專利名稱：牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物成份的提取方法，具體的說是牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法。
背景技術：
隨著抗生素的廣泛應用，細菌結構、形態的變異，造成越來越多的細菌對抗生素產生耐藥性，且耐藥程度日益加強。目前將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染、乙型肝炎病毒HBV和艾滋病并列為世界范圍內三大難解決的傳染性疾病。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對多種抗生素均具有耐藥性，并且耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的致病力強且治療效果差，是引起醫院臨床感染的主要病原菌之一。在臨床上對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的感染雖然可用萬古霉素治療，近幾年來，萬古霉素被越來越多的醫院中視為常規抗生素類用藥之后，并且也逐漸出現耐藥性，目前，對于減緩耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥性增長速度，除通過限制濫用抗生素來減緩耐藥MRSA增長速度，同時必須研究開發新的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌所引起的疾病的藥物作為后備，以防出現耐甲氧西林金黃色葡萄球菌疾病的大爆發。因此篩選和開發能夠有效抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的抗生素迫在眉睫。牡丹籽在民間常用于治療腰腿疼痛，具有抗氧化、消炎止痛作用，牡丹籽作為潛在的藥用資源，有待深入開發利用。目前牡丹籽多用于育種，煉制牡丹油，其藥用價值尚未被得到開發。據前期研究發現顯示，牡丹籽油中主要含有亞麻酸，油酸，亞油酸，棕櫚酸和硬脂酸等油脂類物質；有關非油脂的化學成分有齊墩果酸，常春藤皂苷元，山奈酚，木犀草素，芹菜素，柯伊利素，豆留醇等物質，另外已知牡丹籽對枯草桿菌，沙門氏菌，根霉菌和黑曲霉菌和巴門氏菌有一定的抑菌作用，而抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的活性尚無相關報道。

發明內容
本發明針對上述問題的不足，提供從牡丹籽中提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法，其工藝簡單，操作方便，從牡丹籽中得到的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分含量高，純度高，抗菌效果顯著。本發明為解決上述問題所采用的技術方案是從牡丹籽中提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法，其具體步驟為
步驟一、按重量分數比取100份牡丹籽和300—400份濃度為60—80%的乙醇溶液，先將牡丹籽粉碎至200—400目的顆粒，在牡丹籽顆粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器內，進行密閉浸泡2— 5天，過濾，得到提取液I和濾渣I，備用；
步驟二、在含有濾渣I的容器內加入200—300份濃度為60—80%的乙醇溶液，混合均勻，進行密閉浸泡2— 3天，過濾，得到提取液II和濾渣II，將得到的提取液I和提取液II進行混合，得到混合液，備用；步驟三、按重量分數比取1份的混合液和8—16份的水，混合均勻，靜置2—5小時，抽慮得到上清液，備用；
步驟四、按重量分數比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取， 得到上層的萃取液I和下層的分離液I，備用；
步驟五、按重量分數比取1份分離液I和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液II，將萃取液I和萃取液II混合均勻，靜置，得到乙酸乙酯萃取物，備用；
步驟六、按重量分數比取1份乙酸乙酯萃取物和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到上層的萃取液III和下層的分離液II，備用；
步驟七、按重量分數比取1份分離液II和1飽和份正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液IV，將萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸發去除溶劑，得到產品。有益效果
1、在本發明中，找到一種新型抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份。2、在本發明中，通過對牡丹籽進行萃取，得到的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份提取物，其產率大于65%，經過檢測，具有抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的作用， 提高了牡丹的藥用價值。3、提高牡丹的經濟效益和藥用價值，對牡丹的綜合利用及牡丹產業的深加工開辟一條新途徑。4、本發明的操作工藝簡單、安全、可靠，可充分的應用于大規模生產中。


圖1為12小時藥敏觀察圖； 圖2為32小時藥敏觀察圖中標號萬1為濃度為5mg/mL的萬古霉素藥敏片，萬10為濃度為10mg/mL的萬古霉素藥敏片，青1為濃度為5mg/mL的青霉素藥敏片，青10為濃度為10mg/mL的青霉素藥敏片， 正15為濃度為5mg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份提取物的藥敏片，正15為濃度為lOmg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份的藥敏片。
具體實施例方式牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法，其具體步驟為 步驟一、按重量分數比取100份牡丹籽和300—400份濃度為60—80%的乙醇溶液，先
將牡丹籽粉碎至200—400目的顆粒，在牡丹籽顆粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器內，進行密閉浸泡2— 5天，過濾，得到提取液I和濾渣I，備用；
步驟二、在含有濾渣I的容器內加入200—300份濃度為60—80%的乙醇溶液，混合均勻，進行密閉浸泡2— 3天，過濾，得到提取液II和濾渣II，將得到的提取液I和提取液II進行混合，得到混合液，備用；
