專利名稱：一種副豬嗜血桿菌lc株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品中副豬嗜血桿菌疫苗領(lǐng)域，特別涉及一種副豬嗜血桿菌LC 株，還涉及所述副豬嗜血桿菌LC株的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌parasuis, HPS)是一種 NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即輔酶I )依賴型、不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性細(xì)小桿菌， 屬于巴斯德菌科(Pastteurellacea)嗜血桿菌屬(Haemophilus)。HPS常引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜炎，由該菌引起的病又稱為豬革拉斯氏病。該菌是在1922年由 khermer和Ehrlich首次分離出來的，但是直到1992才通過SPF (Specific Pathogen Free，無特定病原體)豬證實(shí)HPS的致病性以及不同血清型菌株之間的毒力差異。據(jù)調(diào)查， HPS可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5周齡 8周齡的豬，發(fā)病率可達(dá)40%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%。HPS還可感染生產(chǎn)母豬，引起流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱仔等。隨著養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，豬場規(guī)模化、集約化程度的不斷提高，豬群飼養(yǎng)密度越來越大，副豬嗜血桿菌感染有明顯增加趨勢，已成為豬場保育豬發(fā)病和死亡的一個(gè)重要原因。另外，一些免疫抑制性疾病如豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等經(jīng)常與 HPS混合感染或繼發(fā)感染，對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也給副豬嗜血桿菌病的診斷和綜合防治帶來更多的難度。近年來，副豬嗜血桿菌病已在我國普遍流行，在我國的主要養(yǎng)豬區(qū)域如廣東、河南、湖北、湖南、山東、江西、河北、上海、吉林、四川、浙江、甘肅、江蘇等省份都有副豬嗜血桿菌病發(fā)生以及HPS分離鑒定的報(bào)道。而HPS的真實(shí)發(fā)病率可能為實(shí)際確診的10倍之多，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的威脅，已經(jīng)引起了政府和社會(huì)上的高度重視。由于HPS耐藥性現(xiàn)象越來越常見，常用的抗生素對副豬嗜血桿菌病已無明顯的療效，而且隨著人們對綠色食品需求的期望越來越高，抗生素在本病預(yù)防和控制等方面的應(yīng)用必將受到嚴(yán)格限制和逐步禁止，疫苗免疫成為預(yù)防和控制副豬嗜血桿菌病的主要措施。 由于HPS血清型較多，且不同血清型的菌株，其毒力與致病力差異較大，各個(gè)血清型之間免疫交叉保護(hù)力很低，不同地方分離的菌株具有較強(qiáng)的地方性特征，致使現(xiàn)有國內(nèi)外的副豬嗜血桿菌商品化疫苗不能對該病提供完全有效的免疫保護(hù)。因此發(fā)掘更多的交叉保護(hù)性好且免疫原性強(qiáng)的HPS并利用其研制高效的副豬嗜血桿菌疫苗是該病防控的迫切需要。Bak, Riising于2002年在《Veterinary record))上報(bào)道了一種血清5型副豬嗜血桿菌滅活疫苗，并評(píng)估了免疫豬群對同源和異源副豬嗜血桿菌0 parasuis)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)感染后其保護(hù)性免疫的形成。5 7周齡的豬群免疫2周后，同源攻毒(血清5型非疫苗株) 的保護(hù)率可達(dá)到80% (4/5);血清1型副豬嗜血桿菌攻毒的保護(hù)率可達(dá)40% (2/5);血清12 型副豬嗜血桿菌攻毒的保護(hù)率可達(dá)100% (5/5)；血清13型副豬嗜血桿菌攻毒的保護(hù)率可達(dá)75% (3/4)；血清14型副豬嗜血桿菌攻毒的保護(hù)率可達(dá)100% (5/5)。可見，該血清5型副豬嗜血桿菌滅活疫苗不僅可保護(hù)同源攻毒，還可為異源攻毒(血清1、12、13和14)提供部分保護(hù)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上現(xiàn)有國內(nèi)外的副豬嗜血桿菌商品化疫苗各個(gè)血清型之間免疫交叉保護(hù)力低、免疫原性不強(qiáng)的問題，本發(fā)明提供了一種免疫原性強(qiáng)的副豬嗜血桿菌LC株。本發(fā)明還提供了所述副豬嗜血桿菌LC株在制備各個(gè)血清型之間免疫交叉保護(hù)力強(qiáng)的滅活疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的
一種副豬嗜血桿菌OyaewoMih1S parasuis) LC株,其保藏編號(hào)為CGMCC No. 5257。所述的副豬嗜血桿菌(Jbemophilus parasuis) LC株在制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗中的應(yīng)用。優(yōu)選所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗為油乳劑疫苗或鋁膠疫苗。優(yōu)選所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗為鋁膠疫苗。所述鋁膠疫苗中含菌量彡2. 5 X IO9 CFU/mL。本發(fā)明的有益效果副豬嗜血桿菌LC株對豬有較強(qiáng)的致病性，且具有良好的免疫原性，應(yīng)用其制備的滅活鋁膠疫苗安全可靠，不僅能提供同源攻毒保護(hù)，還可為血清4型、5 型、10型、12型、14型和15型HPS等異源攻毒提供一定的交叉保護(hù)，免疫后能夠產(chǎn)生較強(qiáng)免疫力，接種豬群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，其免疫效果達(dá)到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有的商品化疫苗，具備了與國內(nèi)外同類產(chǎn)品競爭的優(yōu)勢，能夠有效預(yù)防副豬嗜血桿菌病的流行和傳播，降低本病造成的經(jīng)濟(jì)損失，有著廣闊的應(yīng)用前景。菌株保藏信息
保藏時(shí)間2011年9月17日，
保藏單位中國微生物菌株保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)， 保藏編號(hào)CGMCC No. 5257，
保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所， 分類命名副豬嗜血桿菌OyaewpoA/im parasuis).


