專利名稱：利用白蛋白-結合蛋白作為靶標的治療方法
技術領域：
本發明涉及用于治療癌癥以及其他疾病(包括組織和器官異常増殖、增生、重塑、炎性活性)的方法。本發明進一步涉及利用識別白蛋白-結合蛋白的合適配體用于靶向、顯影和測定哺乳動物腫瘤對化療劑的應答的方法。
背景技術：
已顯示白蛋白納米顆粒制劑減少不充分可溶的治療劑的毒性。例如，美國專利6，537，579公開了沒有毒性的乳化劑的白蛋白-納米顆粒紫杉醇制劑。以商標Taxol 由Bristol Myers Squibb銷售的抗癌劑紫杉醇目前批準用于數種癌癥，包括卵巣、肺和乳腺癌的治療。使用紫杉醇的主要局限性是其溶解度差。因此，丁￡叉01@制劑包含作為溶解賦形劑的む6111(^1101@￡し但該制劑中(；1'6111(^1101'@的存在與動物(Lorenz 等,Agents Actions 7,63-67,1987)和人中(Weiss 等,J. Clin. Oncol. 8,1263-1268,1990)嚴重的過敏反應有夫。因此，接受TaXOI 的患者需要以皮質類固醇(地塞米松)和抗組胺藥預先給藥以降低由于Cremophor 的存在而發生的過敏和過敏反應。相反，亦稱為ABI-007 的 Abraxane 為由 AbraxiS Oncology 銷售的，無Cremophor 的紫杉醇白蛋白-納米顆粒制劑。當用鹽水重制時白蛋白納米顆粒作為賦形劑的使用產生膠體形式?；谂R床研究，已表明Abraxane 的使用與TaxoI 相比以降低的過敏反應為特征。因此，接受Abraxane 的患者不需要預先給藥。白蛋白-納米顆粒制劑的另一個優點為通過排除有毒的乳化剤，可以比目前用Taxol 可能的更頻繁的時間間隔給予更高劑量的紫杉醇。存在的潛力為可在實體瘤中看到的由于下列原因而產生的增強的效力(i)更高的耐受劑量(300mg/m2)、(ii)更長的半衰期、(iii)延長的局部腫瘤有效性和/或(iv)體內持續釋放。Abraxane 降低過敏反應而維持或改善藥物的化療作用。已知< 200nm大小的膠體納米顆?；蝾w粒由于滲漏性脈管系統而易于在腫瘤部位集中。已對ー些脂質體制劑描述了該作用(Papahadjopoulos,等，Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 88，11460，1991) ； (Gabizon, A. , Cancer Res.，52，891，1992) ； (Dvorak,等，Am. J. Pathol. 133，95，1988) ； (Dunn,等，Pharm, Res.，11，1016-1022，1994);和(Gref,等，Science 263，1600-1603，1994)?？赡艿氖钱斉c該藥物以其溶解(含有Cremophor )形式給藥相比時，在腫瘤部位集中的紫杉醇納米顆?？梢鹚幬镌谠撃[瘤部位的緩釋而產生更大的效力。
所述納米顆粒 制劑包括至少約50%納米顆粒形式的活性剤。此外，所述納米顆粒制劑包含至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%納米顆粒形式的活性剤。另夕卜，所述納米顆粒制劑包含至少約95%或至少約98%納米顆粒形式的活性剤。酸性的、富含半胱氨酸的分泌蛋白(SPARC)，亦稱骨粘連蛋白(osteonectin)，為281個氨基酸的糖蛋白。SPARC對多種配體具有親和力，包括陽離子(例如，Ca2+、Cu2+、Fe2+)、生長因子(例如，血小板來源的生長因子(TOGF)和血管內皮細胞生長因子(VEGF))、細胞外基質(ECM)蛋白(例如，膠原I-V和膠原IX、玻連蛋白(vitronectin)和血小板反應蛋白-I)、內皮細胞、血小板、白蛋白和羥基磷灰石。SPARC表達受發育調控，并且主要在正常發育或損傷應答期間在經重塑的組織中表達(參見，例如，Lane等，FASEB J.，8，163-173(1994))。發育的骨和牙中表達高水平的SPARC蛋白。SPARC為數種侵襲性癌癥中上調的細胞基質蛋白，但在正常組織中缺乏(Porter等，J. Histochem. Cytochem.