具有酶敏感性連接的多核苷酸體內遞送偶聯物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及將RNA干擾(RNAi)多核苷酸體內遞送到細胞的組合物。所述組合物包括用酶可切割二肽-酰胺芐基-碳酸鹽掩蔽劑可逆修飾的兩親膜活性多胺。修飾掩蔽所述聚合物的膜活性，而可逆性提供生理應答性。所述可逆修飾的多胺(動態聚偶聯物或DPC)還共價連接RNAi多核苷酸或與靶向的RNAi多核苷酸靶向分子偶聯物共同給予。
【專利說明】具有酶敏感性連接的多核苷酸體內遞送偶聯物
【背景技術】
[0001]將多核苷酸和其他基本不能穿透細胞膜的化合物遞送到活細胞受到細胞復雜膜系統的限制。反義、RNAi和基因治療中使用的藥物是相對高親水性的聚合物，且通常帶較高負電荷。這些物理特征均嚴格限制其直接擴散穿過細胞膜?；诖嗽?，多核苷酸遞送的主要障礙是將多核苷酸遞送穿過細胞膜到達細胞質或細胞核。
[0002]一種已經用于體內遞送小核酸的方法是將所述核酸與小靶向分子或脂質或固醇結合。雖然已在這些偶聯物中觀察到一些遞送和活性，但這些方法需要的核酸劑量非常大。
[0003]還已開發大量轉染試劑，其能實現體外將多核苷酸相當有效地遞送到細胞。然而，用這些相同轉染試劑體內遞送多核苷酸很復雜且由于體內毒性、不利的血清相互作用和弱靶向而變得無效。體外作用良好的轉染試劑、陽離子聚合物和脂質，通常形成大的陽離子靜電顆粒并使細胞膜不穩定。體外轉染試劑的正電荷有助于通過電荷之間(靜電)的相互作用與核酸結合，因此形成核酸/轉染試劑復合物。正電荷還有益于載劑與細胞非特異性結合以及膜融合、去穩定化或破壞。膜的去穩定化有利于遞送基本不能滲透細胞膜的多核苷酸穿過細胞膜。雖然這些特性有利于核酸體外轉移，但它們會造成體內毒性和靶向失效。陽離子電荷與血清組分相互作用，導致多核苷酸轉染試劑相互作用的不穩定、較低的生物利用率和弱靶向。體外有效的轉染試劑膜活性在體內常導致毒性。
[0004]為了體內遞送， 載劑(核酸和結合的遞送劑)應較小，直徑低于lOOnm，優選低于50nm。低于20nm或低于IOnm的甚至更小復合物會更有用。大于IOOnm的遞送載劑體內很少能穿過血管細胞之外的細胞。靜電相互作用形成的復合物在暴露于生理鹽濃度或血清組分時傾向于聚集或瓦解。此外，體內遞送載劑上的陽離子電荷導致不良血清相互作用和因此造成弱生物利用率。有趣的是，高負電荷還會通過干擾靶向所需的相互作用來抑制靶向的體內遞送，即，靶向配體與細胞受體的結合。因此，體內分布和靶向需要接近中性的載劑。不經過仔細的調控，膜的破壞或去穩定活性在體內使用時有毒。用核酸遞送平衡載劑毒性體外比體內更容易實現。
[0005]Rozema等在美國專利公開20080152661中提供了使用雙取代馬來酸酐修飾可逆調控膜活性多胺的膜破壞活性的方法。由馬來酸酐和胺反應形成的馬來酰胺酸連接在體內遞送的合適PH范圍內是pH不穩定的。該方法使膜活性聚合物能用于體內遞送或核酸。我們目前提供修飾的具有二肽-酰胺芐基-氨基甲酸鹽連接的膜活性聚合物。所述二肽-酰胺芐基-氨基甲酸鹽連接是可逆且生理響應的。不同于通過雙取代馬來酸酐修飾形成的PH不穩定性馬來酰胺酸連接，本文所述的聚合物修飾劑連接生成在體內循環中更穩定的可酶促切割的連接。

【發明內容】

