專利名稱：依達拉奉的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及依達拉奉預防氧驚厥的用途。
背景技術：
氧驚厥又名驚厥型氧中毒或急性氧中毒，是人體吸入高分壓氧氣(高于200kPa) 一定時間后，神經細胞興奮性增加導致的臨床表現類似癲癇大發作的一種疾病。氧驚厥多發生在潛水活動中，發作時潛水員可出現全身強直性收縮以及陣發性痙攣，意識喪失，并伴有尿便失禁，潛水員往往失去控制而引起溺水或放漂等潛水事故，嚴重影響潛水員安全，極大地限制了使用氧氣輕潛水裝具執行水下軍事作戰任務、水下商業性潛水作業和科學考察等活動。此外，臨床高壓氧已經廣泛應用于治療減壓病、一氧化碳中毒、組織壞死和神經損傷等疾病，但也存在發生氧驚厥的風險，特別是對一些敏感者。因此，有效預防氧驚厥，最大限度地安全用氧，對軍事和民用潛水作業以及臨床高壓氧治療都具有重要意義。但是，目前所能采取的預防措施相當被動，主要依靠限制吸氧的壓力和時程預防氧驚厥發生，很大程度上限制了高分壓氧的應用。依達拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)是一種新型強效氧自由基清除劑及抗氧化劑，目前正廣泛用作治療腦卒中的一線急救藥物。至今未見抗氧化劑依達拉奉用于預防氧驚厥的報道。

發明內容
本發明要解決目前缺乏有效預防氧驚厥的藥物的技術問題，提供一種依達拉奉的用途，用于制備預防氧驚厥的藥物。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現一種依達拉奉的用途，用于制備預防氧驚厥的藥物。所述依達拉奉的給藥方式包括肌肉注射或靜脈滴注。所述依達拉奉藥物的劑型包括注射劑。本發明通過依達拉奉對氧驚厥首次放電潛伏期的影響實驗和依達拉奉對大鼠皮層和海馬中生化指標的影響實驗證明，依達拉奉能顯著抑制氧驚厥的發生，說明依達拉奉可以有效地預防氧驚厥，適用于開發氧驚厥的預防藥物。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明的氧驚厥發病機理及依達拉奉對氧驚厥的作用機理示意圖；圖2是本發明實施例1依達拉奉對氧驚厥FED潛伏期的影響實驗結果及腦電圖示例圖；圖3是本發明實施例2中依達拉奉對皮層和海馬組織中MDA的影響實驗結果圖；圖4是本發明實施例2中依達拉奉對皮層和海馬組織中H2A和NO的影響實驗結果圖；圖5是本發明實施例2中依達拉奉對皮層和海馬組織中抗氧化酶(S0D、GPx、CAT) 的影響實驗結果圖；圖6是本發明實施例2中依達拉奉對皮層和海馬組織中NOS的影響實驗結果圖。
具體實施例方式為了尋找有效預防氧驚厥的藥物，本發明通過多次反復實驗，終于發現依達拉奉預防氧驚厥的新用途。下面對氧驚厥的發病機理及依達拉奉的作用機理進行簡要闡述(如圖1所示)。氧驚厥的具體機制尚未明了，但已明確氧自由基(ROS)是其主要致病因素。氧驚厥的基本發病機制可概括如下在持續的高壓氧(HBO)暴露下，腦組織內的氧分壓(PO2)增高。增高的氧分壓一方面引起ROS增多，超過腦組織內超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶的抗氧化能力，神經細胞遭受氧化損傷， N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體受到激活，興奮性遞質增多，抑制性遞質減少，從而引發氧驚厥；另一方面，腦組織內的氧分壓增高后，一氧化氮合成酶(N0Q活性增高，L-精氨酸 (L-arginine)含量增高，從而導致一氧化氮(NO)含量增高。在NO的作用下，腦血管功能失調，血管擴張，腦血流增大，腦部的氧供增大，進一步增加腦內的氧分壓，引發氧驚厥。本發明經下述實施例證實，依達拉奉(Edv)通過清除R0S、提高抗氧化酶水平和抑制NOS活性，可以有效抑制高壓氧導致的腦組織脂質過氧化損傷，減輕神經細胞的氧化損傷，延長氧驚厥潛伏期，從而發揮預防氧驚厥的效果。本發明的下述實施例是在整體動物中預先給予一定量的依達拉奉，再進行氧驚厥造模，觀察依達拉奉預防氧驚厥的效果，再進一步研究依達拉奉對大鼠皮層和海馬組織中的脂質過氧化、ROS、NO、抗氧化酶以及NOS水平的影響。實施例1依達拉奉對氧驚厥首次放電潛伏期的影響實驗1)動物準備健康雄性SD大鼠，購于美國比凱公司，第二軍醫大學動物中心提供， 飼養至體重250士 IOg用于實驗。