，43，791 (1995))。實際上，在各種腫瘤中(例如，膀胱、肝臟、卵巢、腎、消化道和乳腺)誘導SPARC表達。例如膀胱癌中，SPARC表達與晚期癌癥相關。已顯示T2級或更晚級的侵襲性膀胱腫瘤比Tl級膀胱腫瘤(或更次級淺表腫瘤)表達更高水平的 SPARC，并且預后較差(參見例如，Yamanaka 等，J. Urology, 166，2495-2499 (2001))。腦膜瘤中，SPARC表達僅與侵襲性腫瘤相關(參見例如，Rempel等 ，Clincal Cancer Res.,5, 237-241 (1999)) 0還在74. 5%的原位侵襲性乳腺癌病變中(參見例如，Bellahcene，等，Am. J. Pathol.，146，95-100 (1995))，以及54. 2%的乳腺浸潤管癌中(參見例如，Kim等，J. Korean Med. Sci.，13,652-657(1998))檢測到 SPARC 表達。SPARC 表達還與乳腺癌中常見的微鈣化有關(參見例如，Bellahcene等，上文)，提示SPARC表達可能負責乳腺轉移性病灶對骨的親和力。還已知SPARC結合白蛋白(參見例如，Schnitzer, J. Biol. Chem. , 269,6072(1994))?？贵w療法是用于控制疾病的有效方法，其中可鑒定特定的蛋白質標志物。實例包括 Avastin-抗-VEGF 抗體、Rituxan-抗-CD20 抗體和 Remicade-抗-TNF 抗體。因而，SPARC的抗體代表用于治療人和其他哺乳動物腫瘤、以及表達SPARC蛋白的其他増殖的、增生的、重塑和炎性病癥的重要治療劑。此外，與顯影或造影剤偶聯的SPARC抗體將是檢測和診斷所述病癥的工具。仍然存在治療人和其他哺乳動物腫瘤、以及其他増殖的、增生的、重塑和炎性病癥的方法的需要。另外，仍然存在測定人或其他哺乳動物腫瘤應答的需要以評估化療劑的有效性。此外，需要合適的方法以檢測和診斷所述病癥。根據在此提供的本發明的說明書，本發明的這些和其他的優點，以及另外的發明特征將是顯而易見的。

發明內容
本發明提供了用于測定哺乳動物腫瘤對化療劑的應答的方法，其中該方法包括步驟(a)從哺乳動物分離生物樣品，(b)檢測生物樣品中SPARC蛋白的表達，和(C)定量生物樣品中SPARC蛋白的量。本發明進一歩提供了利用白蛋白-結合蛋白作為療法，利用SPARC和SPARC的抗體或SPARC結合-蛋白作為療法，用于將化療劑遞送至哺乳動物疾病部位的方法，其中該方法包括給予哺乳動物治療有效量的藥物組合物，其中該藥物組合物包含與能結合白蛋白-結合蛋白的化合物偶聯的化療劑和藥學可接受載體。此外，本發明提供了包含與能結合SPARC蛋白的化合物偶聯的化療劑和藥學可接受載體的組合物。另外，本發明提供了包含SPARC識別基團和治療劑的遞送試劑，其中所述治療劑與SPARC識別基團偶聯。此外，本發明提供了用于將化療劑遞送至哺乳動物腫瘤的方法，其中該方法包括給予哺乳動物治療有效量的藥物組合物，其中該藥物組合物包含與能結合白蛋白的SPARC蛋白偶聯的化療劑和藥學可接受載體。本發明的組合物可以是小分子、大分子或蛋白質。


圖I圖解說明了 MX-I腫瘤異種移植物中染色的白蛋白和SPARC。圖2圖解說明了紫杉醇通過單層內皮細胞的轉胞吞作用。
發明詳述目前已發現包含白蛋白-結合蛋白的組合物存在另外的定位機制。白蛋白-結合蛋白，如SPARC、cubi I in和TGF β，可用于將治療劑靶向以白蛋白-結合蛋白的過表達為特征的疾病部位。本發明提供了與試劑偶聯的基團的用途，其中所述基團能結合白蛋白-結合蛋白，如SPARC、cubilin或TGFii，并且所述試劑為疾病的治療、顯影或遞送試劑，所述疾病中白蛋白-結合蛋白起著重要作用并且相對正常組織過表達。優選，白蛋白-結合蛋白選自SPARC、cubilin或TGFP。最優選，白蛋白-結合蛋白為SPARC并且結合白蛋白-結合蛋白的基團為SPARC識別基團。合適的SPARC識別基團包括但不限于，配體、小分子、抗體。本發明還提供了用于測定人或其他哺乳動物腫瘤對化療劑的應答的方法。該方法包括(a)從人分離生物樣品，(b)檢測生物樣品中SPARC蛋白的表達，和(C)定量生物樣品中SPARC蛋白的量。