專利名稱：用于制造仿生結構的設備、工具包和方法
技術領域：
本發明涉及用于制造仿生結構的設備、工具包和方法。
背景技術：
傳統地，組織 工程學旨在將初始的細胞-骨架結構轉換成具有仿生功能的組織狀構造。此轉換過程通常包括在培養物中進行基于細胞的重建(重組，remodelling)。然而，在大多數情況中，基于細胞的重建已經證明較慢(通常需要花費數周的時間)、難以控制且昂貴、僅具有有限的組織生物人造材料或“組織”的能力(M. Eastwood等人，Cel. Motil.Cytoskel.，19984013 ；D. Huang 等人，Ann. Biomed. Eng.，199321289)。這可部分地歸因于與組織密度(例如，韌帶、真皮和肌肉中的組織密度)相關的灌注/缺氧的限制。通過細胞實際上如何產生特別天然的微結構(即，3D細胞基質組織)的有限理解來復合。材料成分以及更特別地生物人造的工程結構的3D納米微型(中位)尺度的結構對于其成功來說是關鍵的(R. A. Brown, in Future Strategies for Tissue and Organ Replacement (編輯J. M. Polak, L. L. Hench, P. Kemp), World Scientific Publishing,新加坡(2002) 48 ;R. A. Brown 等人，WoundRep. Reg. (1997) 5212)。已經用壓縮膠原凝膠來制造組織等同植入物。然而，已知的壓縮方法是不可再生產的或者不容易自動化。用于精確且可再生產地制造壓縮膠原凝膠的方法和設備對于制造用于治療和構建目的的人造組織來說是重要的。本發明涉及用于受控地可再生產地制造仿生結構的方法和設備的改進。這些仿生結構可用作人造組織，例如，在治療方法中以及在體外構建和篩選方法中可用作人造組織。本發明的一個方面提供了一種制造仿生結構的方法，包括( i)將凝膠溶液弓I入具有開口的孔(井狀件，well),(ii)培育凝膠溶液以形成凝膠，(iii)將柱塞引入孔，( iv)用柱塞壓縮凝膠，使得液體從凝膠排出，以及(V)移除柱塞，以在孔中留下仿生結構。凝膠可包括一種或多種膠凝聚合物。適當的膠凝聚合物包括天然膠凝聚合物(例如諸如膠原的蛋白質、層粘連蛋白、絲(silk)、纖維蛋白或彈性蛋白、諸如纖連蛋白的糖蛋白、例如甲殼質的多糖、或纖維素)、以及合成膠凝聚合物(例如有機聚合物(諸如聚內酯、聚甘氨酸(polyglycone)、聚己內酯和合成多肽)、以及無機聚合物(例如磷酸鹽玻璃))。在一些實施方式中，凝膠可包括兩種、三種或更多種膠凝聚合物。例如，凝膠可包括膠原和一種或多種如上所述的非膠原膠凝聚合物。在優選實施方式中，凝膠是膠原凝膠。一種制造仿生結構的方法可包括(i)將膠原溶液引入孔，(ii)培育膠原溶液以形成膠原凝膠，(iii)將柱塞引入孔，
(iv)用柱塞壓縮凝膠，使得液體從凝膠排出，以及(V)移除柱塞，以在孔中留下仿生結構。膠原是一種在間隙液體中包括膠原微纖維的水凝膠。膠原凝膠通常是各向同性的，并且膠原纖維隨機地定向。在包括膠原類型的膠原凝膠中可優選的形成天然微纖維的膠原類型是，1、I1、II1、V、V1、IX和XI以及這些的組合(例如，1、II1、V*I1、IX、XI)。優選地，使用天然的I型膠原。膠原凝膠可包括膠原，并且另一種非膠原膠凝聚合物包括天然的和合成的膠凝聚合物，如上所述。用來制造一層緊實凝膠結構的凝膠溶液(例如，膠原溶液或非膠原凝膠溶液)的初始體積將取決于制造方法以及壓縮結構的設計和預期用途。例如，凝膠溶液可具有0.1至IOml的體積，例如，1、2、3 、4或5ml。在一些優選實施方式中，可用2至3. 5ml的凝膠溶液來制造大約100至150i!m厚的壓縮結構。所使用的凝膠溶液的量取決于將制造的凝膠的高度和橫截面面積。例如，為了在6mm直徑的孔(28mm2)中制造具有3mm至IOmm的高度的凝膠，可使用0. 08ml至0. 28ml的凝膠溶液。為了在I IOmmX 75mm的孔中制造具有3mm至16mm的高度的凝膠,可使用24ml至132ml的凝膠溶液。在一些實施方式中，在允許膠原溶液或非膠原凝膠溶液固化成凝膠之前，可用細胞種植該膠原溶液或非膠原凝膠溶液。種植可出現在引入孔之前或之后。優選地，在凝膠形成之前，在適當的溫度、pH、離子強度和完全保持存活力的條件下執行凝膠溶液的種植。適當的細胞包括真核細胞，特別是高級真核細胞，例如植物細胞和動物細胞。在一些實施方式中，該細胞可以是哺乳動物細胞，例如，具有組織功能以及提供替換或便于修復內生組織的結構的細胞。例如，凝膠可包括一種或多種提供可收縮結構的肌肉細胞、提供導電元件的脈管和/或神經細胞、提供分泌結構的主動代謝分泌細胞(例如肝細胞、激素合成細胞、脂肪細胞、胰島細胞或腎上腺皮質細胞)、干細胞(例如骨髓源的細胞或胚胎干細胞、真皮成纖維細胞、皮膚角化細胞、(以及真皮成纖維細胞和皮膚角化細胞的組合層))、用于神經植入的施萬細胞、用于膀胱/尿道結構的尿道上皮和平滑肌細胞、以及用于骨骼和肌腱結構的骨細胞、軟骨細胞和腱細胞。在一些實施方式中，在凝膠中種植的細胞可包括成纖維細胞，例如鼠或人真皮成纖維細胞(包括新生真皮成纖維細胞)、以及人血管成纖維細胞。可在凝膠溶液中種植細胞，其可以是膠原或非膠原凝膠溶液，密度是IX IO3或IX IO4至IXlO6個細胞/ml，優選地，大約IXlO5個細胞/ml。可以任何布置方式在凝膠內分布細胞。例如，可在凝膠中均勻地分布細胞，或可在凝膠內的限定區域、范圍或層中分布細胞。可用標準液體處理技術將凝膠溶液引導至孔中。然后，可將凝膠溶液(其可以是膠原溶液或非膠原凝膠溶液，并可以可選地包含細胞)固化成凝膠。例如，將凝膠溶液(例如膠原溶液)固化成凝膠在本領域中是眾所周知的，典型地包括，例如加熱至36° C至38° C。例如，可通過在中性pH下、在大約37°下培育來引導膠原溶液聚合(聚集)成凝膠。種植的凝膠的平均密度(例如，種植的膠原凝膠的平均膠原密度)在壓縮之前可以是 0. 5 至 5mg/ml,優選地1. 5 至 4mg/ml。
在一些優選方法中，柱塞是多孔隙(porous)的。用多孔隙柱塞吸收在壓縮過程中從凝膠排出的液體。例如，柱塞可包括燒結的或非燒結的材料，例如塑料、纖維素(例如醋酸纖維素)、石膏、纖維網、金屬、或陶瓷。優選地，柱塞適于在其被引入時密封孔的開口，使得液體進入柱塞并且不會由于壓縮而從孔排出。在一些實施方式中，膠原或非膠原凝膠可具有單個FLS，FLS是與多孔隙柱塞接觸的表面，即，所有從凝膠排出的液體被引導通過與多孔隙柱塞接觸的凝膠表面，FLS0在凝固(setting，硬化，沉積，篩分)之后，利用柱塞使孔中的凝膠受到塑性壓縮。凝膠的塑性壓縮導致其變形并減小其體積，使得甚至在移除壓縮之后凝膠也能保持或基本上保持其新的體積。在W02006/03442 (Brown RA等人(2005) Adv. Funct.Mat. 15:176-177)中以及其它文獻中更詳細地描述了塑性壓縮。當對凝膠施加壓縮時通過其排出液體的凝膠的表面通常叫做流體離開表面(FLS)0可用通過FLS排出的液體的量、用FLS的每個單位表面積的塑性壓縮(即，Vj^mm3/Ap^mm2)來測量壓縮的程度。這可以是高度減小(以單位mm表示)。通過FLS排出的液體的適當的體積(用每個FLS單位表面積的塑性壓縮)可以是2至16. 5_，例如，3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15 或 16mm，優選地，是 2 至 14mm、2. 