2)氧驚厥模型的制備將動物放入高壓氧艙后，首先用純氧以lL/s的氣流速度洗艙5min，同時監測氧氣濃度，待氧氣濃度> 99%后，以lATA/min的速度勻速加壓至6ATA后計時，保持壓力穩定，加壓及穩壓過程中持續換氣(0.3L/S)。暴露過程中，艙底鋪一層鈉石灰，以吸收動物呼出的CO2，艙內溫度保持在22 ^°C。3)動物分組SD大鼠12只，隨機分為生理鹽水對照組和依達拉奉:3mg/kg體重組。體重達標準后用于實驗。4)實驗步驟(1)腦電極植入大鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)，待大鼠完全麻醉后，固定于腦立體定位儀上。使其頭部頂部保持水平，用75%酒精棉球消毒皮膚，剪開頭頂部皮膚，分離皮下組織，剝離、刮掉骨膜，暴露顱骨。分別選定顱骨上適當位置，用顱骨鉆鉆出深度為 0. 5mm的小孔皮層電極，前囟后4mm，中線左旁開2mm ；參照電極，前囟后4mm，中線右旁開 2mm。將消毒后的電極短端植入小孔，用調好的磷酸鋅黏合劑將電極固定于顱骨，縫合皮膚。全過程均無菌操作。術后將大鼠繼續飼養3天，溫度對-261，濕度40-60%，自由進水和攝合
P5 O(2)給藥給藥組在高壓氧暴露30min前按;3mg/kg的劑量給予依達拉奉，腹腔注射。生理鹽水對照組給予等量的0. 9%生理鹽水，腹腔注射。(3)氧驚厥潛伏期測量用大鼠固定器將大鼠軀干固定，單獨置于加壓艙內，接好測腦電圖的電極，其中接地電極導線接于大鼠前額皮毛。打開生理記錄儀(P0WERLAB/8SP， AWnstrument公司，澳大利亞)，運行腦電記錄軟件。用純氧洗艙(lL/s)，待測氧儀顯示艙內氧濃度達到99%以上時，開始以lATA/min的速度勻速加壓至6ATA，保持壓力穩定，開始記錄腦電，持續暴露至腦電圖上出現首次放電(FED)及驚厥大發作，記錄FED出現的時間。 艙內溫度維持在22 ^°C。暴露結束后，以lATA/min的速度勻速減壓至常壓，出艙。結果如圖2所示，依達拉奉顯著延長FED潛伏期，表明依達拉奉可有效預防氧驚厥的發作。實施例2依達拉奉對大鼠皮層和海馬中生化指標的影響實驗1)動物準備及分組健康雄性SD大鼠，購于美國比凱公司，第二軍醫大學動物中心提供，飼養至體重250士 IOg用于實驗。將動物隨機分配到三組中，分別為正常對照組、生理鹽水對照組和依達拉奉組。正常對照組不做任何處理，生理鹽水組腹腔注射與依達拉奉等量的生理鹽水后進行高壓氧暴露，依達拉奉組腹腔注射依達拉奉(3mg/kg)后進行高壓氧暴露。高壓氧暴露生理鹽水組和依達拉奉組動物給藥30min后進艙，洗艙、加壓及穩壓過程同“實施例1”。暴露時間為20min。暴露結束后，以lATA/min的速度勻速減壓至常壓， 出艙。2)取材大鼠出艙后，腹腔注射過量戊巴比妥(100mg/kg)使大鼠安樂死，迅速斷頭，取出皮層和海馬組織，液氮冷凍后放入-80 V冰箱保存。3)腦組織中丙二醛(MDA)的測定取適當凍存的皮層和海馬，用Western及IP細胞裂解液(碧云天公司，江蘇)進行勻漿，組織重量占裂解液的比例為10%。勻漿完畢后用 BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司，江蘇)測定樣品的蛋白濃度。準備好MDA檢測試劑盒(碧云天公司，江蘇)后，在離心管內加入0. Iml勻漿液、裂解液或PBS等適當溶液作為空白對照，加入0. Iml不同濃度標準品用于制作標準曲線，加入0. Iml樣品用于測定；隨后加入0. 2ml MDA檢測工作液。混勻后，100°C或沸水浴加熱15min。水浴冷卻至室溫，IOOOg 室溫離心lOmin。取200 μ 1上清加入到96孔板中，隨后用酶標儀在532nm測定吸光度。計算出樣品溶液中的MDA含量后，通過單位重量的蛋白含量來表示樣品中的MDA含量。結果表明依達拉奉可顯著降低腦組織中MDA的水平(見圖幻，說明依達拉奉可抑制高壓氧導致的脂質氧化損傷。4)腦組織中H2A和NO的測定①H2A的測定取皮層和海馬，按照每IOmg組織加入200微升Wfestern及IP細胞裂解液(碧云天公司，江蘇)的比例進行勻漿。4°C約12000g 離心5min，取上清。先把過氧化氫檢測試劑在冰上或冰水浴上融解，在檢測孔或檢測管內加入50 μ 1樣品或標準品，然后在每個孔內加入100 μ 1過氧化氫檢測試劑。輕輕振蕩或敲打混勻，室溫放置30min。然后立即測定A560，最后根據標準曲線計算出樣品中過氧化氫的濃度。②NO的測定將組織樣品勻漿，12000g離心5min，取上清。用勻漿液把IOmmol/L KNO2稀釋成2、5、10、20、50ymol/L。