一旦確定腫瘤表達的SPARC的量，可例如通過將SPARC的表達與所給治療劑的劑量相關聯而確定化療劑的有效性。本發明還提供了 SPARC抗體作為疾病治療劑或顯影劑的用途，該疾病中SPARC起著重要作用并且相對正常組織過表達。在下文中，為簡單起見所有結合白蛋白的蛋白質(包括SPARC)稱為SPARC。SPARC蛋白負責某些人腫瘤中白蛋白的累積。由于白蛋白為化療藥物的主要載體，SPARC的表達水平為透過和保留在腫瘤中的化療藥物量的指示。因此，SPARC的表達水平為腫瘤對化療應答的預示。在本發明方法的上下文中可從目的哺乳動物分離任何合適的生物樣品。優選，如通過腫瘤活組織檢查從腫瘤分離生物樣品。或者，可從哺乳動物的體液，包括例如，腦脊液、血液、血漿、血清或尿液分離生物樣品。用于分離生物樣品的技術和方法為本領域技術人員所知。任何合適的藥物活性劑可用于本發明方法(例如，與SPARC識別基團偶聯的化療劑)，只要該活性劑的轉運或結合需要白蛋白。合適的活性劑包括但不限于，酪氨酸激酶抑制劑(染料木黃酮)、生物活性劑(TNF或tTF)、放射性核素(例如，mI、9°Y、mIn、211At、32P和其他已知治療放射性核素)、阿霉素、安沙霉素抗生素、門冬酰胺酶、博來霉素、白消安、順氯氨鉬、卡波氯氨鉬、亞硝脲氮芥、卡西他濱、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、環磷酰胺、喜樹堿、氮烯唑胺、放線菌素、柔紅霉素、右雷佐生、多烯紫杉醇、阿霉素、鬼白亞乙苷、埃博霉素、5-氟脫氧尿苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、異環磷酰胺、依立替康、環己亞硝脲、二氯甲二乙胺、巰嘌呤、m印lhalan、氨甲喋呤、雷帕霉素(西羅莫司(sirolimus))和衍生物、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亞硝基脲(nitrosurea)、紫杉醇、帕米膦酸鹽(pamidronate)、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、美羅華(rituximab、Q)20人鼠嵌合性單克隆抗體)、鏈脲霉素、鬼白噻吩苷、硫鳥嘌呤、三胺硫膦、紫杉烷、長春花堿、長春新喊、長春瑞賓、泰索(taxol,紫杉酌 )、考布他汀(combretastatins)、discodermolides、反鉬(transplatinum)、血管祀向試劑、杭-血管內皮細胞生長因子化合物(“抗-VEGF”)、杭-表皮生長因子受體化合物(“抗_EGFR”)、5-氟尿嘧啶和其衍生物。此外，該藥物活性劑可以是毒素如蓖麻毒A、放射性核素、抗體自身的Fe片段、單鏈抗體、Fab片段、雙抗體等等。所選的藥物活性劑本身可識別和結合SPARC或適當地附著于識別SPARC的SPARC識別基團，包括例如，蛋白質或非-蛋白質、抗體、抗體自身的Fe片段、單鏈抗體、Fab片段、雙抗體、肽或其他的非-蛋白質小分子。 可根據本發明的方法給予ー種或多種化療劑的ー種或多種劑量。本發明方法中化療劑的類型和數量取決于針對的特定腫瘤類型的標準化療方案。換言之，特定的癌癥可用単一化療劑常規治療，而另ー種可用化療劑組合常規治療。本領域中很好地描述了用于合適的療法、化學療法、放射性核素等等結合或聯合抗體或其片段的方法。本發明對其有效的疾病包括任何身體組織，包括軟組織、結締組織、骨、實體器官、血管等等中増殖、組織重塑、增生、擴大的傷ロ愈合的異常情況。通過發明的組合物能治療或診斷的疾病的實例包括癌癥、糖尿病或其他視網膜病、炎癥、關節炎、血管或人工血管移植物或血管內裝置再狹窄等等。根據本發明檢測和治療的腫瘤類型通常為人和其他哺乳動物中發現的那些。腫瘤也可以為接種的結果，如實驗動物中。人和其他動物情況中遇見腫瘤的許多類型和形式，并且并不試圖限制本方法對任何特定腫瘤類型或種類的應用。如已知的，腫瘤包括由不受控制的和漸進性的細胞分裂產生的異常組織塊，并且通常也稱為“瘤”。本發明方法可用于例如人中的腫瘤細胞和相關的基質細胞、實體瘤和與軟組織有關的腫瘤，如軟組織肉瘤。