5 至 13mm、或 5 至 10mm。塑性壓縮可將凝膠的體積減小80%至99. 5%。例如，壓縮的凝膠可具有其原始體積的1%、2%、3%、4%或5%。在一些優選實施方式中，可排出凝膠中的液體的至少95%、96%、97%、98% 或 99%w/w。在一些實施方式中，在壓縮之后，可用細胞種植壓縮的凝膠結構(例如，壓縮的膠原或非膠原結構)的表面。`在壓縮和可選的種植之后，可在孔中的培養基中培育包含細胞的凝膠結構。適當的條件在本領域中是眾所周知的。培育的時長和條件將取決于預期用途。典型地，在結構的表面已經被種植的情況下，可一直培育該結構，直到在表面上形成匯合層為止，例如，培育1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或更多天。在一些實施方式中，可重復該方法，以制造多層結構。例如，一種方法可進一步包括(Vi)將另一凝膠溶液引至孔中的壓縮凝膠層上，(Vii)培育所述另一凝膠溶液，以形成另一凝膠，(viii)將多孔隙柱塞引入孔中，(ix)用柱塞壓縮所述另一凝膠，使得將液體從凝膠排出至柱塞中，(X)移除柱塞，以在孔中留下包括多層壓縮凝膠的結構。優選地，凝膠是膠原。一種方法可進一步包括(Vi)將另一膠原溶液引至孔中的壓縮膠原層上，(vii)培育該另一膠原溶液，以形成另一膠原凝膠，(viii)將多孔隙柱塞引入孔中，(ix)用柱塞壓縮該另一膠原凝膠，使得將液體從膠原凝膠排出至柱塞中，(x)移除柱塞，以在孔中留下包括多層壓縮膠原的膠原結構。可用細胞種植所述另一凝膠溶液(例如該另一膠原溶液)，該細胞可以是與原始凝膠溶液相同或不同的細胞。
在一些實施方式中，多孔隙柱塞可以是與在第一壓縮步驟中使用的相同的柱塞。在其他實施方式中，可對每個壓縮步驟使用不同的多孔隙柱塞。可將步驟(Vi)至(X)重復一次或多次，以制造包括多層壓縮凝膠的仿生結構，例如，多層壓縮I父原。可根據需求來制造非細胞種植和細胞種植的層的任何組合，例如，非細胞種植和細胞種植的膠原層。可在不同的層中種植不同的細胞類型。例如，可用相同或不同類型的細胞來種植兩層或多層壓縮凝膠。凝膠引入和壓縮的重復循環允許制造仿生多層組織。在一些實施方式中，柱塞可包括一個或多個凸起，其在壓縮凝膠的表面中壓印凹入部、凹袋(pocket，凹陷)或隱窩。適當的凸起可位于柱塞的接觸凝膠的表面(即，底面)上。這些壓印的微結構可用作支持特定細胞類型(例如干細胞)的生態位。該凸起可以與柱塞整體形成，并且該凸起可用與柱塞相同的材料或不同的材料制造，取決于應用場合，該材料可以是能滲透的或不能滲透的。可替換地，可在柱塞與凝膠之間插入包括一個或多個凸起的分離壓印部(stamp)，以壓印凹入部或隱窩。取決于應用場合，該分離壓印部可以是能滲透的或不能滲透的。 在一些實施方式中，柱塞或該單獨的壓印部可包括在壓縮凝膠的表面中壓印凹槽的一個或多個凸起。對于期望的應用，該一個或多個凹槽可具有任何適當的寬度、深度或長度。優選地，凹槽從壓縮凝膠的邊緣延伸，并且更優選地，凹槽在壓縮凝膠的2個或更多個邊緣之間延伸。在其他實施方式中，凹槽可以不延伸至壓縮凝膠的任何邊緣。該凹槽的寬度可以是至少I U m、至少10 u m、至少20 u m、至少30 u m、至少40 u m、或至少50 iim、并且，寬度可高達500 ii m、高達400 y m、高達300 y m、高達200 y m、或高達IOOum0本文所述的凹槽的適當寬度的范圍可具有這些最小值中的任一個與這些最大值中的任一個的組合。例如，適當的凹槽的寬度可以是I至500 V- m,優選地，I至300 u m。該凹槽的深度可以是至少I U m、至少5 u m、或至少10 u m、至少20 u m、至少30 u m、至少40iim、或至少50iim,并且，深度可高達500 y m、高達400 y m、高達300 y m、高達200 u m或高達100 u m。本文所述的凹槽的適當深度的范圍可具有這些最小值中的任一個與這些最大值中的任一個的組合。例如,適當的凹槽的深度可以是I至500iim，優選地，I至 300 u m。該凹槽的長度可高達110mm、高達80_、高達75_、高達50_、高達30_、高達20mm、高達10mm、或高達6mm,例如長度高達22mm。在一些優選實施方式中，凹槽可在壓縮凝膠上從一個邊緣延伸至另一個邊緣，從而可具有與壓縮凝膠的寬度、長度或直徑相對應的長度。在其他實施方式中，凹槽可以不延伸至壓縮凝膠的邊緣，或者可以延伸至壓縮凝膠的單個邊緣。該凹槽的長度可以是至少1011111、至少2011111、或至少5011111。本文所述的凹槽的適當長度的范圍可具有這些最小值中的任一個與這些最大值中的任一個的組合。例如，適當的凹槽的長度可以是IOiim至110mm。 壓縮凝膠的表面上的不同凹槽可具有相同或不同的尺寸。凹槽的深度和/或寬度可沿著其長度變化。這在制造封閉(enclosed)管道時可以是有用的，所述封閉管道的橫向橫截面面積(即，管道的寬度和/或高度)沿著其長度變化，例如，增加或減小。例如，管道可在多層結構的一部分中更窄和/或更淺，并在多層結構的其他部分中更寬和/或更深。通過柱塞或壓印部上的凸起的尺寸和布置來確定凹槽的尺寸和布置。例如，凹槽深度可以是凸起深度的25%至100%，并且凹槽寬度可以是凸起寬度的75%至100%，優選地是 100%。在一些實施方式中，可將壓縮凝膠的表面中的凹槽分成或分為多個單獨的凹槽。壓縮凝膠的表面中的多個單獨的凹槽可合并或連接在一起而形單個凹槽。可用另一層壓縮凝膠(例如，另一層壓縮膠原)覆蓋所述一個或多個壓印凹槽，以制造一個或多個封閉管道(即，有頂(roofed)的通道或微通道)。例如，可將另一凝膠溶液(例如另一膠原溶液)引導至具有一個或多個壓印凹槽的壓縮凝膠層的表面上。可培育該表面上的所述另一凝膠溶液，以形成另一凝膠，然后將其壓縮，例如，使用如上所述的多孔隙柱塞進行壓縮，以將液體從所述另一凝膠排出至柱塞中。該另一壓縮凝膠覆蓋所述一個或多個壓印凹槽，以產生包含一個或多個封閉的(或有頂的)管道或微通道的多層結構。該封閉的(或有頂的)管道或微通道可在多層結構的表面處包括至少一個開口。如上所述，可對該另一壓縮凝膠增加更多層的壓縮膠原或更多層的壓縮非膠原凝膠，以產生多層壓縮凝膠結構。該結構中的一層、兩層、三層、四層或更多層壓縮凝膠可包含壓印凹槽。例如，如本文所述地制造的仿生結構可在該結構中的壓縮膠原或非膠原凝膠的層中的10%或更多、25%或更多、50%或更多、75%或更多或100%中包括有頂通道。在一些實施方式中，多層仿生結構可包括一層、兩層、三層、四層或更多層無頂的通道。可通過根據仿生結構的期望特性改變柱塞或壓印部上的凸起的尺寸、數量、幾何形狀和布置來控制有頂通道的尺寸、數量、幾何形狀和布置。