[0006]在一個優選的實施方式中，我們描述用于可逆修飾并抑制兩親性膜活性多胺的膜活性的掩蔽劑，所述掩蔽劑包括:連接二肽-酰胺芐基-碳酸鹽的位阻穩定劑或靶向配體，在本文中稱為二肽掩蔽劑或蛋白酶可切割的掩蔽劑。所述二肽掩蔽劑具有以下通式:[0007]R-A1A2-酰胺芐基-碳酸鹽。
[0008]式中，R是位阻穩定劑或靶向配體，A1是氨基酸，A2是氨基酸。所述掩蔽劑碳酸鹽和聚合物胺反應生成氨基甲酸鹽連接。所述掩蔽劑保持穩定，直到體內由內源蛋白酶切割二肽并因而從所述多胺切割位阻穩定劑或靶向配體。在二肽(A2和酰胺芐基之間)后的酶切割之后，所述酰胺芐基-氨基甲酸鹽自發重排，引起聚合物胺再生。優選R是中性的。更優選地，R不帶電。優選的位阻穩定劑是聚乙二醇(PEG)。靶向配體可選自:半抗原例如地高辛、維生素例如生物素、抗體、單克隆抗體和細胞表面受體配體。靶向配體可通過接頭(例如PEG接頭)連接二肽。優選的細胞表面受體配體是去唾液酸糖蛋白受體(ASGPr)配體。優選的ASGPr配體是N-乙酰半乳糖胺(MG)。優選的二肽由通過酰胺鍵連接疏水不帶電氨基酸的疏水氨基酸組成。優選的酰胺芐基基團是對酰胺芐基基團。優選的碳酸鹽是活化的胺反應性碳酸鹽。
[0009]在一個優選實施方式中，本發明涉及用于體內遞送RNA干擾(RNAi)多核苷酸到細胞中的組合物，所述組合物包括:掩蔽的兩親性膜活性多胺(遞送聚合物)以及RNAi多核苷酸，其中所述多胺通過用本文所述二肽掩蔽劑的可逆修飾來掩蔽。所述遞送聚合物可共價連接所述RNAi多核苷酸。用于共價連接所述遞送聚合物和RNAi多核苷酸的優選連接是生理不穩定連接。在一個實施方式中，該連接與所述二肽掩蔽劑連接彼此正交?；蛘?，所述遞送聚合物不與RNAi多核苷酸共價連接，而所述RNAi多核苷酸共價連接靶向分子。
[0010]在一個優選的實施方式中，我們描述某一組合物，所述組合物包括:兩親膜活性多胺，其與以下物質共價連接:a)通過二肽-酰胺芐基-氨基甲酸鹽連接共價連接多個靶向配體或位阻穩定劑；和b)通過一個或多個可逆連接共價連接一個或多個多核苷酸。在一個實施方式中，二肽-酰胺芐基-氨基甲酸鹽連接與所述多核苷酸可逆共價連接彼此正交。向哺乳動物給予含所述多核苷酸-聚合物偶聯物的藥學上可接受運載體或稀釋劑。 [0011]在一個優選的實施方式中，我們描述某一組合物，所述組合物包括:a)通過二肽-酰胺芐基-氨基甲酸鹽連接與多個靶向配體或位阻穩定劑共價連接的兩親膜活性多胺；和《與靶向基團共價連接的RNAi多核苷酸，所述靶向基團選自:具有20個或更多碳原子的疏水基團和半乳糖簇。在該實施方式中，所述RNAi多核苷酸不與所述修飾的兩親膜活性多胺共價連接。所述修飾的多胺和RNAi多核苷酸靶向基團偶聯物分開合成，并可在單獨容器或單一容器中提供。將溶于藥學上可接受運載體或稀釋劑的所述經修飾多胺和RNA多核苷酸靶向基團偶聯物聯合或分開地給予哺乳動物。
[0012]優選的二肽掩蔽劑包括蛋白酶(肽酶)可切割的二肽-對酰胺芐基胺-反應性碳酸鹽衍生物。本發明的蛋白酶可切割掩蔽劑具有與酰胺芐基活化的碳酸鹽部分相連的二肽。靶向配體或位阻穩定劑連接二肽的氨基末端。酰胺芐基活化的碳酸鹽部分連接二肽的羧基末端。適用于本發明的蛋白酶可切割接頭具有以下一般結構:
[0013]
【權利要求】
1.一種用于可逆修飾兩親膜活性多胺的化合物，所述化合物包括:共價連接二肽-酰胺芐基-碳酸鹽的位阻穩定劑或祀向配體。