腫瘤或癌癥可位于口腔和咽、消化系統、呼吸系統、骨和關節(例如，骨轉移性病灶)、軟組織、皮膚(例如，黑色素瘤)乳腺、生殖系統、泌尿系統、眼和眼眶、腦和中樞神經系統(例如，膠質瘤)或內分泌系統(例如，甲狀腺)并且不一定限于原發腫瘤或癌癥。與口腔有關的組織包括但不限于，舌和口腔組織。癌癥可產生于消化系統組織中，包括例如，食管、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臟、膽囊和胰腺。呼吸系統的癌癥可影響喉、肺和支氣管并且包括例如，非-小細胞肺癌。腫瘤可產生于子宮頸、子宮體、卵巢外陰、陰道、前列腺、睪丸和陰莖中，其組成雌雄生殖系統，以及膀胱、腎、腎盂和輸尿管中，其包括泌尿系統。腫瘤或癌癥可位于頭和/或頸(例如，喉癌和甲狀旁腺癌)。腫瘤或癌癥也可位于造血系統或淋巴系統，并且包括例如，淋巴瘤(例如，惡性淋巴肉芽腫病和非-惡性淋巴肉芽腫淋巴瘤)、多發性骨髄瘤或白血病(例如，急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性粒細胞性白血病等等)。優選，腫瘤位于膀胱、肝臟、卵巣、腎、消化道、腦或乳腺。SPARC蛋白具有對多種配體的親和力。因此，本發明用于將治療劑遞送至疾病部位的方法以下列發現為基礎對SPARC具有親和カ的化合物或配體(包括白蛋白)可用于將治療藥物遞送至疾病部位，而幾乎沒有或不遞送至正常組織。本發明還提供了將治療組合物從血管轉運通過內皮屏障進入腫瘤間質組織的方法?？贵w療法和化療的主要障礙為轉移通過內皮屏障進入腫瘤間質組織。白蛋白利用白蛋白受體轉運機制而通過內皮屏障。該轉運機制與文獻報道的相同(gp60和albondin)或為其他未發現的機制。之前已報道背載于白蛋白上的治療劑表現出增強的腫瘤攝取(Desai, N.等 Increased endothelial transcytosis of nanoparticle albumin-boundpaclitaxel(ABI-007)by endothelial gp60receptors a pathway inhibitedby TaXO I ，27th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium(SABCS) (2004),摘要
#1071)。此外，通過內皮屏障的增強的轉移可利用生理的白蛋白轉運機制實現(Schnitzer，J. E. ；0h, P. J. Biol. Chem. 269，6072-6082 (1994))。
對于小分子，可進行改進以提高對白蛋白的藥物親和力。對于小分子制劑，可除去防止藥物結合白蛋白的溶劑?；蛘呷缫韵滤?，小分子可連接至白蛋白、白蛋白抗體、其片段或白蛋白-受體的配體。對于生物分子如蛋白質、抗體和其片段，可以用白蛋白結合肽設計改造該生物制劑而使得其呈現對白蛋白的親和力。肽可以為白蛋白結合序列、白蛋白的抗體或抗體片段、白蛋白載體的抗體或抗體片段(如gp60/albondin/凈化劑受體/或TGF-β受體)，或胞膜窯中發現的任何蛋白質、白蛋白轉運蛋白的抗體。本發明還涉及制備為具有一個SPARC化合價和另一個經內皮轉運的效應器(如gp60/albondin/凈化劑受體/或TGF-β受體)化合價的嵌合體，或內皮細胞胞膜窯中發現的任何蛋白質的抗體或其合適的片段。本發明還提供經SPARC抗體的補體固定和/或細胞招募介導的免疫應答而破壞SPARC表達組織(如腫瘤和心瓣再狹窄組織)的方法。在這種情況下，如同Rituxan(—種抗-CD20抗體)，效應器部分為Fe片段，其可介導伴有SPARC表達細胞的直接破壞的補體激活或免疫細胞經細胞介導的免疫應答產生的組織破壞而招募至SPARC表達組織。本發明還提供利用SPARC的中和抗體抑制SPARC活性的方法。中和抗體具有阻斷SPARC與其效應器在體內相互作用的能力。例如，中和抗體可阻斷SPARC與細胞表面組分的相互作用或SPARC結合其天然配體(如白蛋白、生長因子和Ca2+)。本發明還提供了用于測定人或其他哺乳動物腫瘤對抗-SPARC療法的應答的方法。