步驟三、按重量分數比取1份的混合液和8—16份的水，混合均勻，靜置2—5小時，抽慮得到上清液，備用；
步驟四、按重量分數比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取， 得到上層的萃取液I和下層的分離液I，備用；
4步驟五、按重量分數比取1份分離液I和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液II，將萃取液I和萃取液II混合均勻，靜置，得到乙酸乙酯萃取物，備用；
步驟六、按重量分數比取1份乙酸乙酯萃取物和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到上層的萃取液III和下層的分離液II，備用；
步驟七、按重量分數比取1份分離液II和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液IV，將萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸發去除溶劑，得到產品。實施例一
牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法，其具體步驟為 步驟一、按重量分數比取100份牡丹籽和300份濃度為60%的乙醇溶液，先將牡丹籽粉碎至200目的顆粒，在牡丹籽顆粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器內，進行密閉浸泡2 天，過濾，得到提取液I和濾渣I，備用；
步驟二、在含有濾渣I的容器內加入200份濃度為60%的乙醇溶液，混合均勻，進行密閉浸泡2天，過濾，得到提取液II和濾渣II，將得到的提取液I和提取液II進行混合，得到混合液，備用；
步驟三、按重量分數比取1份的混合液和8份的水，混合均勻，靜置2小時，抽慮得到上清液，備用；
步驟四、按重量分數比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取， 得到上層的萃取液I和下層的分離液I，備用；
步驟五、按重量分數比取1份分離液I和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液II，將萃取液I和萃取液II混合均勻，靜置，得到乙酸乙酯萃取物，備用；
步驟六、按重量分數比取1份乙酸乙酯萃取物和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到上層的萃取液III和下層的分離液II，備用；
步驟七、按重量分數比取1份分離液II和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液IV，將萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸發去除溶劑，得黃色浸膏，即為得到抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份的提取物，其提取物的產率為65%。實施例二
牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法，其具體步驟為 步驟一、按重量分數比取100份牡丹籽和350份濃度為70%的乙醇溶液，先將牡丹籽粉碎至300目的顆粒，在牡丹籽顆粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器內，進行密閉浸泡4 天，過濾，得到提取液I和濾渣I，備用；
步驟二、在含有濾渣I的容器內加入250份濃度為70%的乙醇溶液，混合均勻，進行密閉浸泡3天，過濾，得到提取液II和濾渣II，將得到的提取液I和提取液II進行混合，得到混合液，備用；
步驟三、按重量分數比取1份的混合液和12份的水，混合均勻，靜置3小時，抽慮得到上清液，備用；
步驟四、按重量分數比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取， 得到上層的萃取液I和下層的分離液I，備用；
步驟五、按重量分數比取1份分離液I和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液II，將萃取液I和萃取液II混合均勻，靜置，得到乙酸乙酯萃取物，備用；
5步驟六、按重量分數比取1份乙酸乙酯萃取物和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到上層的萃取液III和下層的分離液II，備用；
步驟七、按重量分數比取1份分離液II和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液IV，將萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸發去除溶劑，得到黃色浸膏，即得到抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份的提取物，其提取物的產率為67%。實施例三
牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法，其具體步驟為 步驟一、按重量分數比取100份牡丹籽和400份濃度為80%的乙醇溶液，先將牡丹籽粉碎至400目的顆粒，在牡丹籽顆粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器內，進行密閉浸泡5 天，過濾，得到提取液I和濾渣I，備用；
步驟二、在含有濾渣I的容器內加入300份濃度為80%的乙醇溶液，混合均勻，進行密閉浸泡3天，過濾，得到提取液II和濾渣II，將得到的提取液I和提取液II進行混合，得到混合液，備用；
步驟三、按重量分數比取1份的混合液和16份的水，混合均勻，靜置5小時，抽慮得到上清液，備用；
步驟四、按重量分數比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取， 得到上層的萃取液I和下層的分離液I，備用；
步驟五、按重量分數比取1份分離液I和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液II，將萃取液I和萃取液II混合均勻，靜置，得到乙酸乙酯萃取物，備用；
步驟六、按重量分數比取1份乙酸乙酯萃取物和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到上層的萃取液III和下層的分離液II，備用；
