專利名稱：一種治療眼睛血管增生的蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質，具體涉及一種用于治療眼睛血管增生的蛋白質。
背景技術：
致盲的原因有多種，由于各種原因導致眼睛的血管增生是主要的致盲原因之一。 引起眼睛的血管增生的常見病因有1、各種慢性進行性高血壓或動脈硬化以及視網膜靜脈炎等疾病并發的視網膜中央靜脈總干或分支阻塞和糖尿病視網膜病變等引起的視網膜大面積慢性毛細血管缺血、缺氧、產生血管生成因子，從而導致新生血管形成。2、早產兒視網膜病變，多見于過量吸氧。早產兒視網膜尚未發育完善，以周邊部最不成熟，處于高氧環境下，視網膜血管收縮、阻塞，使局部缺血、缺氧，誘發視網膜血管異常增生。3、滲出性年齡相關性黃斑變性、病理性近視等眼底退行性變性。大多位于后極部，是典型的脈絡膜毛細血管一玻璃膜一視網膜色素上皮復合體病變。玻璃膜連同色素上皮皸裂，脈絡膜血管增生并由皸裂處向視網膜神經上皮層下生長。4、各種原因所致的角膜損傷、潰瘍或炎癥引起的角膜或結膜血管增生。目前對于上述原因所致的眼睛的血管增生主要是采取中醫療法或激光等物理療法，但是療效不理想，尚沒有特效的抑制眼睛的血管增生的藥物。致使血管增生導致的盲癥還沒能得到有效的控制，而是隨著老齡人口的增加等原因，血管增生所致的盲癥呈增多之趨勢。當前，亟待于開發新的抑制眼睛血管增生的藥物。

發明內容
本發明的目的是提供一種治療眼睛血管增生的蛋白質。是通過DNA序列合成方法合成一段DNA序列，將這段DNA序列重組于畢赤酵母中表達，表達產物活性分析證明，所合成基因編碼的蛋白具有抑制血管新生和治療眼睛血管新生的功能。其核苷酸序列和它的氨基酸序列如序列表中所述。本發明的目的是通過以下技術措施實現I. DNA序列的合成設計如下DNA序列，并用套疊PCR方法進行其序列合成。將其序列命名為sin。ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGG CATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGG CTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTAT GCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCC GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA2. DNA序列編碼蛋白功能的證明(I) DNA序列重組于酵母中表達通過DNA內切酶和T4DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達載體PGAP9K的多克隆位點，將其表達載體命名為pGAP9K-sin(附圖I)。用電轉法將 pGAP9K-sin 轉化畢赤酵母 GSl 15，獲得工程菌 GSl 15 (pGAP9K_sin)。用 BMGY-BMMY 發酵 GS115 (pGAP9K-sin)誘導表達 Sin 蛋白。(2)表達產物活性分析發酵液上清過Ni-Agarose His標簽蛋白純化柱進行純化(附圖2)，收獲的含目標蛋白的液體經過抽濾除鹽后，進行抑制抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成試驗，制成眼藥水進行治療大鼠視網膜血管增生模型和治療猴子血管新生模型。結果是Sin蛋白抑制雞胚絨毛尿囊新生血管生成，其對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用強于Angiostatin (附圖3)， 顯著地抑制大鼠視網膜血管新生(附圖4)，能治愈猴子眼睛血管增生模型，具有治療眼睛血管新生的作用。利用上述蛋白質制備藥物，可用于治療人眼睛血管增生，是一種治療眼睛血管增生的藥物。本發明的優點本發明人工合成sin基因，將sin基因重組于畢赤酵母基因組進行表達獲得的Sin 蛋白，將表達產物純化后獲得的Sin蛋白能有效地抑制抑制雞胚絨毛尿囊膜血管新生，具有治療眼睛血管增生的功能。血管生成抑制因子在治療血管增生性疾病中有著重要的用途。雖然已發現的血管生成抑制因子有多種，但是本發明的血管生成抑制因子基因序列小， 分子量小的藥物有利于在機體內的傳輸，并且Sin蛋白抑制血管生成的作用較強。為生產特效的治療眼睛血管增生的藥物的研究和開發創造了必要的條件，具有重要的理論和實踐意義。


附圖I.構建含sin基因的畢赤酵母表達載體附圖2 發酵 GS115(pGAP9K-sin)表達 Sin 蛋白M.蛋白 Marker ；0. GS115 (pGAP9K)(負對照)；1. GS115 (pGAP9K_sin) ；2.純化的 Sin蛋白。附圖3. Sin蛋白抑制雞胚絨毛尿囊膜新血管生成試驗a. PBS ;B. Sin 蛋白(20 μ g) ；C. Angiostatin (20 μ g)附圖4. Sin蛋白抑制糖尿病大鼠的視網膜血管增生a.右眼(滴PBS) ；b.左眼(滴Sin蛋白)