該方法包括(a)從人分離生物樣品，(b)檢測生物樣品中SPARC蛋白的表達，和(c)定量生物樣品中SPARC蛋白的量。由于抗-SPARC療法依賴于疾病組織中SPARC抗體與SPARC的結合，疾病組織中SPARC的存在對于活性是必要的。本發明進一步提供了使用結合至SPARC識別基團的一種或多種診斷試劑(如以上所述的抗體或其片段)的方法。診斷試劑包括放射性同位素或放射性核素、MRI造影劑、X射線造影劑、超聲造影劑和PET造影劑。用于結合(conjugation)的方法為本領域所知?？赏ㄟ^本領域已知的任何合適的方法檢測和定量樣品中SPARC蛋白的表達。蛋白質檢測和定量的合適的方法包括蛋白質印跡、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、銀染、BCA測定法(Smith 等,Anal. Biochem.，150, 76-85 (1985)), Lowry 蛋白質測定法(例如在 Lowry 等,J. Biol. Chem.，193，265-275 (1951)中描述)，其為基于蛋白質-銅復合物的比色測定法，和Bradford 蛋白質測定法(例如在 Bradford 等,Anal. Biochem. ,72, 248 (1976)中描述)，其基于根據蛋白質結合的考馬斯藍G-250吸光度的變化。可通過之前任何方法分析腫瘤活組織檢查或其可通過利用抗-SPARC抗體(單克隆或多克隆的)與合適的顯象系統(即，HRP底物和HRP-偶聯的二抗)一起的免疫組織化學分析。任何合適的SPARC抗體均可用于本發明的方法，只要該抗體呈現特異性結合SPARC?？贵w可以是單克隆或多克隆的；并且可通過動物的免疫產生或通過重組DNA技術(如噬菌體展示和體外誘變或抗體重鏈和輕鏈基因可變區的合成)而產生。多克隆抗體包括但不限于，人抗體和源自例如下列動物的人源化抗體，如鳥類(例如，雞)、嚙齒類(例如，大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠)、母牛、山羊、綿羊、兔等等。單克隆抗體包括源自抗體產生細胞(包括但不限于人細胞)的單個克隆的抗體，和源自其他動物類型(例如雞、兔、大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠、母牛、山羊、綿羊等等)的細胞的抗體。合成的抗體包括利用重組DNA技術經重鏈和輕鏈基因可變區的遺傳工程而產生的抗體。合成的抗體還包括具有SPARC結合活性的化學合成的抗體片段或源自噬菌體展示或類似技術的抗體。用于人的用途，為了避免免疫原性和免疫應答，優選利用人源化的抗-SPARC抗體或合適的片段如Fab'、Fab或Fab2。人源化抗體或其片段例如可利用下列已建立方法的一種產生1)可利用人IgG主鏈代替SPARC抗體的可變CDR域而構建人源化抗體，其中重鏈和輕鏈在分開的啟動子下分別表達或在具有IRES序列的一個啟動子下共表達；2)可利用設計改造具有人免疫系統的小鼠產生人源化單克隆抗體；3)可利用噬粒(M13，A大腸桿菌噬菌體，或能表面展示的任何噬菌體系統)產生SPARC的人源化抗體。為了構建全長抗體，可變區可轉移至重鏈和輕鏈的CDR上。哺乳動物細胞如CH0、293或人骨髓細胞中重鏈 和輕鏈的共表達產生全長抗體。類似地，可利用沿用已久的方法制備Fab’、Fab或Fab2片段和單鏈抗體。SPARC的抗體也不限于完整的抗體或保留SPARC結合位點的抗體的片段(例如，Fab和Fab2)?？贵w也不限于任何一類型的抗體，例如IgM、IgA、IgG、IgE、IgD和IgY。抗體還不限于ニ價抗體、單價或具有SPARC的ー價和效應器(如tTF或蓖麻毒A)的另ー價的嵌合體。人源化抗體不限于IgG。同樣的技術可用于產生所有其他種類的抗體如IgE、IgA、IgD、IgM，每種具有適于特定疾病靶向的不同的抗體-依賴的細胞毒性(ADCC)和補體依賴的細胞毒性(⑶C)活性。抗體的功能片段可通過限制性蛋白質水解產生。這些片段可以是單價的(如Fab’ )或ニ價的(如Fab2)。片段還可在大腸桿菌中作為單鏈scfv或雙抗體合成。