(fā)酵產(chǎn)品為乳制品，更優(yōu)選發(fā)酵乳和/或發(fā)酵乳清。優(yōu)選地，營養(yǎng)組合物為固定、攪拌或可飲用形式的酸奶或發(fā)酵乳。優(yōu)選地，所述發(fā)酵產(chǎn)品是奶酪。優(yōu)選地，所述發(fā)酵產(chǎn)品為發(fā)酵的植物，例如固定、攪拌或可飲用形式的發(fā)酵大豆、谷物和/或水果。優(yōu)選地，所存在的營養(yǎng)組合物為嬰兒食品、嬰兒配方乳或較大嬰兒配方乳。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物為營養(yǎng)食品或藥品、營養(yǎng)補(bǔ)劑或醫(yī)用食品。任選地，所述組合物可包含其他乳酸菌菌株。這些其他菌株可用于發(fā)酵產(chǎn)品，優(yōu)選乳制品°
方法本發(fā)明還涉及一種選擇用于治療和/或預(yù)防乳糜瀉的乳酸菌菌株的方法，所述方法包括選擇具有降解 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3的13-mer肽和/或SEQ ID NO:4的Iner肽,優(yōu)選SEQ ID NO:4的18-mer肽能力的菌株的步驟，此時(shí)，在所述菌株的培養(yǎng)上清的存在下至少45%、優(yōu)選至少70%的所述肽被水解。在所述方法的一種實(shí)施方式中，其進(jìn)一步包括選擇下述菌株的步驟:所述菌株降解 SEQ ID NO:1 的 3-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 Iier 肽和 / 或SEQ ID NO: 4的1-mer肽的能力在pH 4_6，優(yōu)選pH5下穩(wěn)定(即，超過25%、優(yōu)選超過30%的所述肽被降解)和/或在選自溶菌酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶組成的組中的消化酶的存在下穩(wěn)定(即，超過25%、優(yōu)選超過35%的所述肽被降解)。實(shí)施例1:選擇乳酸菌培養(yǎng)上清降解SEQ ID NO:1的33-mer肽的能力選擇了 34種乳酸桿菌菌株、10種鏈球菌菌株以及3種雙歧桿菌菌株，并對(duì)于它們產(chǎn)生具有降解來自α 2-麥醇溶蛋白(推定導(dǎo)致乳糜瀉)的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)的蛋白水解活性的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。所包含的所有微生物均在普通培養(yǎng)基和特異性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對(duì)于乳酸桿菌菌株，使用普通培養(yǎng)基MRS (20g/l葡萄糖，10g/l蛋白胨，8g/l肉浸出物，5g/l乙酸鈉，2g/l磷酸氫二鉀，2g/l檸檬酸銨，Iml Tween 80，0.2g/l硫酸鎂，0.05g/I硫酸錳)，并且使用特異 性培養(yǎng)基YGBLP(10g/l蛋白胨，8g/l肉浸出物，3g/l酵母浸出物，
2.5g/l磷酸二氫鉀，2.5g/l磷酸氫二鉀，0.2g/l硫酸鎂，0.05g/l硫酸錳，5g/l葡萄糖，5g/I乳糖)。對(duì)于鏈球菌菌株，使用普通培養(yǎng)基Elliker (5g/l葡萄糖，20g/l蛋白胨，5g/l蔗糖，1.5g/l乙酸鈉，2.5g/l明膠,0.5g/l抗壞血酸，5g/l酵母浸出物，5g/l乳糖，4g/l氯化鈉)和特異性培養(yǎng)基BHI (12.5g/l小牛腦浸出物固體，5g/l牛心浸出物固體，10g/l示蛋白胨(proteose peptone), 2g/l 葡萄糖，5g/1 氯化鈉,2.5g/l 磷酸氫二鈉)。對(duì)于雙歧桿菌菌株，在由MRS和半胱氨酸(0.5g/l)組成的普通培養(yǎng)基中和在特異性雙歧桿菌培養(yǎng)基(10g/l酪蛋白胨，5g/l肉浸出物，5g/l酵母浸出物，10g/l葡萄糖，ImlTween 80，3g/l磷酸氫二鉀和0.5g/l半胱氨酸)中培養(yǎng)。對(duì)于乳酸桿菌菌株所選擇的培養(yǎng)溫度為25° C和37° C，對(duì)于鏈球菌和雙歧桿菌菌株為37° C。在有氧和缺氧條件下培養(yǎng)。將在10，OOOrpm下離心5min后獲得的上清用于體外33-mer肽降解測(cè)定。在對(duì)數(shù)期和靜止期培養(yǎng)物中獲得來自普通培養(yǎng)基和特異性培養(yǎng)基的培養(yǎng)上清，以根據(jù)初級(jí)代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)生的降解活性進(jìn)行選擇。通過存在于所選微生物的培養(yǎng)上清中的酶促蛋白水解活性進(jìn)行33-mer肽降解測(cè)定。使用 114 μ I PBSdOOmM, pH 7.3)、獲自 GENSCRIPT (Pscataway, USA)合成的 12 μ I33-mer肽和24 μ I培養(yǎng)上清在37° C進(jìn)行反應(yīng)48小時(shí)。接下來，煮沸樣品，通過0.45 μ m過濾，并通過配備光電二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行分析。使用來自Waters的C18柱通過HPLC評(píng)估殘留33-mer肽的定量。在220_和35° C下進(jìn)行肽檢測(cè)。所使用的溶劑是具有TFA(0.1%)的miI1-Q水和具有TFA(0.1%)的乙腈。