準備好NO測定試劑盒(碧云天公司，江蘇)，按照說明書依次加入標準品、樣品和檢測試劑，室溫(25°C)孵育IOmin后測定A540。根據標準品曲線計算出樣品中NO的濃度。結果表明依達拉奉可顯著降低腦組織H2A和NO水平(見圖4)，說明依達拉奉可抑制高壓氧導致的脂質氧化損傷。5)腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶 (CAT)三種抗氧化酶的測定①SOD的檢測動物用生理鹽水(含0. 16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取皮層和海馬。取適量組織加入碧云天的Western及IP細胞裂解液(碧云天公司，江蘇)在冰浴中進行勻漿(組織濃度為10%)，4°C離心取上清。準備好SOD檢測試劑盒(碧云天公司，江蘇)，在96孔板中加入樣品和各種空白對照孔，加入酶工作液后充分混勻。37°C孵育20min，然后在450nm測定吸光度，計算出SOD酶活力。②GI3x的檢測樣品準備同SOD檢測。準備好試劑盒后，在離心管中依次加入檢測緩沖液、待測樣品和GI5x檢測工作液，混勻。加入4微升15mmol/L過氧化物試劑溶液后，用振蕩器適當混勻。在25°C下測定A340，每隔30秒測定一次，連續測定:3min。計算GPx酶活力。③CAT的測定取皮層和海馬，用Western及IP細胞裂解液(碧云天公司，江蘇)裂解組織(組織濃度為10%)，再加入等體積的過氧化氫酶檢測緩沖液稀釋樣品。準備好CAT檢測試劑盒(碧云天公司，江蘇)，先測定標準曲線。參考試劑盒說明書，取10 μ 1樣品至1. 5ml塑料離心管中，加入過氧化氫酶檢測緩沖液至體積為40微升，混勻。再加入10微升250mmol/L過氧化氫溶液，用移液器迅速混勻。25°C反應:3min。結束后加入450 μ 1過氧化氫酶反應終止液，顛倒混勻以終止反應。立即在另一塑料離心管內加入40 μ 1過氧化氫酶檢測緩沖液，再加入10 μ 1已終止并混勻的上述反應體系，混勻，從中取10 μ 1加入到96孔板中的一個孔內。加入200 μ 1 顯色工作液。25°C孵育20min后測定A520，計算CAT活性。結果表明，和對照組相比，依達拉奉可顯著提高腦組織中S0D、GPx、CAT三種抗氧化酶的水平(見圖幻，減輕神經細胞的氧化損傷。6)腦組織中一氧化氮合成酶(NOS)的測定動物用生理鹽水(含0. 16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取皮層和海馬。取0. Ig組織加9倍的生理鹽水0. 9ml制備成10% 組織勻漿，3000rpm離心lOmin。取上清50 μ 1測NOS活力。準備好NOS測定試劑盒(南京建成公司，南京)，Stnos(Snos)空白管、tnos測定管、iNos(誘導型nos)空白管和iNos 測定管，在測定管中加入雙蒸水、上清液和各種試劑，混勻，在530nm處測定各管的吸光度值，計算TNOS和iNOS值，cN0S(結構型N0S)值即為TNOS值與iNOS值之差。結果表明依達拉奉可顯著降低腦組織的TNOS和cNOS水平(見圖6)，減輕神經細胞及血管內皮細胞的氧化損傷。以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說， 在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
1.一種依達拉奉的用途，其特征在于，用于制備預防氧驚厥的藥物。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述依達拉奉的給藥方式包括肌肉注射或靜脈滴注。
3.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的劑型包括注射劑。
全文摘要
本發明公開一種依達拉奉的用途，用于制備預防氧驚厥的藥物。本發明依達拉奉能有效提高抗氧化酶水平、清除氧自由基、抑制一氧化氮合酶活性，降低一氧化氮含量，從而有效預防氧驚厥的發生，適用于開發氧驚厥的預防藥物。
文檔編號A61P25/08GK102552249SQ20121000227
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者劉書林, 徐偉剛, 李昱, 李潤平, 蔡志宇 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學