本發明進一歩提供了包含直接能發揮其藥理學作用的藥物活性劑或與能結合SPARC或其他白蛋白結合部分的化合物偶聯的藥物活性剤，和藥學可接受載體的組合物。遞送試劑，其可以是包含與SPARC識別基團偶聯的藥物活性劑的藥物組合物，以使得治療有效量的藥物活性劑遞送給哺乳動物的量給予哺乳動物，如人。本發明還提供了用于將化療劑遞送給哺乳動物中腫瘤的方法。該方法包括給予人或其他哺乳動物治療有效量的藥物組合物，其中該藥物組合物包含與能結合SPARC蛋白的化合物或配體偶聯的化療劑和藥學可接受載體。在此闡述的與本發明的其他實施方案有關的化療劑、腫瘤、哺乳動物和其組分的描述也適用于遞送化療劑至腫瘤的上述方法的那些相同方面。優選，藥物組合物不包含超過50%的納米顆粒形式的治療劑。更優選，藥物組合物不包含超過10%的納米顆粒形式的治療劑。甚至更優選，藥物組合物不包含超過5%，或超過4%或超過3%的納米顆粒形式的治療劑。在更優選的實施方案中，藥物組合物不包含超過2%或超過1%的納米顆粒形式的治療劑。最優選，藥物組合物不包含任何納米顆粒形式的治療劑。
本發明還提供了用于將化療劑遞送至人或其他哺乳動物中腫瘤的方法。該方法包括給予人或其他哺乳動物治療有效量的遞送試劑，如藥物組合物，其中該遞送試劑(例如，藥物組合物)包含與SPARC識別基團偶聯的化療劑。例如，化療劑可偶聯至SPARC識別基團(如識別SPARC蛋白的抗體)或僅偶聯至SPARC抗體。藥物組合物優選包含偶聯至SPARC識別基團的化療劑和藥學可接受載體。在此闡述的與本發明的其他實施方案有關的化療劑、腫瘤、哺乳動物和其組分的描述也適用于遞送化療劑至腫瘤的上述方法的那些相同方面。 在其他實施方案中，本發明提供了通過SPARC識別基團的方式遞送藥物活性劑至疾病部位的方法，該疾病以人或表達所述蛋白質或標志物的其他動物中SPARC或另一種白蛋白-結合蛋白或標志物的過表達為特征。所述疾病疾病包括身體組織(例如軟組織、結締組織、骨、實體器官、血管等等)中增殖、組織重塑、增生、擴大的傷口愈合的異常情況。通過給予包含偶聯至能結合SPARC蛋白或另一種白蛋白-結合蛋白的化合物或配體的治療劑的藥物組合物能治療或診斷的疾病的實例包括癌癥、糖尿病或其他視網膜病、炎癥、關節炎、血管或人工血管移植物或血管內裝置再狹窄等等。在此闡述的與本發明的其他實施方案有關的藥物活性劑、腫瘤、哺乳動物和其組分的描述也適用于遞送藥物活性劑的上述方法的那些相同方面。仍然在其他實施方案中，本發明提供了用于遞送藥物活性劑(例如，僅SPARC抗體或結合至SPARC識別基團如SPARC抗體，放射性標記的SPARC抗體等等的化療劑)至疾病部位的方法，該疾病以人或表達所述蛋白質或標志物的其他動物中SPARC的過表達為特征。所述疾病包括身體組織(例如軟組織、結締組織、骨、實體器官、血管等等)中增殖、組織重塑、增生、擴大的傷口愈合的異常情況。通過給予包含抗-SPARC治療的藥物組合物能治療或診斷的疾病的實例包括癌癥、糖尿病或其他視網膜病、炎癥、關節炎、血管或人工血管移植物或血管內裝置再狹窄等等。這里闡述的與本發明的其他實施方案有關的藥物活性齊U、腫瘤、哺乳動物和其組分的描述也適用于遞送藥物活性劑的上述方法的那些相同方面。在其他實施方案中，本發明方法包括給予哺乳動物治療有效量的藥物組合物，所述組合物包含偶聯至能結合SPARC蛋白的化合物或配體的化療劑。該化療劑可利用任何合適的方法偶聯至能結合SPARC蛋白的化合物或配體。優選，該化療劑經共價鍵(包括例如二硫鍵)化學偶聯至化合物。本發明還提供了包括給予哺乳動物治療有效量的藥物組合物的方法，所述組合物包含偶聯至SPARC識別基團的化療劑或放射性元素。該化學治療的或放射性的試劑可利用任何合適的方法偶聯至識別SPARC的抗體。優選，該化療劑可經共價鍵(包括例如二硫鍵)化學偶聯至化合物。優選，可用于本發明方法中的化合物或配體能結合SPARC蛋白。在本發明一優選的實施方案中，化合物為結合SPARC蛋白的配體。合適的配體實例包括鈣陽離子(Ca2+)、銅陽離子(Cu2+)、鐵陽離子(Fe2+)、血小板來源的生長因子(TOGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、膠原(例如，膠原I、膠原II、膠原III、膠原IV、膠原V和膠原IX)、玻連蛋白(vitronectin)、血小板反應蛋白-I、內皮細胞、血小板、白蛋白和輕基磷灰石陽離子。