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在一些實施方式中，柱塞或單獨的壓印部可包括一個或多個細長的凸起，該一個或多個細長的凸起壓印將多層仿生結構的不同層中的有頂通道連接的通道。提供有頂通道在提供包含可控尺寸、幾何形狀和方向的微通道的仿生結構時可以是有用的。微通道可改進仿生結構的特性(例如，通過增加仿生結構內的氧化來改進)和/或可在植入之后促進血管和神經元的向內生長。本發明的方法特別適合于同時在孔陣列中制造仿生結構。這在例如篩選時可以是有用的。下面描述用于制造包含仿生結構的孔陣列的適當的工具包和設備。在一些實施方式中，孔的底部可以是能滲透的。例如，諸如培養基的液體可通過該能滲透的底部進入孔。方便地，可通過膜限定孔的底部。例如，當需要將該結構的表面上的細胞暴露于空氣以引起仿生表型時，這可以是有用的。可將孔安裝在不能滲透的支撐部上，使得所述能滲透的孔底部不接觸支撐部。可將孔容納在支撐部的凹袋或凹入部中。這允許支撐部的凹袋或凹入部中的培養基接觸該結構，同時使該結構的上表面暴露于空氣。優選地，將孔彈性地安裝在支撐部上，使得，能滲透的孔的底部可在壓縮之前被驅動得抵靠所述不能滲透的支撐部，以防止將液體從凝膠通過所述能滲透的孔的底部排出。
例如，可將孔保持在彈性地安裝于支撐部上的安裝板中。安裝板可保持孔陣列，孔陣列可以是例如位于多孔(mult1-well，具有多個孔的)板中的多個單獨的孔或多個連接在一起的孔。可通過支撐部中的相對應的凹袋或凹入部的陣列來容納被保持在安裝板中的孔陣列。在壓縮凝膠之后，可移除柱塞以將壓縮凝膠留在孔中。在一些實施方式中，可使柱塞旋轉和/或傾斜，以幫助與壓縮凝膠的表面分離。在一些實施方式中，可在壓縮凝膠中引入密度梯度。例如，一種制造本文所述的仿生結構的方法可包括(i)將膠原溶液或非膠原凝膠溶液引導至孔，(ii)培育膠原或非膠原凝膠溶液以形成凝膠，其中，凝膠在第一區域的高度或深度比在第二區域的高度或深度大，(iii)將柱塞引導至孔，(iv)用柱塞壓縮凝膠，使得液體從凝膠排出，并且減小或消除凝膠在第一和第二區域處的高度或深度的差異，并且(v)移除柱塞以將所述仿生結構留在孔中，其中，相對于第二區 域，仿生結構在第一區域中具有增加的硬度或密度。在W02009/004351中描述了適當的用于引入密度梯度的方法。本發明的另一方面提供了一種用于制造仿生結構的工具包，包括柱塞，以及孔，具有開口，其中，柱塞包括多孔隙材料，并且柱塞適于在引導至孔時密封或部分地密封開口。柱塞和孔形成為適于使得當引入柱塞時密封或部分地密封孔的開口。在一些實施方式中，不通過用柱塞壓縮孔中的膠原或非膠原凝膠來將液體從孔排出。柱塞的多孔隙本體允許從膠原或非膠原凝膠排出的液體進入柱塞。多孔隙本體可以是剛性的或非剛性的，例如，其可表現出一些柔性或彈性。多孔隙本體由非燒結或燒結材料制成，例如，塑料材料、纖維素、石膏、金屬、密集纖維或陶瓷。柱塞可進一步包括支持多孔隙材料的不能滲透的支撐部。柱塞可包括連接器(例如銷釘或栓釘)，連接器附接至多孔隙本體并允許可釋放地附接至柱塞頭部。優選地，用不能滲透的材料制造連接器，例如用塑料材料(例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、或聚丙烯)或金屬制造，以防止柱塞的多孔隙部分中的液體進入柱塞支架。柱塞可適于壓縮包含于孔中的凝膠，并通過壓縮吸收從凝膠排出的液體。柱塞的在壓縮過程中接觸孔中的凝膠的表面可包括一個或多個凸起，該一個或多個凸起在孔中的膠原或非膠原凝膠的表面中壓印一個或多個凹入部、凹袋或凹槽。可替換地，工具包可進一步包括單獨的壓印部，該壓印部在其表面上包括一個或多個凸起或其他微結構。壓印部可插入在柱塞和凝膠之間，使得在用柱塞壓縮時通過壓印部在凝膠的表面上壓印一個或多個凹入部、隱窩、凹袋或凹槽。凸起可位于柱塞或壓印部的底面(即，當將柱塞引導至孔中時面向孔底部的表面)上，并且，其可以是可吸收的或不可吸收的。在一些實施方式中，柱塞可包括從柱塞的頂面中的孔口朝著柱塞的底面延伸的一個或多個通道。通道可完全延伸至底面或在朝向底面的路徑中的一部分中延伸。例如，通道可在朝向柱塞的底面的距離的70%、80%、90%或100%延伸。在一些實施方式中，通道可延伸至柱塞的底面中的孔口。當液體已從凝膠排出時，空氣或其他氣體或液體可通過一個或多個通道進入柱塞與壓縮凝膠的表面(即，流體離開表面)之間的界面。在一個或多個通道的末端處，流體可通過柱塞的底面中的孔口直接在凝膠上離開，或者，流體可進入通道末端附近的柱塞的底部并移動通過柱塞，以便在其底面離開。可迫使空氣或其他流體通過該一個或多個通道，以便于將柱塞與壓縮凝膠分離。工具包可包括驅動器(例如活塞)，驅動器驅動或迫使流體通過該一個或多個通道。驅動器可與柱塞分離或與柱塞整體形成。在一些實施方式中，可將從凝膠吸收的空氣和/或液體驅動得通過通道，并將其傳送至壓縮凝膠的表面。例如，在用柱塞吸收液體之后，可迫使空氣通過該一個或多個通道。可將此空氣通過柱塞的底面中的孔口直接傳送至壓縮凝膠的表面；或者，空氣可將在柱塞底部吸收的液體驅動回至壓縮凝膠的表面上；或者，可將空氣之后的吸收液體的組合傳送至壓縮凝膠的表面。柱塞可包括其他便于與壓縮凝膠分離的一個或多個特征。例如，柱塞沿著其外部可包括一個或多個縫隙(slot，狹槽)，所述一個或多個縫隙從柱塞的頂面延伸至底面，使得在引導至孔時，縫隙和孔限定從柱塞的頂部延伸至壓縮凝膠的表面的通道。這些通道允許空氣進入柱塞/凝膠界面并便于分離。柱塞可在其底面上包括紙或合成網的能滲透的外層。此層可寬松地或部分地附接至柱塞，并可便于空氣進入柱塞/凝膠界面。可通過將柱塞從外層移除或部分地移除、然后將外層從壓縮凝膠的表面移除，而將柱塞從孔移除。可通過一開始將外層在壓縮凝膠的邊緣或角部處與凝膠分離、然后從凝膠的剩余部分移除(例如，將其從邊緣或角部剝離)，而方便地移除外層。工具包可包 括多個柱塞。例如，可在托盤中設置柱塞陣列。托盤可以是一次性的，并可使柱塞在最上面具有連接器，以便于裝載。可將柱塞陣列快速且方便地從托盤裝入膠原或非膠原凝膠壓縮設備中的相應的柱塞陣列支架，以制造仿生結構。下面描述了適當的設備。孔可以是任何可容納柱塞的容器、凹袋或凹入部。孔可由任何適當的材料制成，例如，聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃、聚丙烯、金屬、或陶瓷。在一些實施方式中，該一個或多個孔可以是不能滲透的。在其他實施方式中，該一個或多個孔可以是能滲透的。例如，該一個或多個孔可具有能滲透的底部，例如膜。能滲透的孔可具有特殊的應用，例如，在空運(airlifting)中在孔中培養細胞時。在一些實施方式中，可將多個孔連接在一起。例如，工具包可包括連接孔的陣列。在一些實施方式中，工具包可包括多孔板。工具包可包括用于陣列中的每個孔的柱塞。如上所述，可在托盤中設置柱塞陣列，使得托盤中的每個柱塞與孔陣列中的孔相應。工具包可進一步包括導板。這在將孔與支撐部(例如，多孔板中的)整體形成的實施方式中可以是有用的。導板在壓縮過程中定位在支撐部上，并且導板包含與支撐部中的孔相應的孔口。例如，導板可包含與支撐部中的孔陣列相應的孔口陣列。導板中的孔口從頂部向底部向內逐漸變細，即，孔口在上表面處的內徑大于在下表面處的內徑，并且，直徑從上表面向下表面逐漸減小。在導板的下表面處，孔口優選地具有相對于支撐部中的孔相同或減小的內徑。在壓縮過程中，柱塞在上表面處進入導板的孔口，在該處，孔口的直徑最大。當柱塞移動通過孔口時，孔口的逐漸減小的直徑將柱塞引導至位于每個孔口下方的孔中。在其他實施方式中，工具包可包括多個單孔。優選地，使單孔逐漸變細，使得孔在開口處的內徑大于孔在底部處的內徑。這可將柱塞引導至孔的底部，并避免需要單獨的導板。孔可在其開口處包括凸緣，該凸緣允許孔擱置于安裝板上并防止其通過安裝板落下。工具包可進一步包括適于保持多個孔(例如，孔陣列)的安裝板或盒子，安裝板或盒子可以是連接的或單獨的。安裝板可包括孔口，每個孔口可容納一個孔。