步驟七、按重量分數比取1份分離液II和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液IV，將萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸發去除溶劑，得到黃色浸膏，即得到抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份的提取物，其提取物的產率為70%。藥敏試驗
藥敏片的制備在濃度為5mg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份的提取物溶液、濃度為10mg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份的提取物溶液、濃度為 5mg/mL的萬古霉素溶液、濃度為10mg/mL的萬古霉素溶液、濃度為5mg/mL的青霉素溶液和濃度為lOmg/mL的青霉素溶液中放入直徑為6mm的藥敏紙片，浸泡M小時，制得濃度為 5mg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份提取物的藥敏片、濃度為10mg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份的藥敏片、濃度為5mg/mL的萬古霉素藥敏片、濃度為 10mg/mL的萬古霉素藥敏片、濃度為5mg/mL的青霉素藥敏片和濃度為10mg/mL的青霉素藥敏片，備用；
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的活化在無菌操作室中，按重量分數比取1份含 3. 2 X IO8CfuAiL的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌懸液和19份瓊脂糖培養基，混合均勻，將含有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的培養基倒入培養皿中，培養基的厚度為4一5mm，將含有培養基的培養皿放置30分鐘，備用；
抑菌實驗將制備好的濃度為5mg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份提取物的藥敏片、濃度為10mg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份的藥敏片、濃度為
65mg/mL的萬古霉素藥敏片、濃度為10mg/mL的萬古霉素藥敏片、濃度為5mg/mL的青霉素藥敏片和濃度為lOmg/mL的青霉素藥敏片分別放置在含有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的培養基中，在37°C條件下培養15小時后，觀察培養基中的抑菌圈；
結果發現，在培養12小時后觀察到，濃度為5mg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份提取物藥敏片的抑菌圈為IOmm ；濃度為lOmg/mL的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份藥敏片的抑菌圈為15mm ；濃度為5mg/mL的萬古霉素藥敏片的抑菌圈為15mm ；濃度為lOmg/mL的萬古霉素藥敏片的抑菌圈為20mm ；濃度為5mg/mL的青霉素藥敏片無的抑菌圈，而濃度為lOmg/mL的青霉素藥敏片有模糊抑菌圈；而在培養32小時后觀察到，在濃度為 lOmg/mL的萬古霉素藥敏片的抑菌圈上出現有單個耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的菌落，表明萬古霉素具有耐藥性，而抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成份提取物，具有顯著的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的作用，而且抑菌效果穩定，沒有耐藥性。
權利要求
1.牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法，其特征在于具體步驟為步驟一、按重量分數比取100份牡丹籽和300—400份濃度為60—80%的乙醇溶液，先將牡丹籽粉碎至200—400目的顆粒，在牡丹籽顆粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器內，進行密閉浸泡2— 5天，過濾，得到提取液I和濾渣I，備用；步驟二、在含有濾渣I的容器內加入200—300份濃度為60—80%的乙醇溶液，混合均勻，進行密閉浸泡2— 3天，過濾，得到提取液II和濾渣II，將得到的提取液I和提取液II進行混合，得到混合液，備用；步驟三、按重量分數比取1份的混合液和8—16份的水，混合均勻，靜置2—5小時，抽慮得到上清液，備用；步驟四、按重量分數比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取， 得到上層的萃取液I和下層的分離液I，備用；步驟五、按重量分數比取1份分離液I和1份乙酸乙酯溶劑，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液II，將萃取液I和萃取液II混合均勻，靜置，得到乙酸乙酯萃取物，備用；步驟六、按重量分數比取1份乙酸乙酯萃取物和1份飽和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到上層的萃取液III和下層的分離液II，備用；步驟七、按重量分數比取1份分離液II和1飽和份正丁醇溶液，放入分液漏斗中，進行萃取，得到萃取液IV，將萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸發去除溶劑，得到產品。
全文摘要
牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法，取牡丹籽和乙醇溶液混合，后密閉浸泡2—5天，得到提取液Ⅰ和濾渣Ⅰ，利用乙醇再次對濾渣Ⅰ進行浸泡，得到提取液Ⅱ，將兩次提取液混合，加水混合后，靜置得到上清液，用乙酸乙酯溶劑對得到的上清液進行兩次萃取，得到的兩次萃取液混合，后加入正丁醇飽和溶液，進行兩次萃取，將得到的兩次正丁醇萃取液混合，放置2—5天，得到產品。本發明的牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分的方法，其工藝簡單，操作簡單，從牡丹籽中得到的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物成分含量高，純度高，抗菌效果顯著。
文檔編號A61K131/00GK102362895SQ20111036831
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月19日 優先權日2011年11月19日
發明者劉普, 尹衛平, 李亮, 李文淵, 鄧瑞雪 申請人:河南科技大學