在本發明另一個優選的實施方案中，化合物為小分子。術語“小分子”指具有小于約600分子量的任何分子。合適的小分子的實例包括蛋白質、核酸、糖類、脂類、輔酶(例如維生素)、抗原、激素和神經遞質。優選，小分子為化學的(例如，有機或無機化學的)肽或擬肽、蛋白質或糖類。在本發明又一個優選的實施方案中，化合物為直接針對SPARC蛋白的抗體。結合SPARC蛋白的合適的抗體或其片段可用于本發明方法中。已在幾乎所有的癌癥類型中證實腫瘤組織中SPARC的表達。已證實SPARC在腫瘤組織上的加工可源自SPARC的腫瘤表達或是基質細胞來源的。通過外源SPARC的給予，腫瘤的SPARC表型可從SPARC陰性轉換至SPARC陽性。因此，SPARC陽性腫瘤將變為對化療劑敏感的?；蛘撸琒PARC可以為放射性同位素標記的或與不同的毒素偶聯而賦予其直接或間接殺死腫瘤的能力。
可利用已知技術合成和純化SPARC。可通過將SPARC結構基因/cDNA置于強啟動子/翻譯起始位點調控下而產生表達外源SPARC的細胞并且載體轉染入哺乳動物細胞以驅動SPARC在這些細胞中的表達?；蛘?，SPARC可利用桿狀病毒或其他病毒(如腺病毒)表達。通過這些細胞表達的SPARC可通過傳統的純化方法如離子交換、體積排阻或C18色譜法純化。純化的SPARC可與防腐劑配制于鹽水中并且通過靜脈內、通過氣霧劑、通過皮下注射或其他方法給予。本發明還提供了用于將化療劑遞送給哺乳動物腫瘤的方法。該方法包括給予哺乳動物治療有效量的藥物組合物，其中該藥物組合物包含與能結合白蛋白的SPARC蛋白偶聯的化療劑和藥學可接受載體。在此闡述的與本發明的其他實施方案有關的化療劑、腫瘤、哺乳動物和其組分的描述也適用于遞送化療劑至腫瘤的上述方法的那些相同方面。用于體內使用，偶聯至能結合SPARC蛋白的化合物或配體的化療劑如所希望地配制入包含生理學可接受載體的藥物組合物中。任何合適的生理學可接受載體可用于本發明的上下文中，并且所述載體為本領域所熟知。用于體內使用，杭-SPARC治療劑如所希望地配制入包含生理學可接受載體的藥物組合物中。任何合適的生理學可接受載體可用于本發明的上下文中，并且所述載體為本領域所熟知。載體通常為液體，但也可以是固體，或液體和固體組分的組合。如所希望的，載體為生理學可接受的(例如，藥物或藥理學可接受的)載體(例如，賦形劑或稀釋劑)。生理學可接受的載體為大家所熟知并且很容易得到。至少部分地通過靶組織和/或細胞的定位以及用于給予該組合物的具體方法確定載體的選擇。通常，所述組合物可制成可注射的(無論是液體溶液或懸浮液)；還可制備適于在注射之前添加液體而制備溶液或懸浮液的固體形式；并且還可乳化該制劑。適于注射用途的藥物制劑包括無菌水溶液或分散體；包含已知的蛋白質穩定劑和冷凍保護劑的制劑，包含芝麻油、花生油或丙ニ醇水溶液的制劑以及用于無菌注射溶液或分散體臨時制備的無菌粉劑。所有情況中，制劑必須為無菌的并且必須為至易于注射程度的液體。其在制備和貯藏條件下必須穩定并且必須保存時防微生物(如細菌和真菌)的污染作用。作為游離堿或藥理學可接受鹽的活性物質的溶液可適當地與表面活性劑(如羥基纖維素)混合制備于水中。分散體還可以制備于甘油、液體聚こニ醇和其混合物和油類中。在常規的貯藏和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長。偶聯至結合SPARC蛋白的化合物或配體的化療劑(例如，抗-SPARC治療)可以中性或鹽形式配制入組合物中。藥物可接受鹽包括酸加成鹽(與蛋白質的游離氨基形成的)并且其與無機酸類(例如，鹽酸或磷酸)或有機酸類(如醋酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等等)形成。與游離羧基形成的鹽也可源自無機堿(例如，鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵)，以及有機堿(如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等等)。