具體實施例方式I. DNA序列的合成(I)設計如下DNA序列。ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGG CATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGG CTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTAT GCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCC GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(2)合成如下引物PI · 5，ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAG3，ρ2· 5’ TGTATCCACTCCAGAGTTTGTTCATGCCCACCGGGCACATGGGCTCCTGGTCCGTTTG3’
ρ3·5， TCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGAC3，ρ4· 5，GCATGGTGCTGAACCGCGCCAGGCAGGAGCCCGCCAGCCCCAGGTCCTGGTTGTGCGC3’ρ5·5， GGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTATGCCAGC3，ρ6·5，GGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCCAGTAGGACTTGTCGTTCCGGCTGGCATAGTAGCA6，ρ7·5， CACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACC3，ρ8·TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGA3，(3)用如下套疊PCR法進行以上序列的合成，其步驟是①應用Pl和ρ2引物進行PCR，獲得產物I。②用Ρ3和ρ4引物進行PCR擴增，獲得產物2。 ③用Ρ5和ρ6引物進行PCR擴增，獲得產物3。④用Ρ7和ρ8引物進行PCR擴增，獲得產物4。⑤以上獲得的底物1、2、3、4的混合物為底物，用引物Pl和ρ8進行擴增，獲得產物 5.(4)將以上PCR產物5進行DNA序列分析證明所獲的DNA序列與設計的一致ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGG CATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGG CTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTAT GCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCC GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA2.序列編碼蛋白功能的證明(I)DNA序列重組于酵母中表達及其表達產物的純化通過DNA內切酶和T4DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達載體PGAP9K的多克隆位點，將其表達載體命名為pGAP9K-sin(附圖I)。用電轉法將pGAP9K-sin轉化畢赤酵母63115，獲得工程菌63115( 64 91(-8丨11)。用YB)培養基發酵 GS115(pGAP9K-sin)表達Sin蛋白(附圖2)。將發酵液上清過Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒，獲得符合標準分子量的目標蛋白(附圖2)。(2) Sin蛋白活性分析將以上收獲的含目標蛋白的液體經過抽濾除鹽后，抑制人臍帶靜脈細胞增殖試驗和抑制雞胚絨毛血管生成試驗(附圖3)。證明純化的Sin蛋白具有抑制新生血管生成的活性。(3) Sin蛋白治療眼睛血管增生I)制備滴眼液滴眼液I :取Sin蛋白O. 5mg溶解于5ml生理鹽水(O. 85 % NaCl)，用孔徑為O. I μ m的濾膜過濾除去細菌及病毒，然后加于995ml無菌的生理鹽水中制備成滴眼液。