優選地，安裝板適于彈性地安裝在不能滲透的支撐部上，例如，使用可彈性變形的構件來安裝。安裝板可形成為適于使得，當定位在支撐部上時，安裝板可壓靠在支撐部上以驅動被保持在安裝板中的孔的底部抵靠支撐部。工具包可進一步包括不能滲透的支撐部，該支撐部適于支撐安裝板，使得被保持在安裝板中的孔(特別是能滲透的孔)不會接觸支撐部。該不能滲透的支撐部可包括容納被保持在安裝板中的孔的凹袋或凹入部。例如，支撐部可方便地是多孔板。工具包可進一步包括用于覆蓋被容納在安裝板中或與支撐部整體形成的孔的蓋。工具包可進一步包括用于制造`本文所述的仿生結構的試劑。試劑可包括膠原、非膠原膠凝聚合物、緩沖劑、營養混合物和培養基。可根據標準實驗室慣例，在適當包裝中的無菌條件下，供應工具包的柱塞、孔和其他部件。本發明的其他方面提供了用于制造本文所述的仿生結構的工具包，該工具包包括2個、3個、4個、5個或更多個從包括以下部件構成的組中選擇的部件柱塞(可選地位于一次性托盤中)、孔、安裝板(可選地具有蓋)、導板、不能滲透的支撐部(可選地具有蓋)、以及試齊U。適當的部件如上所述。工具包可適于在制造如上所述的仿生結構的方法中使用，并可在下述凝膠壓縮設備中使用。本發明的另一方面提供了一種用于制造仿生結構的凝膠壓縮設備，包括用于孔的底座，所述孔用于包含膠原凝膠，以及柱塞支架，用于接合柱塞，柱塞支架和底座可相對于彼此移動，使得將與支架接合的柱塞被驅動至底座中的孔中。該設備可用于壓縮膠原或非膠原凝膠。可與柱塞支架接合的柱塞可包括多孔隙本體和能滲透的支撐部。多孔隙本體可以是剛性的或非剛性的，并可能夠吸收在凝膠的壓縮過程中排出的液體，如上所述。該能滲透的支撐部可包括連接器(例如銷釘或栓釘)，連接器附接至多孔隙本體并可釋放地附接至柱塞支架。優選地，用不能滲透的材料(例如塑料材料(例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、或聚丙烯)，或金屬)制造連接器，以防止柱塞的多孔隙部分中的液體進入柱塞支架。適當的孔可以是任何開口容器，其容納柱塞，使得當引入柱塞時孔的開口被密封。柱塞和孔如以上更詳細地描述的。柱塞支架可適于可釋放地保持柱塞。例如，柱塞支架可包括容納柱塞的連接器的孔口，并使得柱塞通過支架中的摩擦而被保持。柱塞支架可進一步包括用于分離柱塞的釋放裝置。例如，柱塞支架可進一步包括探針，探針可移動通過孔，并將連接器從孔口移除，且將柱塞從支架釋放。柱塞支架可能夠朝著底座以及遠離底座移動，使得與支架接合的柱塞可進入和離開定位在底座中的孔。換句話說，柱塞支架可在第一位置和第二位置之間移動，在第一位置中，與支架接合的柱塞被容納在底座中的孔中，在第二位置中，柱塞不被容納在孔中。在一些實施方式中，柱塞支架可能夠在壓縮位置和裝載位置之間移動(例如可旋轉或可樞轉)，壓縮位置用于使被保持于柱塞支架中的柱塞與底座中的孔接合，裝載位置用于裝載和/或卸載由柱塞支架可釋放地保持的柱塞。柱塞支架可適于與柱塞陣列接合，或者更優選地，該設備可包括柱塞支架的陣列，每個柱塞支架與柱塞陣列中的一個柱塞接合。柱塞支架可對柱塞施加足夠的力，以在底座中的孔中壓縮膠原或非膠原凝膠。例如，柱塞支架可具有足夠的質量，以施加壓縮凝膠的重力。例如，為了在IOmm至22mm直徑的孔中壓縮膠原或非膠原凝膠，柱塞支架可具有5至IOOg的質量。在一些實施方式中，該設備可包括驅動器，驅動器對柱塞支架施加力，以將柱塞驅動至底座中的孔中。可使用一系列不同的驅動器。例如，驅動器可包括以下部件中的一個或多個能夠連接于柱塞支架的一個或多個重物；彈性件，例如，與柱塞支架接合的或能夠與柱塞支架接合的彈簧或彈性帶；電機，例如電動機；液壓系統，用于對柱塞施加流體壓力。驅動器施加至柱塞支架的力可以是可調節的。例如，可通過改變與柱塞支架接合的重物的數量、或通過調節彈性件的張力來調節壓機施加至柱塞支架的力。柱塞支架可與引導件相連，引導件便于將保持于支架中的柱塞與容納于底座中或與支撐部整體形成的孔接合。柱塞支架可被包含在柱塞頭部中，柱塞頭部適于可釋放地保持柱塞陣列。可將柱塞支架布置在柱塞頭部中，使得可通過位于底座中的孔來容納被接合在柱塞頭部中的支架中的每個柱塞。例如，底座可適于容納孔陣列，該孔陣列與由柱塞頭部中的柱塞支架可釋放地保持的柱塞陣列相對應。可在可釋放地附接至柱塞頭部之前將柱塞陣列保持在托盤或板中。該設備可包括裝載站，裝載站適于容納柱塞的托盤或板。裝載站還可適于容納廢料托盤，以在使用之后收集濕柱塞。柱塞頭部可能夠在壓縮位置、卸載位置以及可選的裝載位置之間移動(例如，可旋轉或可樞轉)，壓縮位置用于將接合在柱塞頭部中的柱塞驅動至底座中的孔中，卸載位置用于從柱塞頭部中的柱塞支架卸載使用過的柱塞，裝載位置用于將柱塞裝載到柱塞頭部中的柱塞支架中。例如，柱塞頭部可能夠移動至裝載位置，以將裝載站中的柱塞陣列可釋放地附接在頭部中的柱塞支架中。然后，柱塞頭部可能夠移動至壓縮位置，在該壓縮位置中，所附接的柱塞能夠與位于底座中的孔 接合。然后，柱塞頭部可能夠回到卸載位置，以釋放使用過的柱塞，該柱塞現在包含從凝膠排出的液體并可將其丟棄。可選地，可裝載一組新的柱塞。在一些實施方式中，柱塞頭部可安裝在立柱上，并且，其可圍繞立柱在裝載位置與壓縮位置之間樞轉。柱塞頭部可包括外引導件(例如彈性腿部)，當使用這些部件時，彈性腿部適于將安裝板驅動得抵靠支撐部。現在，外引導件還可以有利于允許在壓縮之前將柱塞頭部精確地定位在底座的上方。底座可適于容納孔陣列，每個孔容納柱塞陣列中的一個柱塞。底座可包括包含一個或多個凹入部的塊，孔或支撐部可如上所述地插入該一個或多個凹入部中。該塊可以是平坦的、或可包括適于容納孔陣列的凹入部陣列。方便地，該塊可容納多孔板，例如，12孔板或24孔板。安裝于該塊上的多孔板可本身用作支撐部，以將孔(例如各個孔)容納在如上所述的安裝板中。例如，當孔是能滲透的時，這可以是有用的。可替換地，安裝于該塊上的多孔板的孔可直接用來包含膠原或非膠原結構，如本文所述的。底座可進一步包括一個或多個加熱元件。這允許在用戶定義的溫度下(典型地大約37° C在底座中培育孔。這可有利于在壓縮之前固定膠原或非膠原凝膠，并且，必要時，可有利于在孔中執行后續的細胞種 植步驟。這允許該結構保持在底座中的孔中的原處(insitu)，直到完成生產中的所有所需步驟為止。該設備的壓縮站可進一步包括蓋，以覆蓋底座和容納于底座上的孔。該蓋可由任何剛性的、不能滲透的材料制成，并且，優選地是透明的。該蓋可用于在底座中保持適當的培育條件。該設備還可包括定時器。這可有利于對孔中的膠原或非膠原凝膠施加壓縮的持續時間的定時，或對培育和種植步驟的時間長度的定時。該設備可包括一個或多個顯示器，用于顯示施加至柱塞支架的力的持續時間和量、底座的溫度、以及培育和/或種植的持續時間。該設備可包括一個或多個警報器(例如，可視或聲音警報器)，其在凝固膠原或非膠原凝膠的培育周期或壓縮凝膠的壓縮周期已經過去時提供指示。如上所述的設備可包括與柱塞支架接合的柱塞和定位于底座上的孔。在一些實施方式中，該設備可包括柱塞陣列和孔陣列。該設備還可包括支撐部、安裝板和其他如上所述的消耗物。適當的柱塞和孔如上所述，并且，該設備可包括如上所述的工具包。在一些優選實施方式中，設備可包括單個站，底座在該單個站中保持固定，同時在定位于底座上的孔中制造仿生結構。可替換地，該設備可包括多個站，并且，包含孔(仿生結構在該孔中制造)的底座可能夠在這些站之間移動。每個站可在孔中的膠原或非膠原凝膠上執行不同的操作。