下文表I顯示了對(duì)上清的選擇結(jié)果。結(jié)果顯示特別是屬于乳酸桿菌屬和鏈球菌屬的菌株的培養(yǎng)上清能夠降解所述肽，且培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞比培養(yǎng)至靜止期的細(xì)胞在肽降解方面更有效。另外，在大多數(shù)情況下，在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞比在特異性培養(yǎng)基上能夠更好地降解33-mer肽。表1:來自在特異性培養(yǎng)基或普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物和靜止期培養(yǎng)物的乳酸桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌菌株的培養(yǎng)上清的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO:1)降解的百分率
權(quán)利要求
1.一種用于治療和/或預(yù)防乳糜瀉的乳酸菌菌株和/或經(jīng)乳酸菌菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中所述乳酸菌和/或經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的培養(yǎng)基能夠降解33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)、20_mer肽 QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF(SEQ ID N0:2)、13_mer肽 LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3)和 / 或 18-mer 肽 PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4)，并且，其中所述乳酸菌選自乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)組成的組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸菌菌株和/或經(jīng)乳酸菌菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中所述乳酸菌和/或其中經(jīng)所述乳酸菌發(fā)酵的所述培養(yǎng)基能夠降解SEQ ID NO:1的33-mer肽和SEQID NO:4 的 18-mer 肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的乳酸菌菌株和/或經(jīng)乳酸菌菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中所述乳酸菌產(chǎn)生蛋白延長因子和/或其中經(jīng)所述乳酸菌發(fā)酵的所述培養(yǎng)基包含蛋白延長因子，且其中所述蛋白延長因子具有能夠降解SEQ ID N0:1的33-mer肽、SEQ ID N0:2的20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 / 或 SEQ ID NO:4 的 18-mer 肽的肽酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的乳酸菌菌株和/或經(jīng)乳酸菌菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中所述肽的降解發(fā)生在受試者的小腸中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的乳酸菌菌株和/或經(jīng)乳酸菌菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中至少 45% 的 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和/或SEQ ID NO:4的18-mer肽在所述菌株的培養(yǎng)上清的存在下被水解。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的乳酸菌菌株和/或經(jīng)乳酸菌菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中所述乳酸菌選自干酪乳酸桿菌CNCM 1-1518 (Lactobacillus casei CNCM 1-1518)、瑞士乳酸桿菌 CNCM 1-4279 (Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279)、德氏乳酸桿菌乳亞種 CNCM 1-4280 (L.d elbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280)、干酪乳酸桿菌 CNCM1-4270 (Lactobacillus casei CNCM1-4270)以及嗜熱鏈球菌CNCM 1-4269 (Streptococcusthermophilus CNCM1-4269)組成的組。