滴眼液2 取Sin蛋白O. 3mg溶解于5ml PBS溶液(每升PBS溶液的制備NaCl 8g，KCl O. 2g，Na2HPO4 I. 44g，KH2PO4 0. 24g溶解于800ml蒸餾水中鹽酸調pH到7. 4然后加水補充到1000ml，15磅20分高壓滅菌冷卻至室溫)，用孔徑為O. I μ m的濾膜過濾除去細菌及病毒，然后加于995ml無菌的PBS溶液中制備成滴眼液。2)滴眼液療效檢測實驗一①大鼠視網膜血管增生模型的制作取20只180克SD品系雄性大鼠，注射70毫克/公斤體重的鏈脲佐菌素，制備大鼠糖尿病模型。當大鼠的患糖尿病達3個月時，進行用藥治療。②滴眼液治療視網膜血管增生方法將以上制備的視網膜血管增生模型鼠分成兩組(A，B)，每組10只。A組鼠的左眼 (AL)滴實例I制備的滴眼液，每只眼睛滴25 μ I/次，每天3次；右眼(AR)滴生理鹽水，每只眼睛滴25μ I/次，用藥頻率同左眼；Β組鼠的左眼(BL)滴實例2制備的滴眼液，每只眼睛滴25 μ I/次，每天3次；右眼(BR)滴生理鹽水溶液，每只眼睛滴25 μ I/次，用藥頻率同左眼。治療時間為10周。③滴眼液治療視網膜血管增生的療效分析將以上20只試驗鼠處死，眼球摘除后放入多聚甲醛溶液中。C固定24h，先鏡下觀察視網膜的血管增生情況(圖4)，從圖4可見，滴Sin蛋白的左眼的血管數量明顯少于滴生理鹽水的右眼的血管的數量。然后，組織切片計算視網膜的血管內皮細胞核的數量。每只眼睛觀察20個視野，然后計算平均每個視野的內皮細胞核的數量(表I)。結果分析(表 2)表明與負對照組(AR和BR組)比較，試驗組的血管內皮細胞核數量呈非常顯著性減少(P < O. 01)。表I.用Sin蛋白治療眼睛血管增生結果血管內皮細胞核數量(個)/平均每個
視野
權利要求
1.一種治療眼睛血管增生的蛋白質，其特征在于編碼這種蛋白質的核苷酸序列是 atggtcagca tcggctacct cctggtgaag cacagccaaa cggaccagga gcccatgtgc 60 ccggtgggca tgaacaaact ctggagtgga tacagcctgc tgtacttcga gggccaggag 120 aaggcgcaca accaggacct ggggctggcg ggctcctgcc tggcgcggtt cagcaccatg 180 cccttcctgt actgcaaccc tggtgatgtc tgctactatg ccagccggaa cgacaagtcc 240 tactggctct ctaccactgc gccgctgccc cttaaggtcg acaagcttgc ggccgcactc 300 gagcaccacc accaccacca ctga324
2.一種治療眼睛血管增生的蛋白質，其特征在于這種蛋白質的氨基酸序列是Met Val Ser He Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp 151015Gln Glu Pro Met Cys Pro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly 202530Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Lys Ala His Asn Gln 354045Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr Met 505560Pro Phe Leu Tyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser 657075Arg Asn Asp Lys Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro 808590Leu Lys Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His 95100105His His
3.根據權利要求I所述的一種治療眼睛血管增生的蛋白質的核苷酸序列和權利要求2 所述的一種治療眼睛血管增生的蛋白質的氨基酸序列，其特征在于利用所述的核苷酸序列編碼的蛋白質制備治療眼睛血管增生的藥物和醫藥制品。
全文摘要
本發明涉及一種治療眼睛血管增生的蛋白質的核苷酸序列和氨基酸序列。是人工合成的DNA序列。具體核苷酸序列是序列表中1項下的序列，具體氨基酸序列是序列表中2項下的序列。將這一人工合成的DNA序列重組于畢赤酵母基因組，在畢赤酵母中表達重組蛋白，經過純化的這種蛋白質能效地抑制人血管內皮細胞增殖，能有效地治療眼睛血管增生。本發明為生產特效的治療眼睛血管增生的藥物的研究和開發應用創造了必要的條件，具有重要的理論和實際意義。
文檔編號A61K38/16GK102584954SQ20111031787
公開日2012年7月18日 申請日期2011年10月12日 優先權日2011年10月12日
發明者劉振旺, 張澤華, 張添元, 張愛聯, 沈錦城, 羅進賢 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所, 海南金寶正誠礦業有限公司