對于高度自動化或批量生產的應用來說，這些生產線過程可以是優選的。用于操作多孔板中的試劑的自動裝置在本領域中是眾所周知的。底座可能夠在該設備中的第一站、第二站、以及可選的第三、第四、第五或更多個站之間移動。例如，底座可在分配站、培育站、和/或壓縮站之間移動，其中分配站用于對包含于底座中的孔添加試劑(例如，膠原溶液、非膠原凝膠聚合物溶液、細胞懸浮液、以及培養基)；培育站用于以固定溫度在孔中培育膠原或非膠原凝膠，例如，用于凝固膠原或非膠原凝膠聚合物溶液和/或培養細胞；壓縮站用于在孔中壓縮膠原或非膠原凝膠。底座可在這些站之間以直線的方式移動、或者可圍繞同一組站進行重復循環，例如，底座可可以在沿著旋轉分度系統定位的站之間移動。可使底座自動地在不同的站之間移動。多站系統的設計和控制在本領域中是眾所周知的。該設備在制造如上所述的仿生結構的方法中可以是有用的。在一些實施方式中，該設備可與在所述方法中如上所述的工具包一起使用。一設備可在制造如上所述的仿生結構的方法中使用。本發明的其他方面提供了在制造仿生結構的方法中使用如上所述的工具包和/或設備。適當的方法也如 上所述。本發明的其他方面提供了制造包含有頂微通道的仿生結構的方法。一種制造包括有頂通道的仿生結構的方法，該方法可包括(i)提供壓縮凝膠，在所述壓縮凝膠的表面上具有一個或多個凹槽，(ii)將另一膠凝聚合物溶液引導至該壓縮凝膠的表面上，(iii)固定該另一膠凝聚合物溶液，以形成另一膠原凝膠，以及；(iv)壓縮所述另一凝膠，使得從凝膠排出液體。在其他實施方式中，一種制造包括有頂通道的仿生結構的方法可包括(i)提供壓縮凝膠，在所述壓縮凝膠的表面上具有一個或多個凹槽，(ii)提供另一凝膠；并且執行以下任何一項操作；(a)壓縮所述另一凝膠，使得液體排出；以及(b)將壓縮的所述另一凝膠引導至壓縮凝膠的表面上，或者；(c)將所述另一凝膠引導至壓縮凝膠的表面上，以及(d)在壓縮凝膠的表面上壓縮所述另一凝膠。壓縮的所述另一凝膠形成封閉該一個或多個凹槽以形成管道或微通道的頂部。可用細胞種植壓縮凝膠和/或該另一膠凝聚合物溶液。在一些實施方式中，可通過用固體表面(例如，如上所述的柱塞或壓印部的表面，其包括一個或多個凸起)壓縮凝膠來提供壓縮凝膠，使得液體從凝膠排出，并且凸起在凝膠的表面中壓印一個或多個槽。固體表面可以是能滲透的或不能滲透的。適當的凸起和槽如上面所更詳細地描述的。可用任何傳統的方法來壓縮該凝膠和另一凝膠。例如，可使用上述方法，或在W02006/003442 或 Brown RA 等人(2005) Adv. Funct. Mat. 15:176-177 中描述的方法。可將步驟(i)至(iv)重復一次或多次，以制造包括多層壓縮凝膠的仿生結構，其包含一個或多個微通道。在優選實施方式中，該凝膠和另一凝膠是膠原凝膠，并且膠凝聚合物溶液是膠原溶液。如上所述，本發明的方法可有利于制造包括多層壓縮膠原的仿生結構，該結構包含可控尺寸、幾何形狀和方向的一個或多個微通道或管道，例如，用于再生藥用途。壓縮凝膠和仿生結構的尺寸取決于特定的用途。在一些實施方式中，可在壓縮之后模制、軋制、折疊或用其他方法成形該仿生結構。微通道或管道可例如增加仿生結構的中心氧化和灌注，并在植入之后促進血管和神經元的向內生長。如上所述的方法、工具包和設備還可用來使用非膠原凝膠制造非膠原仿生結構。例如，本發明的一個方面提供了一種制造仿生結構的方法，包括(i)將非膠原凝膠溶液引導至孔，(ii)培育非膠原凝膠溶液，以形成凝膠，(iii)將柱塞引導至孔，(iv)用柱塞壓縮凝膠，使得液體從凝膠排出，以及(v)移除柱塞，以將所述仿生結構留在孔中。凝膠溶液是包括膠凝聚合物的溶液。適當的非膠原膠凝聚合物如上所述。可通過改變條件(例如溫度)來引起凝膠溶液固化或凝固成凝膠。非膠原凝膠可包括一種或多種生物兼容的非膠原膠凝聚合物。適當的非膠原膠凝聚合物包括天然的膠凝聚合物，例如蛋白質(例如昆布氨酸、絲、纖維蛋白、纖連蛋白或彈性蛋白)、糖蛋白(例如纖連蛋白)、多聚糖(例如甲殼質或纖維素)、或合成膠凝聚合物(例如有機聚合物(諸如聚內酯、聚乙二醇、聚己內酯和合成多肽)、以及無機聚合物(例如磷酸鹽玻璃))。可以與膠原凝膠相同的方式使用非膠原凝膠來制造仿生結構，并且，已作必要的修正以將以上對膠原凝膠描述的方法和結構的所有特征和方面應用于非膠原凝膠。本發明的其他方面提供了一種基本上如本文所述的以及參考附圖的方法、工具包或設備。 對于本領域的技術人員來說，根據本公開內容，本發明的各種其他方面和實施方式將是顯而易見的。在本說明書中提到的所有文獻通過引用整體結合于此。這里使用的“和/或(并且/或者)”將作為兩個特定特征或部件中的每一個的特定公開，或者具有另一個特征或部件或沒有另一個特征或部件。例如，“A和/或B”將作為(i ) A、( ii ) B和(iii ) A和B中的每一個的特定公開內容，就如它們在本文中單獨地進行了
闡述一樣。除非上下文另外指出，否則以上闡述的特征的描述和定義不限于本發明的任何特殊方面或實施方式，并同樣可應用于所述所有方面和實施方式。除非上下文另外指出，否則術語“包括”表示包括特定特征且可選地包括其他特征。因此，該術語包含a) “包括但不限于”和b) “由…組成”或“包括并限于”。例如，“包括A的產品”將應視為特定公開了以下兩種(i )包括A的產品和(ii )僅由A組成的產品，就好像本文對這兩種情況下中的任一種進行了分別闡述一樣。現在將參考下述圖表，通過實例說明本發明的某些方面和實施方式。

圖1示出了本發明的方法的一個實例的示意圖。圖2示出了本發明的方法的另一實例的示意圖。圖3示出了一次性托盤中的可在本發明的工具包中使用的柱塞陣列。圖4示出了包含可在本發明的工具包中使用的整體孔的支撐部、以及用于覆蓋支撐部的孔的蓋和用于將柱塞引導至孔的導板。圖5示出了插入具有蓋的安裝板中的各個孔，該蓋可在本發明的工具包中使用。
圖6a和6g示出了執行本發明的方法的設備的示意圖。圖7示出了根據本發明的一個實施方式的設備的柱塞頭部的橫截面。圖8示出了根據本發明的一個實施方式的設備，其包括一線性組的處理站。站I是對系統提供新的多孔板的板堆疊站。站2是對板中的孔添加液體試劑的分配站。例如，該站可對孔分配膠原溶液、緩沖劑、營養物和細胞，或分配細胞懸浮液，例如以便在孔中結構的表面進行種植(接種，seed)。站3是培育(incubation)站,其將板中的孔保持在升高的溫度下(例如37° C)，以便使膠原溶液凝固在孔中或者以便培育該結構之中或之上的細胞。站4是柱塞裝載站，在該站處，將新的柱塞裝在設備的柱塞支架上以進行壓縮。站5是壓縮站，在該站處，用在站4裝載的柱塞來壓縮在站3處凝固在板的孔中的凝膠。站6是柱塞移除站，在該站處，卸載使用過的柱塞。圖9示出了如本文描述地用圖6和7所示的設備制造的仿生結構(橫截面)的蘇木精-伊紅(H&E)組織染色的結果。示出了用該設備同時在兩個單獨的孔中制造的仿生結構的橫截面。圖10示出了用不同尺寸的凸起壓印的雙層PC膠原結構中的有頂微通道的示意圖。比例尺20iim。箭頭示出了通道的開口。在圖1中示出了根據本發明的一個實施方式的制造仿生結構的方法。描述了在單個孔中制造結構，但是，可以相同的方式同時在孔陣列中制造該結構。在能夠保持24個柱塞的展示托盤(托盤，presentation tray) 3中設置在頂部上具有不能滲透的連接器2的多孔隙(porous)柱塞I (圖la#l)。

