專利名稱：禽流感滅活疫苗的制備方法及其產品的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種滅活疫苗的制備方法，尤其涉及一種禽流感滅活疫苗的制備方法以及由該方法制備得到的滅活疫苗產品，本發明屬于禽流感滅活疫苗的生產領域。
背景技術：
禽流感是禽流行性感冒的簡稱，它是一種由甲型流感病毒的一種亞型(也稱禽流感病毒)引起禽發生急性出血性的傳染性疾病，以引發呼吸道發病或隱性感染為特點。世界動物衛生組織(OIE)、國際貿易組織和國際獸醫局將高致病性禽流感HPAI定為A類傳染病，又稱“真性雞瘟”或“歐洲雞瘟”。禽流感病毒感染后可以表現為輕度的呼吸道癥狀和消化道癥狀，死亡率較低。也可表現為較嚴重的全身性、出血性、敗血性癥狀，死亡率較高。這種癥狀上的不同，主要是由禽流感病毒的毒型決定的。疫苗是防治禽流感最有效的手段，可按程序免疫接種禽流感滅活疫苗。禽流感滅活疫苗疫苗具有制備工藝簡單，免疫效果確實，免疫持續時間較長等特點，已被許多國家地區在家禽中使用，并在預防和控制禽流感暴發中起到一定積極作用。目前，在禽流感疫苗生產中，通常采用甲醛作為滅活劑進行病毒的滅活。甲醛是一種有強烈刺激性的致癌物質。甲醛既可作用于病毒含氨基的核苷酸堿基(如A，G，U)，又可作用于病毒殼蛋白。作用于病毒殼蛋白時，易使蛋白質發生交聯或病毒顆粒聚集，不能再作用于殼蛋白內的核酸。這樣，病原體蛋白的抗原性會遭到嚴重破壞，并可能有病原體存活。 故而，為了使病原得到充分的滅活，以免發生散毒事故發生，疫苗生產過程中，均采用加大甲醛濃度及延長滅活時間等措施。這樣的結果就可能造成，疫苗產品中殘留大量游離甲醛， 若隨疫苗注入機體后，會產生制激性反應。且在疫苗的保存過程中，多余的游離甲醛醛基不斷作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐漸降解，這樣疫苗中的有效成分不斷流逝， 不僅縮短了疫苗的保存期，還導致該疫苗免疫動物后存在抗體水平下降的問題。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有的禽流感滅活疫苗含有較高濃度的甲醛殘留導致滅活疫苗存在安全性差、保存期短和保護效力差等缺陷，提供一種新的禽流感滅活疫苗的制備方法，該制備方法能夠有效的去除禽流感滅活疫苗中的甲醛殘留，所制備的禽流感滅活疫苗具有免疫副反應小、保存期長、抗體水平高等優點。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種禽流感滅活疫苗的制備方法，包括制備禽流感病毒液；禽流感病毒液中加入甲醛，滅活病毒液；向滅活病毒液中加入佐劑，乳化，即得；其中，在向滅活病毒液中加入佐劑之前對滅活病毒液進行下述處理將滅活后的病毒液濃縮，將濃縮后的病毒液稀釋后再加入佐劑，乳化。為了達到更好的技術效果，本發明優選采用膜分離為基礎的切向流過濾方法
3(Tangential Flow Filtration，TFF)來進行病毒的濃縮操作。TFF(Tangential Flow Filtration)切向流過濾，也經常被稱作交叉流過濾(Cross-flow Filtrarion)，是指液體在泵的驅動下沿著與膜表面相切的方向流動，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過膜表面，將被膜截留的顆粒和大分子沖走，避免它們堆積在膜表面，造成膜堵塞和流速下降。優選的，將滅活病毒液用切向流過濾方法濃縮2次；其中，將第1次濃縮后得到的病毒濃縮液中加入相同體積的滅菌注射用水，充分混合，進行第2次濃縮；當濾除液為原始液的1/2體積時停止第2次濃縮，向第2次濃縮后的病毒液中加入相同體積的滅菌注射用水，充分混合；再加入佐劑，乳化，即得。其中，所述的切向流過濾優選在以下參數下進行進口壓力控制為l.Obar，循環口壓力控制為0. 4bar，壓力差控制在0. 6bar以上；料液溫度控制在40_45°C以下的條件進行濃縮本發明通過試驗發現，在將滅活病毒液采用濾膜進行過濾濃縮之前，將滅活病毒液進行離心處理以去除雜蛋白，這對于提高疫苗的安全性和抗體水平有非常重要的作用； 其中，所述的離心轉速優選為8000-16000rpm，更優選為12000rpm ；所述離心的次數可以為 1-3次，優選為2次。此外，將經過離心后的病毒液再用0.45 μ m的濾膜進行過濾預處理也能有效的去除病毒液中的各種雜質。