7.一種用于治療和/或預(yù)防乳糜瀉的兩種乳酸菌菌株混合物和/或經(jīng)兩種乳酸菌菌株混合物發(fā)酵的培養(yǎng)基，其中所述乳酸菌和/或經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的培養(yǎng)基能夠降解SEQ ID NO:1的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 / 或 SEQ ID NO: 4 的18-mer肽,其中所述乳酸菌選自乳酸桿菌屬和鏈球菌屬組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乳酸菌混合物，其包含嗜熱鏈球菌CNCM1-2776和保加利亞乳酸桿菌 CNCM 1-2787 (L.bulgaricus CNCM 1-2787)或由嗜熱鏈球菌 CNCM 1-2776 和保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787組成。
9.一種組合物,所述組合物包含權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的菌株或權(quán)利要求7和8任一項(xiàng)所述的乳酸菌混合物。
10.一種組合物，所述組合物包含選自瑞士乳酸桿菌CNCM 1-4279、德氏乳酸桿菌乳亞種CNCM 1-4280、干酪乳酸桿菌CNCM 1-4270、嗜熱鏈球菌CNCM 1-4269以及嗜熱鏈球菌CNCM1-2776和保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787的混合物組成的組中的至少一種菌株。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，所述組合物用于預(yù)防和/或治療乳糜瀉。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物是液體產(chǎn)品。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物是乳制品。
14.根據(jù)權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物為發(fā)酵產(chǎn)品。
15.根據(jù)權(quán)利要求9至14任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物每克干重包含IO5至1013cfu。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至15任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述乳酸菌以至少IOltlCfu/天的劑量施用于受試者。
17.自乳酸桿菌屬和鏈球菌屬組成的組中的至少一種乳酸菌菌株的用途，其中，所述乳酸菌菌株產(chǎn)生降解 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3的13-mer肽和/或SEQ ID NO:4的18-mer肽的蛋白延長因子。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物或用途，其中所述乳酸菌選自干酪乳酸桿菌CNCM 1-1518、干酪乳酸桿菌CNCM 1-4270、瑞士乳酸桿菌CNCM 1-4279、德氏乳酸桿菌乳亞種CNCM 1-4280以及嗜熱鏈球菌CNCM 1-2776和保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787的混合物組成的組。
19.酸菌或兩種乳酸菌菌株的混合物，其選自干酪乳酸桿菌CNCM1-4270、瑞士乳酸桿菌CNCM 1-4279、德氏乳酸桿菌乳亞種CNCM 1-4280、嗜熱鏈球菌CNCM 1-2776、保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787以及嗜熱鏈球菌CNCM 1-2776和保加利亞乳酸桿菌CNCM 1-2787的混合物組成的組。
20.擇用于治療和/或預(yù)防乳 糜瀉的乳酸菌菌株的方法，所述方法包括選擇具有降解SEQ ID N0:4的18-mer肽的能力的菌株的步驟，此時(shí)，在所述菌株培養(yǎng)上清的存在下，45%的所述肽被水解。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，所述方法還包括選擇下述菌株的步驟:所述菌株降解 SEQ ID NO:1 的 33-mer 肽、SEQ ID NO: 2 的 20-mer 肽、SEQ ID NO: 3 的 13-mer 肽和 / 或SEQ ID NO:4的18-mer肽的能力在pH 4_6下穩(wěn)定和/或在選自溶菌酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶組成的組中的消化酶的存在下穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明公開了乳酸桿菌屬和鏈球菌屬的菌株，所述菌株具有降解與乳糜瀉有關(guān)的麥醇溶蛋白肽的能力，且其肽降解活性在低pH下和哺乳動(dòng)物消化酶存在下穩(wěn)定。這些菌株適于用于預(yù)防和/或治療乳糜瀉的產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A61K35/74GK103097513SQ201080066730
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者阿古斯蒂·蒙特塞拉特·卡雷拉斯, 蒙特塞拉特·安德魯·科羅米納斯, 丹尼爾·拉蒙·維達(dá)爾, 薩爾瓦多·赫諾韋斯·馬丁內(nèi)斯, 埃絲特·巴塔列爾·萊瓦 申請(qǐng)人:熱爾韋·達(dá)諾尼公司