將托盤放在膠原壓縮設備(未示出)上，并迫使柱塞支架5的孔口 4與柱塞連接器2接觸(圖la#2 )。然后，升高包含保持柱塞的整個機構的柱塞頭部6，將保持在柱塞支架5中的柱塞I從托盤3升起(圖la#3)。然后,丟棄托盤3。將孔7 (其也可叫做插入物)放在安裝板8上的位置中。孔7的底部可以是多孔隙的。孔具有擱置于安裝板8的頂部上的凸緣10。將安裝板放在支撐部9上。支撐部9可以是多孔板。在圖la#4中用交叉剖面線示出支撐部9 ;安裝板8具有垂直剖面線；孔7具有實線輪廓。然后，在圖la#5中，用膠原溶液11填充孔7。可選地，可在將膠原溶液引導至孔7之前或之后，可用細胞對膠原溶液11進行種植。然后，用蓋12覆蓋包含孔7的安裝板8，并培育膠原溶液11以形成凝膠(圖la#6)。在圖la#6中以密集虛線示出了蓋12。然后，移除蓋12，并使柱塞頭部6在安裝板8上移動(圖lb#7)。降低頭部6，使得用外彈性引導件13將安裝板8固定就位。將柱塞I在孔7中的膠原凝膠14的上方保持在柱塞支架5中。然后，用將孔壓在支撐部9的底部的內彈性引導件15將孔7固定就位，從而，當使用具有能滲透的底部的孔7時，防止從孔7的底部排出液體。通過釋放柱塞支架5，使柱塞I朝著孔7的底部移動，柱塞支架5將柱塞I夾緊在其孔口(aperture) 4中。用止擋件18將柱塞支架5可移動地保持在柱塞頭部6內，止擋件限制柱塞支架5的移動(圖lb#7)，直到其被釋放為止(圖lb#8)。
柱塞支架5的向下移動將柱塞I朝著其孔7的底部移動，在孔7中壓縮膠原凝膠14，并吸收從其排出的液體(圖lb#9)。在壓縮之后，升高柱塞頭部6，以使保持在柱塞支架5中的柱塞I升高到孔7之外。釋放安裝板8，并使頭部6遠離包含壓縮后的凝膠16的孔7移動(圖lb#10)。然后，將蓋12放回到孔7上，以保持壓縮后的膠原16清潔并便于培育。然后，用穿過柱塞支架5的孔口 4的探針17從柱塞頭部6釋放柱塞I，并移出柱塞I的連接器2。然后，丟棄柱塞1，柱塞包含在壓縮過程中從凝膠14排出的液體。在圖2a和2b中示出了用于制造仿生結構的方法的另一實施方式。除了將孔7與支撐部9制成一體以外，該方法與圖1a和Ib中示出的方法相似(圖2a#4)。與圖1a和Ib不同，不需要單獨的孔和安裝板。可選地，可用導板來便于將柱塞適當地定位在其各自的孔中。在此實施方式中，柱塞I向下直接進入支撐部9中的孔7，并從而可表現出比與單獨的插入孔一起使用的直徑稍大的直徑。將膠原溶液11直接分配至支撐部9中的孔7中(圖2a#5)將蓋12直接放在支撐部9上，以在孔7中培育膠原溶液11，并導致其凝固以產生膠原凝膠(圖2a#6)。然后，移除蓋12，并使柱塞頭部6在支撐部9上移動(圖2b#7)。將柱塞I在孔7中的膠原凝膠14的上方保持在柱塞頭部5中。
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然后，用與柱塞止擋件18連接的內彈性引導件15將孔7固定就位。內彈性引導件15與支撐部9之間的接觸使柱塞支架5與柱塞止擋件18分離，并導致柱塞I朝著孔7的底部移動。通過止擋件18將柱塞支架5可移動地保持在柱塞頭部6內，所述止擋件限定柱塞支架5的向上和向下移動的程度(圖2b#8)。柱塞支架5的向下移動使柱塞I朝著孔7的底部移動，在孔7中壓縮膠原凝膠14并吸收從其排出的液體(圖2b#9)。在壓縮之后，升高柱塞頭部6，以使保持在柱塞支架5中的柱塞I升高到孔7之外。釋放支撐部9，并使頭部6遠離包含壓縮后的凝膠16的孔7移動(圖2b#10)。然后，用蓋12覆蓋孔7，以保持壓縮凝膠16清潔并便于培育(圖2b#ll)。然后，用穿過柱塞支架5的孔口 4的探針17從柱塞頭部6釋放柱塞1，并移出柱塞I的連接器2 (圖2b#12)。然后，丟棄柱塞1，柱塞包含之前在壓縮過程中從凝膠排出的液體(圖2b#13)。在圖3中示出了用于壓縮孔陣列中的凝膠的柱塞I的陣列。通過柱塞I最上部的連接器2將柱塞安裝在一次性托盤3中，托盤定位柱塞I以用于裝載到膠原壓縮設備的柱塞支架上。在圖2中示出了不能滲透的支撐部9。將孔7的陣列與支撐部9制成一體。在培育和儲存過程中，用蓋12覆蓋孔7。在壓縮過程中，可用導板28覆蓋孔7。導板28包含孔口陣列，該孔口陣列與支撐部9中的孔7對應。使孔口 29逐漸變細，S卩，孔口在導板的上表面30處的內徑比在導板的下表面處的內徑大。在導板的下表面處，孔口 29具有與支撐部9中的孔7相同的內徑。當柱塞向下進入支撐部9的孔7中時，導板28引導柱塞。在圖5中示出了各個孔7的陣列。孔7逐漸變細，使得開口 32處的內徑比孔33的底部處的內徑大。將孔7安裝在安裝板8中的孔口 31中。孔7的凸緣10擱置于安裝板8上，并防止孔7穿過孔口 31掉下。在培育和儲存過程中，用蓋12覆蓋安裝板中的孔7。在圖6中示出了一種用于在孔陣列中同時制造仿生結構的設備的操作。一開始，設備19處于靜止狀態中，其中柱塞頭部被升高，并且未裝載消耗物(諸如柱塞或孔)(圖6a)。設備19包括柱塞頭部6，柱塞頭部樞轉地安裝在立柱25上，并可在壓縮站26與卸載站21之間移動。頭部6包含柱塞支架陣列(未示出)、以及彈性內引導件15和彈性外引導件13。壓縮站26包括底座20，其用于容納可由蓋12覆蓋的孔。底座20擱置于未示出的加熱板上，以對容納于底座20中的孔進行培育。該設備包含顯示器22以及控制器23，顯示器指示定位于底座中的孔的培育的溫度和持續時間，控制器允許調節這些參數。將可移除的廢料托盤21定位在卸載站21中。在第一階段中，對柱塞頭部6內的柱塞支架5裝載柱塞I。將容納柱塞I的陣列的托盤3定位在底座20上，并且將柱塞I的連接器2引入安裝在柱塞頭部6中的柱塞支架陣列(未示出)的孔口。連接器2與孔口的接合將每個柱塞I保持在其相應的柱塞支架5中，使得可通過柱塞頭部6將柱塞I的陣列從托盤3升高(圖6b)。在圖1和2的步驟I和2中也示意性地示出了此階段。然后，通過將柱塞頭部6圍繞立柱25樞轉以定位在廢料托盤21上，而將裝載有柱塞I的陣列的柱塞頭部6移到旁邊。將孔7定位在24孔陣列中的支撐部9上的安裝板8中，然后將孔引導至底座20。通過將柱塞頭部6定位在廢料托盤21上，使孔7可以用于引入膠原溶液；細胞的懸浮液；和/或其他試劑(圖6c)。在圖1和2的步驟3、4和5中也示意性地示出了此階段。在將裝載的柱塞頭部6定位在廢料托盤21上的同時，用膠原溶液(未示出)填充安裝托盤8中的孔7 (可選地，所述溶液種植有細胞)，并用蓋12覆蓋孔。然后，用加熱器(未示出)加熱被覆蓋的底座20中的 孔，并在37°C下進行培育，以使得膠原溶液凝固成凝膠(圖6d)。在圖1和2的步驟6中也示意性地示出了此階段。然后，從底座20移除蓋(未示出)，并使柱塞頭部6圍繞立柱25樞轉至孔7上的位置中，使得附接至柱塞支架(未示出)的柱塞I就緒，以用于插入板的孔7中(圖6e)。在圖1和2的步驟7中也示意性地示出了此階段。然后，閉鎖柱塞頭部6，使得通過柱塞頭部(未示出)而被加重的柱塞I位于每個孔7中的凝膠(未示出)上。柱塞I壓縮膠原凝膠(未示出)，并吸收通過壓縮而從凝膠排出的液體(圖6f)。在圖1和2的步驟8和9中也示意性地示出了此階段。然后，升高柱塞頭部6，使得柱塞I (其現在容納有從孔7中的壓縮凝膠排出的液體)從底座20中的孔7移除。在圖1和2的步驟10中也示意性地示出了此階段。然后，使容納有濕柱塞I的柱塞頭部6圍繞立柱25樞轉，并定位在卸載站24中的廢料托盤21上。然后，將濕柱塞I排到廢料托盤21中。壓縮膠原的孔7留在底座20中的安裝板8中的位置中，未用蓋覆蓋(圖6g)。此相當于圖1和2的步驟11至13。 在一些實施方式中，可移除廢料托盤21，并可用新的柱塞I裝載柱塞頭部6中的柱塞支架I。可對孔7中的壓縮膠原添加附加的膠原溶液，可選地，該附加的膠原溶液種植有細胞。然后，可重復圖6c至6g中示出的步驟，以在孔7中制造多層膠原結構。可重復該方法，直到孔中的結構具有期望數量的層的壓縮膠原為止。