本發明針對禽流感滅活疫苗生產現狀，優化并改進了禽流感疫苗生產工藝流程， 從甲醛濃度與免疫效價關系方面做了大量的試驗，最終獲得了重大突破，在禽流感(尤其是H5亞型)規?；a規程的基礎上，利用病毒濃縮技術，有效除去了疫苗中的甲醛殘留， 與現有工藝生產的禽流感滅活疫苗相比，本發明方法減少了疫苗制品中75%的甲醛殘留， 所制備的禽流感滅活疫苗具有免疫副反應小、保存期長、抗體水平高等特點。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例11、制備禽流感病毒液將H5W型重組禽流感毒(Re-5株)(購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所)接種雞胚培養，收獲感染胚液，得到禽流感病毒液；2 滅活2. 1將無菌檢驗合格的禽流感病毒液混合于一個滅活罐內，吸取數毫升樣品用于毒價檢測。其余胚液加入甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為2%0 ；2. 2生產操作人員按《滅活罐操作規程》進行滅活。2.3 37°C滅活20小時(以缸內溫度達到37°C開始計時)，期間每1小時攪拌1次。 滅活后的胚液置2 8 °C保存，應不超過1個月。3半成品檢驗3. 1無菌檢驗取滅活的胚液，按《中國獸藥典》2005年版進行，應無菌生長。
3. 2滅活檢驗取10日齡SPF雞胚8個，各胚尿囊腔內接種滅活胚液0. lml，36°C孵育72小時，收獲雞胚液，測定血凝價，應均不出現血凝，并盲傳1代，測定血凝價，若無血凝現象，認為滅活完全。3. 3 HA效價滅活前和滅活后分別測定每個容器的HA效價，HA效價彡Slog2者方可用于制苗。4病毒液的預處理將待濃縮的病毒液用連續離心機12000rpm，至少2次，以去除病毒液中的雜蛋白。5甲醛的洗脫5. 1滅活病毒液的濃縮將離心處理的病毒液用0. 45 μ m濾膜過濾進行濃縮前的預處理。然后按照濃縮機 (PALL UF-C20)的要求，在進口壓力為1. Obar，循環口壓力為0. 4bar，壓力差控制在0. ^ar 以上；料液溫度在40-45°C以下的條件進行濃縮。當濾除液為原始液的1/2體積時停止濃縮。濃縮后的廢棄液應無血凝性。具體操作如下打開閥門，排空系統中的儲存液(如0. IN NaOH)，將循環液管和透過液管放入廢液容器，用少量純水沖洗進液口管頭；在干凈的容器中加入至少20L純水(0. 5m2膜包)，然后根據情況繼續補充純水；清洗膜面(不加壓清洗)調節泵速至Pin = 15-20Psi并穩定，測定循環液管流出液體積不小于60L ；清洗膜孔(加壓清洗)提高泵速至進口壓力達到Pin = 25I^i，調節循環閥至循環口壓力至Pout = lOI^si，穩定后沖洗至透過液管流出液體積達到350L以上為止；正常水通量測定(NWP = Normalize Water Permeability)通過泵速和循環閥調節Pin = IOPsi, Pout = 5I^i，測定透過液口 1分鐘透過的水體積，通過水溫查校正因子， 計算NWP ；可以正常投入使用。5. 2濃縮液的二次濃縮向上述濃縮液中加入相同體積的滅菌注射用水，充分混合，按照5. 1項要求，經行二次濃縮。當濾除液為原始液的1/2體積時停止濃縮。濃縮后的廢棄液應無血凝性。5. 3濃縮液的稀釋向進行第二次濃縮后的病毒液中，加入相同體積的滅菌注射用水，充分混合。病毒液作無菌檢驗，應無菌生長。6配苗及分裝向稀釋后的濃縮液中加入佐劑，乳化，即得。對比實施例1按《重組禽流感病毒滅活疫苗(H5W亞型，Re-5株)制造及檢驗規程》的生產方法進行。1、制備禽流感病毒液將禽流感毒株Re-5株接種雞胚培養，收獲感染胚液，得到禽流感病毒液；2.滅活2. 1將無菌檢驗合格的胚液混合于一個滅活罐內，吸取數毫升樣品用于毒價檢測。其余胚液加入甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為2%。；2. 2生產操作人員按《滅活罐操作規程》進行滅活。2.3 37°C滅活20小時(以缸內溫度達到37°C開始計時)，期間每1小時攪拌1次。 滅活后的胚液置2 8 °C保存，應不超過1個月。3.半成品檢驗3. 1無菌檢驗取滅活的胚液，按《中國獸藥典》2005年版進行，應無菌生長。3. 