附圖1為攻毒試驗(yàn)中腹腔注射不同劑量LC株菌液后仔豬體溫變化狀況。
具體實(shí)施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:
副豬嗜血桿菌(MaemophiIus ^araMi1S)LC株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 5257。生產(chǎn)用培養(yǎng)基
TSA培養(yǎng)基配制稱取4 g TSA粉末加入100 mL蒸餾水中，充分混勻后，121°C滅菌15 min,冷卻至50°C 60°C時(shí)，加入終濃度0. 001% NAD和5%新生牛血清，混合均勻后傾倒平板備用。TSB培養(yǎng)基配制稱取3 g TSB粉末加入100 mL蒸餾水中，121°C滅菌15 min。臨用前加入終濃度0. 001% NAD和5%新生牛血清，混合均勻后配制而成。
1. 1 HPS菌株的分離純化方法
從山東省聊城疑似副豬嗜血桿菌病的某大型養(yǎng)豬場選取病豬，無菌采集病豬的心包積液、胸腔積液、關(guān)節(jié)液和心血?jiǎng)澗€接種于含0.001% NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即輔酶I )和5%新生牛血清的TSA (Tryptic Soy Agar，胰蛋白胨大豆瓊脂)培養(yǎng)基上，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h 72 h，挑取圓形、光滑濕潤、無色透明的露珠狀小菌落革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陰性細(xì)小桿菌進(jìn)行劃線純培養(yǎng)。將純培養(yǎng)菌株分別劃線接種于鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板，同時(shí)水平劃線接種鮮血瓊脂平板后，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37°C培養(yǎng)M h 48 h，選取在鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板上不生長，但與金黃色葡萄球菌在鮮血瓊脂平板上共同培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)明顯的“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”且不溶血的微小菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。將進(jìn)一步純化培養(yǎng)的兩株菌株，分別接種于含NAD的微量生化反應(yīng)管，37°C培養(yǎng) 48 h，結(jié)果均為硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，吲哚試驗(yàn)陰性，脲酶試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和果糖，不發(fā)酵麥芽糖、半乳糖、木糖和甘露醇。該菌株根據(jù)其病豬的來源地命名為LC株。1. 2 16S rRNA基因序列測定與分析
1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)HPS 16S rRNA (GenBank No: M75065)序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5，-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3，，下游引物5，-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3，，該引物擴(kuò)增編碼16S rRNA長度約為822 bp的特異片段，引物由上海生物工程有限公司合成。1. 2. 2細(xì)菌DNA模板的制備將被檢菌株菌液5000 r/min離心5 min,棄上清液， 用無菌水重懸后，于沸水中煮沸10 min，-20°C凍結(jié)、融化后，10000 r/min離心5 min，取上清液作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1. 2. 3 PCR 擴(kuò)增將細(xì)菌 DNA 模板 3 μ , 10 倍 PCR 緩沖液 2. 5 PL、dNTP( 10 mmol/ L)0. 5 μ 、引物各 1 μ (10 Mmol/L)和 TaqDNA 聚合酶 0. 25 μ (5 U/μ )混合，加水至 25 PL，94°C預(yù)變性 5 min，94°C變性 30 s、58°C退火 30 s、72°C延伸 1 min，循環(huán)；34 次，最后 72°C延伸10 min, PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到822 bp大小的特異DNA條帶。 用DNA快速回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 4 16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與測序?qū)⒒厥盏腜CR產(chǎn)物與pMD19_T在16°C 連接30 min，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，37°C過夜培養(yǎng)12 h 16 h。挑取平板上的單菌落于氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中37°C過夜振蕩培養(yǎng)，次日應(yīng)用菌液PCR的方法擴(kuò)增16S rRNA基因篩選陽性克隆，鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒交由上海生工公司測序。LC株16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，與已發(fā)布的副豬嗜血桿菌相應(yīng)序列的同源性達(dá)到98. 5%以上。1.3 HPS LC株的血清學(xué)鑒定