在圖7中示出了用于制造圖6的仿生結構的設備19的柱塞頭部6的橫截面。通過連接器2與柱塞支架5內的孔口 4的摩擦接合，將柱塞I的陣列保持在柱塞支架5的陣列中。柱塞I示出為接觸孔7的陣列的底部，孔7的陣列被容納在定位于加熱底板27上的支撐部9上的安裝板8中。孔7未容納膠原。將柱塞頭部在底座上對齊，并且用外引導件13固定安裝板8。插鎖34將頭部固定就位。孔7在它們的開口處具有凸緣10，凸緣擱置于安裝板8上。在壓縮過程中，內引導件15將孔7固定在安裝板8上，并驅動孔7的底部抵靠支撐部9。從頭部6釋放各個柱塞支架5，并且柱塞支架在孔7中的柱塞I上施加重力。使探針17接合在每個柱塞支架5的孔口 4中，并且可使探針17向下移動以將連接器2移出，并在使用之后從柱塞支架5排出柱塞I。圖8示出了本發明的多站設備。包含孔的板可多次通過一個或多個站。例如，在板通過每個站之后，板可第二次通過分配站以用于中間細胞層，然后再次通過分配站以用于新膠原層，然后進行培育、柱塞添加、壓縮、以及柱塞移除。用蘇木精-伊紅(H&E)對用圖6和7所示的設備制造的仿生結構的橫截面染色。在圖9中示出了結果。用分配在整個該結構中的人真皮成纖維細胞(初始密度100，000個細胞/ml)觀察密集膠原結構，與皮膚的真皮層的解剖結構類似。這證明，通過本文描述的設備制造的結構是高度仿生的。通過使用多孔形式的單向流體流動的模板微模制來產生兩部分微通道。在第一階段中，在一層的表面中壓印凹槽。在下一個階段中，在這些凹槽的頂部上凝固一層新的膠原溶液，并將該層新的膠原溶液壓縮在第一層上以用作微通道“頂部”。此技術(制造“有頂的U通道”)允許簡單且快速地制造具有預成形通道的可控厚度的結構。發現該通道的尺寸為用于模制的模具或模板的可預測的比例。在所使用的條件下，該比例在20%和50%之間，并且對于75iim和125 iim深的壓印部，將通道典型地形成為25 y m和50至IOOiim寬、并高達30iim深(圖10)。就 地(in place)用活細胞形成壓縮膠原基質，活細胞生長并重建基質持續幾周時間，但保持通道。用在壓縮過程中堆積在模具周圍的緊實的、定向的膠原微纖維制造通道壁，以提供在培育中的堅固性。模板尺寸與最終產生的通道之間的關系的詳細研究已經表明，模制保真度對模具形狀和膠原密度敏感。這些結果證明，可用具有模制和多層的塑性壓縮來產生具有良好灌注的高度可預測的U通道的、活的3D結構。
權利要求
1.一種制造仿生結構的方法，包括 (i )將凝膠溶液弓I入具有開口的孔， (ii)培育所述凝膠溶液以形成凝膠， (iii)將柱塞引入所述孔， (iv)用所述柱塞壓縮所述凝膠，使得液體從所述凝膠排出，以及 (v)移除所述柱塞，以在所述孔中留下所述仿生結構。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，在將所述柱塞引入所述孔時，所述柱塞密封所述孔的所述開口。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中，所述柱塞是多孔隙的，并將液體從所述凝膠排出至所述柱塞中。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，對于所述柱塞的接觸所述凝膠的每單位表面積，從所述凝膠排出至所述柱塞中的液體的量是2至14_。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，用細胞種植所述凝膠溶液。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，在培養基中培育壓縮凝膠層。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，進一步包括 (vi)將另一凝膠溶液引入到所述孔中的所述仿生結構上， (vii)培育所述另一凝膠溶液，以形成另一凝膠， (viii)將多孔隙柱塞引入所述孔， (ix)用所述柱塞壓縮所述另一凝膠，使得液體從所述凝膠排出， (x)移除所述柱塞，以在所述孔中留下包括多層壓縮凝膠的仿生結構。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，用細胞種植所述另一凝膠溶液。
9.根據權利要求7和8中任一項所述的方法，包括將步驟(vi)至(X)重復一次或多次，以制造包括多層壓縮凝膠的仿生結構。
10.根據權利要求9所述的方法，其中，用相同或不同類型的細胞來種植所述多層中的兩層或更多層。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述柱塞包括一個或多個凸起，所述一個或多個凸起在所述壓縮凝膠的表面中壓印凹入部。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述一個或多個凸起在凝膠的表面中壓印凹槽。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，步驟(iv)包括用所述柱塞壓縮所述凝膠，使得在所述壓縮凝膠的表面中壓印一個或多個凹槽。
14.根據權利要求12或權利要求13所述的方法，其中，步驟(ix)包括用包括適于在凝膠的表面中壓印凹槽的一個或多個凸起的柱塞壓縮所述凝膠，使得在所述另一凝膠的表面中壓印一個或多個凹槽。
15.根據權利要求12至權利要求14中任一項所述的方法，包括將步驟(vi)至(X)重復一次或多次，以制造包括多層壓縮凝膠的仿生結構， 其中，步驟(ix)的所述重復中的一個或多個包括用包括適于在凝膠的表面中壓印凹槽的一個或多個凸起的柱塞壓縮所述凝膠，使得在所述仿生結構中的所述多層壓縮凝膠中的一層或多層的表面中壓印一個或多個凹槽。
16.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，進一步包括用細胞種植所述壓縮凝膠的表面。
17.根據前述權利要求中任一項所述的方法，進一步包括在培養基中培育壓縮凝膠層。
18.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，在孔陣列中同時制造仿生結構。
19.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述孔的底部是能滲透的。
20.根據權利要求19所述的方法，其中，用膜限定所述孔的所述底部。
21.根據權利要求19或20所述的方法，其中，將所述孔安裝在不能滲透的支撐部上，使得所述能滲透的孔底部不接觸所述支撐部。
22.根據權利要求21所述的方法，其中，將所述孔彈性地安裝在所述支撐部上，使得所述能滲透的孔底部能夠被驅動得抵靠所述不能滲透的支撐部，以防止液體通過所述能滲透的孔底部從所述凝膠排出。
23.根據權利要求21至22中任一項所述的方法，其中，所述支撐部包括容納所述孔的凹袋。
24.根據權利要求21至23中任一項所述的方法，其中，將所述孔保持在彈性地安裝于所述支撐部上的安裝板中。