2滅活檢驗取10日齡SPF雞胚8個，各胚尿囊腔內接種滅活胚液0. lml，36°C孵育72小時，收獲雞胚液，測定血凝價，應均不出現血凝，并盲傳1代，測定血凝價，若無血凝現象，認為滅活完全。3. 3 HA效價滅活前和滅活后分別測定每個容器的HA效價，HA效價彡Slog2者方可用于制苗。4配苗及分裝向稀釋后的濃縮液中加入佐劑，乳化，即得。試驗例1本發明制備方法和對比實施例所制備的滅活疫苗的甲醛殘留含量的測定試驗1、試驗產品(1)按照實施例1所述的方法進行10個批次的生產，分別得到了 10 個批次的產品，即本發明滅活疫苗產品；( 按照對比實施例1所述的方法進行10個批次的生產，也分別得到了 10個批次的產品，即對比實施例滅活疫苗產品。2、試驗方法及結果分別檢測所述10批次產品的半成品中的甲醛濃度，檢測結果見表1。表1兩種生產方法半成品甲醛濃度對比表(單位％。)
權利要求
1.一種禽流感滅活疫苗的制備方法，包括制備禽流感病毒液；禽流感病毒液中加入甲醛，滅活病毒液；向滅活病毒液中加入佐劑，乳化，即得；其特征在于在向滅活病毒液中加入佐劑之前將滅活病毒液進行下述處理將滅活后的病毒液濃縮，將濃縮后的病毒液稀釋。
2.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的病毒液濃縮是采用過濾濃縮的方式進行濃縮。
3.按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的過濾濃縮是采用切向流過濾方法來進行病毒液的過濾濃縮。
4.按照權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于將病毒液用切向流過濾方法濃縮2次；其中，將第1次過濾濃縮后得到的病毒濃縮液中加入相同體積的滅菌注射用水，充分混合，再進行第2次濃縮，當濾除液為原始液的1/2體積時停止第2次濃縮；向第2次濃縮后的病毒液中加入相同體積的滅菌注射用水，充分混合。
5.按照權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的切向流過濾方法是在以下參數下進行進口壓力控制為1. Obar，循環口壓力控制為0. 4bar，壓力差控制在0. 6bar以上； 料液溫度控制在40-45°C以下的條件進行濃縮。
6.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于在將滅活病毒液采用濾膜進行過濾濃縮之前，將滅活病毒液進行離心處理。
7.按照權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的離心轉速為8000-16000rpm； 優選為12000rpm。
8.按照權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述離心的次數為1-3次；優選的， 所述離心的次數為2次。
9.按照權利要求6所述的制備方法，其特征在于將離心處理后的病毒液用0.45 μ m 的濾膜進行過濾。
10.由權利要求1-9任何一項所述制備方法制備得到的禽流感滅活疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種禽流感滅活疫苗的制備方法及其產品，其制備方法包括制備禽流感病毒液；禽流感病毒液中加入甲醛，滅活病毒液；向滅活病毒液中加入佐劑，乳化，即得；其中，在向滅活病毒液中加入佐劑之前將病毒液進行下述處理將滅活后的病毒液濃縮，將濃縮后的病毒液稀釋。本發明針對禽流感滅活疫苗生產現狀，優化并改進了禽流感疫苗生產工藝流程，從甲醛濃度與免疫效價關系方面做了大量的試驗，在禽流感規模化生產規程的基礎上，利用病毒濃縮技術，有效清除了疫苗制品中的甲醛殘留，與現有的禽流感滅活疫苗相比，本發明方法有效除去了疫苗制品中75％的甲醛殘留，所制備的禽流感滅活疫苗具有免疫副反應小、保存期長、抗體水平高等優點。
文檔編號A61P31/16GK102266554SQ20111020200
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月19日 優先權日2011年7月19日
發明者付麗杰, 吳金, 孫德君, 左穎, 張婷婷, 張明艷, 張楊, 趙立國, 鄭德富 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司