2.如權利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有下式代表的結構:
3.如權利要求2所述的化合物，其特征在于，R4包括位阻穩定劑。
4.如權利要求3所述的化合物，其特征在于，所述位阻穩定劑是聚乙二醇(PEG)。
5.如權利要求2所述的化合物，其特征在于，所述靶向配體包括去唾液酸糖蛋白受體(ASGPr)配體。
6.如權利要求5所述的化合物，其特征在于，所述ASGPr配體選自:乳糖、半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖胺、N-甲?；肴樘前?、N-丙?；肴樘前?、N-正丁酰基半乳糖胺和N-異丁?；肴樘前?。
7.如權利要求1所述的化合物，其特征在于，X和Y是-NH-，而Z是
8.如權利要求7所述的化合物，其特征在于，Rl是-CH2-苯基。
9.如權利要求7所述的化合物，其特征在于，R2是-(CH2)3-NH-C(O)- NH20
10.一種體內遞送RNA干擾(RNAi)多核苷酸至細胞的遞送聚合物，所述遞送聚合物包括:
M1x-P- M2y
其中: P是兩親膜活性多胺， M1是通過二肽-酰胺芐基-氨基甲酸鹽連接與P連接的靶向配體， M2是通過二肽-酰胺芐基-氨基甲酸鹽連接與P連接的位阻穩定劑， y和z各是大于或等于零的整數，和 y+z的值大于多胺P上伯胺的50%，通過不存在任何掩蔽劑時P上的胺含量來測定。
11.如權利要求10所述的遞送聚合物，其特征在于，所述位阻穩定劑是PEG。
12.如權利要求10所述的遞送聚合物，其特征在于，所述靶向配體包括ASGPr配體。
13.如權利要求12所述的遞送聚合物，其特征在于，所述ASGPr配體選自:乳糖、半乳糖、N-乙?；肴樘前贰肴樘前贰-甲?；肴樘前?、N-丙?；肴樘前?、N-正丁酰基半乳糖胺和N-異丁?；肴樘前?。
14.如權利要求10所述的遞送聚合物，其特征在于，所述兩親膜活性多胺選自:隨機、嵌段或交替合成聚合物。
15.如權利要求10所述的遞送聚合物，其特征在于，所述兩親膜活性多胺是蜂毒肽。
16.如權利要求10所述的遞送聚合物，其特征在于，所述二肽-酰胺芐基-氨基甲酸鹽連接具有下式代表的結構:
17.如權利要求16所述的遞送聚合物，其特征在于，所述兩親膜活性多胺還共價連接所述RNAi多核苷酸。
18.一種體內遞送RNAi多核苷酸至哺乳動物內細胞的方法，所述方法包括:共同給予所述RNAi多核苷酸和如權利要求10所述的遞送聚合物至所述哺乳動物。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述RNA1-多核苷酸共價連接所述遞送聚合物。
20.如權利要求18所述`的方法，其特征在于，所述細胞是肝細胞或肝癌細胞。
【文檔編號】A61K31/675GK103491982SQ201180061179
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2011年12月28日 優先權日:2010年12月29日
【發明者】D·B·羅澤瑪, D·L·劉易斯, D·H·維基菲爾德, E·A·基塔斯, P·海德威格, J·A·沃爾夫, I·魯爾, P·莫爾, T·霍夫曼, K·楊-霍夫曼, H·M·穆勒, G·奧托, A·V·布羅金, J·C·卡爾森, J·D·本森 申請人:箭頭研究公司