25.根據權利要求24所述的方法，其中，所述安裝板保持孔陣列。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，所述支撐部包括凹袋陣列以容納所述孔陣列。
27.根據權利要求25或26所述的方法，其中，所述孔陣列包括多個單孔。
28.根據權利要求25或26所述的方法，其中，所述孔陣列包括多孔板。
29.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述凝膠溶液是膠原溶液，并且所述凝膠是膠原凝膠。
30.根據權利要求29所述的方法，其中，所述膠原是I型膠原。
31.一種用于制造仿生結構的工具包，包括 柱塞，以及 孔，具有開口， 其中，所述柱塞包括多孔隙材料，并且所述柱塞適于在引入至所述孔時密封或部分地密封所述孔的所述開口。
32.根據權利要求31所述的工具包，其中，所述多孔隙材料是剛性的。
33.根據權利要求31或權利要求32所述的工具包，其中，所述柱塞適于壓縮被容納在所述孔中的凝膠并吸收從所述凝膠排出的液體。
34.根據權利要求31至33中任一項所述的工具包，其中，所述柱塞進一步包括保持所述多孔隙材料的不能滲透的支撐部。
35.根據權利要求31至34中任一項所述的工具包，其中，所述柱塞包括用于與柱塞支架可釋放地連接的連接器。
36.根據權利要求31至35中任一項所述的工具包，其中，所述柱塞包括一個或多個凸起，所述一個或多個凸起適于在所述孔中的凝膠的表面中壓印一個或多個凹入部。
37.根據權利要求36所述的工具包，其中，所述一個或多個凸起適于在所述凝膠的表面中壓印一個或多個凹槽。
38.根據權利要求31至37中任一項所述的工具包，包括多孔板。
39.根據權利要求31至38中任一項所述的工具包，包括多個單孔。
40.根據權利要求31至39中任一項所述的工具包，包括適于保持多個孔的安裝板。
41.根據權利要求31至40中任一項所述的工具包，其中，所述孔是不能滲透的。
42.根據權利要求31至40中任一項所述的工具包，其中，所述孔的底部是能滲透的。
43.根據當從屬于權利要求40時的權利要求42所述的工具包，其中，所述工具包包括適于支撐所述安裝板的不能滲透的支撐部，使得被保持于所述安裝板中的孔不接觸所述不能滲透的支撐部。
44.根據權利要求43所述的工具包，其中，所述安裝板適于彈性地安裝于所述不能滲透的支撐部上。
45.根據權利要求44所述的工具包，其中，所述安裝板安裝在能夠彈性變形的腿部上的所述支撐部上。
46.根據權利要求43至45中任一項所述的工具包，其中，所述安裝板適于使得當支撐于所述支撐部上時所述安裝板上的壓力驅動被保持于所述安裝板中的孔的底部抵靠所述支撐部。
47.根據權利要求43至46中任一項所述的工具包，其中，所述不能滲透的支撐部包括適于容納被保持于所述安裝板中的所述孔的凹袋。
48.根據權利要求47所述的工具包，其中，所述支撐部是多孔板。
49.根據權利要求31至48中任一項所述的工具包，用于在根據權利要求1至30中任一項所述的制造仿生結構的方法中使用。
50.一種用于制造仿生結構的凝膠壓縮設備，包括 用于孔的底座，所述孔用于容納凝膠，以及 柱塞支架，用于接合柱塞， 所述柱塞支架和所述底座相對于彼此能夠移動，使得與所述支架接合的柱塞被驅動到所述底座中的所述孔中。
51.根據權利要求50所述的設備，其中，所述凝膠是膠原凝膠。
52.根據權利要求50或權利要求51所述的設備，其中，所述柱塞支架適于可釋放地保持柱塞。
53.根據權利要求50至52中任一項所述的設備，其中，所述柱塞支架能夠朝著和遠離所述底座移動，使得與所述支架接合的柱塞被驅動進入和離開被容納于所述底座中的所述孔。
54.根據權利要求50至53中任一項所述的設備，包括柱塞支架陣列，每個柱塞支架均能夠與柱塞陣列中的一個柱塞接合。
55.根據權利要求50至54中任一項所述的設備，其中，所述柱塞陣列被容納在能夠移動的柱塞頭部中。
56.根據權利要求55所述的設備，其中，所述柱塞支架陣列布置在所述柱塞頭部中，使得能夠通過被定位在所述底座中的孔容納被接合在所述支架陣列中的每個柱塞。
57.根據權利要求50至56中任一項所述的設備，其中，所述柱塞頭部能夠在壓縮位置與卸載位置之間移動，所述壓縮位置用于將被接合于其中的柱塞驅動至所述底座中的孔中，所述卸載位置用于從所述柱塞頭部中的所述柱塞支架中卸載和可選地裝載柱塞。
58.根據權利要求50至57中任一項所述的設備，其中，所述底座包括包含一個或多個凹入部的塊，所述一個或多個凹入部用于容納一個或多個孔。
59.根據權利要求58所述的設備，其中，所述塊包括被布置為容納孔陣列的凹入部陣列。
60.根據權利要求50至59中任一項所述的設備，其中，所述底座進一步包括用于加熱所述底座中的孔的一個或多個加熱元件。
61.根據權利要求50至60中任一項所述的設備，包括用于覆蓋被容納于所述底座中的孔的蓋。
62.根據權利要求50至61中任一項所述的設備，包括定時器和/或顯示器。
63.根據權利要求50至62中任一項所述的設備，包括與所述柱塞支架接合的柱塞以及被容納于所述底座上的孔， 其中，所述柱塞包含多孔隙材料，并且所述柱塞適于在引入至所述孔時密封或部分地密封所述孔的所述開口。
64.根據權利要求63所述的設備，其中，所述多孔隙材料是剛性的。
65.根據權利要求63或權利要求64所述的設備，其中，所述柱塞包括一個或多個凸起，所述一個或多個凸起適于在凝膠的表面中壓印一個或多個凹入部。
66.根據權利要求65所述的設備，其中，所述一個或多個凹入部是凹槽。
67.根據權利要求50至66中任一項所述的設備，其中，所述設備進一步包括根據權利要求31至49中任一項所述的工具包。
68.根據權利要求50至67中任一項所述的設備,其中,所述底座在所述設備內是固定的。
69.根據權利要求50至68中任一項所述的設備，其中，所述底座在所述設備內是能夠移動的。
70.根據權利要求50至69中任一項所述的設備,用于在根據權利要求1至30中任一項所述的制造仿生結構的方法中使用。
71.根據權利要求31至49中任一項所述的工具包和/或根據權利要求50至69中任一項所述的設備在根據權利要求1至30中任一項所述的方法中的應用。
72.一種制造包括有頂通道的仿生結構的方法，包括 (i )提供壓縮凝膠，在所述壓縮凝膠的表面上具有一個或多個凹槽， (ii)將另一凝膠溶液引入到所述壓縮凝膠的所述表面上， (iii)使所述另一凝膠溶液凝固，以形成另一凝膠，以及； (iv)壓縮所述另一凝膠，使得液體從所述凝膠排出。
73.根據權利要求72所述的方法，其中，所述壓縮凝膠是壓縮膠原凝膠。
74.根據權利要求72或權利要求73所述的方法，其中，所述另一凝膠溶液是膠原溶液。
75.—種基本上如本文所述的以及參考附圖的方法、工具包或設備。
全文摘要
本發明涉及用于通過使用可以是多孔隙的柱塞在孔中塑性地壓縮諸如膠原凝膠的凝膠來制造仿生結構的設備、工具包和方法。該設備、工具包和方法允許以受控的且可再生的方式制造仿生結構，并且適于制造多層結構。
文檔編號A61L27/28GK103068963SQ201180039793
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月2日 優先權日2010年6月10日
發明者弗朗西斯·邁克爾·內維斯·祖扎特·塔利, 斯蒂芬·歐文, 邁克爾·黑德勒姆·珀澤, 羅伯特·布朗, 緹納·埃里克斯埃瓦 申請人:Ucl商業有限公司