將LC株分別密集劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20 h M h后，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗下菌落，將懸液稀釋至含菌量為3. OX IO9 CFU/mL，12rC高壓2 h，菌液7000 r/min 離心10 min，取上清用于瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的分型抗原。用生理鹽水配制1%的瓊脂糖凝膠，根據(jù)需要在相應(yīng)的瓊脂糖凝膠孔中加抗原和相應(yīng)的抗血清，以剛加滿孔為宜，濕盒內(nèi)37°C下放置M h 48 h，可見LC株于1型血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)清晰的白色沉淀線，故判定副豬嗜血桿菌LC株為血清1型。
1. 4動(dòng)物攻毒試驗(yàn)
1.4.1攻毒菌液的制備分別挑取HPS LC株單菌落密集劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37°C 培養(yǎng)12 h 16 h后，用PBS收獲細(xì)菌。將菌液涂布于TSA培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20 h后，用 PBS收獲細(xì)菌，并將菌液的活菌數(shù)調(diào)整為3. OX IO9 CFU/mL。1.4.2動(dòng)物攻毒試驗(yàn)結(jié)果取3周齡 4周齡健康易感仔豬40頭，隨機(jī)分成4 組，每組10頭，其中3組分別以1 mL、1. 5 mL和2mL三個(gè)不同劑量進(jìn)行腹腔注射LC株菌液 (3.0X109 CFU/mL)，另外1組注射滅菌生理鹽水2 mL作為對照。攻毒組大部分仔豬的體溫在攻毒第二天或第三天開始升高，持續(xù)三四天后，體溫逐漸恢復(fù)正常，如圖1所示；其還出現(xiàn)被毛粗亂、精神沉郁、食欲減退、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫大、跛行、甚至死亡等臨床癥狀；剖檢可觀察到其胸腹腔積液增多、胸腹腔內(nèi)粘連甚至出現(xiàn)纖維素性滲出物、心包積液增多甚至心包膜增厚有纖維素滲出物、全身淋巴結(jié)腫大、或后肢關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液增多甚至有膠凍樣滲出物。LC株的攻毒劑量越大，試驗(yàn)豬的最高體溫越高，死亡越快，其發(fā)病率和死亡率越大。 攻毒組仔豬的發(fā)病率和死亡率如表1所示。對照組仔豬的體溫?zé)o明顯變化，亦無發(fā)病和死亡。由于用1.5 mL菌液(3. OX IO9 CFU/mL)攻毒可使仔豬發(fā)病率達(dá)到80%，所以后面的LC 株攻毒試驗(yàn)選用1. 5 mL劑量。表1 LC株不同攻毒劑量仔豬的發(fā)病率和死亡率
權(quán)利要求
1.一種副豬嗜血桿菌(Memophilus parasuis)LC株，其特征在于其保藏編號(hào)為CGMCC No. 5邪7。
2.權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌OYa^oMiAz1S/^rawi^LC株在制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗為油乳劑疫苗或鋁膠疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗為鋁膠疫田ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述鋁膠疫苗中含菌量>2.5X109CFU/mLo
全文摘要
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品中副豬嗜血桿菌疫苗領(lǐng)域，特別涉及一種副豬嗜血桿菌LC株，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.5257。副豬嗜血桿菌LC株在制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗中的應(yīng)用。副豬嗜血桿菌LC株對豬有較強(qiáng)的致病性，且具有良好的免疫原性，應(yīng)用其制備的滅活鋁膠疫苗安全可靠，不僅能提供同源攻毒保護(hù)，還可為血清4型、5型、10型、12型、14型和15型HPS異源攻毒提供較好的交叉保護(hù)，免疫后能夠產(chǎn)生較強(qiáng)免疫力，接種豬群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，其免疫效果達(dá)到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有的商品化疫苗，具備了與國內(nèi)外同類產(chǎn)品競爭的優(yōu)勢，能夠有效預(yù)防副豬嗜血桿菌病的流行和傳播，降低本病造成的經(jīng)濟(jì)損失，有著廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102399724SQ20111034996
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者叢曉燕, 于江, 吳家強(qiáng), 張玉玉, 杜以軍, 王大鵬, 王金寶 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所