組合物可進一步包括任何其他合適的組分，尤其用于提高組合物和/或其終端使用的穩定性。因此，存在本發明組合物的多種合適的制劑。下列制劑和方法僅為論證性的而決不為限制。適于經吸入給予的制劑包括氣霧劑制劑。氣霧劑制劑可置于加壓的可接受推進劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等。其也可配制為常壓制劑，用于通過噴霧器或霧化器遞送。適于腸胃外給藥的制劑包括水性的和非水性的等滲無菌注射溶液，其可包含抗-氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得該制劑與指定受體的血液等滲的溶質，以及水性的和非水性的無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、稠化劑、穩定劑和防腐劑。制劑可以單元劑量或多劑量密封容器存在，如安瓿和小瓶，并且可以冷凍干燥(凍干)的狀態保存，立即使用之前僅需添加無菌的液體賦形劑，例如注射用水?？蓮闹八龅臒o菌粉劑、粒劑和片劑類型制備臨時的注射溶液和懸浮液。本發明的一優選的實施方案中，偶聯至結合SPARC蛋白的化合物(例如，抗-SPARC治療)的化療劑被配制成用于注射(例如，腸胃外給藥)。在這方面，如所希望的，制劑適于瘤內給藥，但也可配制成用于靜脈注射、腹膜內注射、皮下注射
坐坐寸寸ο適于肛門給藥的制劑可通過將活性組分與各種基質(如乳化基質或水溶性基質)混合而制備栓劑。適于陰道給藥的制劑除了包含活性組分之外還含有本領域已知的合適的載體，所述制劑可以下列是方式存在子宮托、棉塞、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫或噴霧劑而存在。此外，組合物可包含另外的治療或生物學-活性劑。例如，可存在對特定的適應癥治療有效的治療因子?？刂蒲装Y的因子，如布洛芬或留體，可為減少與藥物組合物的體內給藥有關的腫脹和炎癥以及生理痛苦的部分。
具體實施例方式下列實施例進一步舉例說明本發明但不應該認為以任何方式限制其范圍。實施例I該實施例舉例說明SPARC與白蛋白在MX-I腫瘤異種移植物中的共-定位。已顯示3期轉移性的乳腺癌試驗中紫杉醇白蛋白納米顆粒(Abraxane, ABX或ABI-007)具有超過Taxol (TAX)的改善的響應率(33%對比19%，p < O. 0001)(參見例如，O’ Shaughnessy, SABCS)。近來證實了白蛋白_介導的紫杉醇(P)經內皮轉運和ABX對比 TAX的紫杉醇增加的瘤內累積(參見例如，Desai, SABCS 2003)。白蛋白結合SPARC(參見例如，Schnitzer, J. Biol. Chem.，269，6072-82 (1994))。MX-I腫瘤細胞系源于人乳腺癌。免疫染色人MX-I腫瘤異種移植物、人原發乳腺腫瘤組織(η = 141)和正常人乳腺組織(η = 115)的連續低溫切片并且對白蛋白、SPARC(利用抗-SPARC抗體)和小窩蛋白(caveolin)-l染色分級(0_4)。培養的MX-I細胞也對SPARC免疫染色。用放射性紫杉醇(P) (20mg/kg IV)制備紫杉醇白蛋白納米顆粒(Abraxane,ABX或ABI-007)和Taxol (TAX)，并且用于確定紫杉醇在無胸腺小鼠正常組織中的生物學分布。
MX-I腫瘤中白蛋白染色為聚集的并且與SPARC共-定位(圖I)。小窩蛋白-1染色證實含有白蛋白的區域中血管密度與無白蛋白的區域無差異。SPARC由MX-I培養細胞的表達通過用抗-SPARC抗體陽性染色證實。對于7/10組織，正常組織中(SPARC陰性)的紫杉醇累積對于ABX相比TAX明顯更低(p彡0. 004)。與正常組織的1%相比，46%的人原發乳腺腫瘤呈現強的SPARC染色(等級〉2) (p < 0. 0001)。在50個腫瘤組織的亞組中，SPARC表達與分級、ER狀態或PgR狀態無關；然而p53-陰性腫瘤中有高SPARC表達的趨勢。白蛋白和SPARC的共-定位提示SPARC通過其白蛋白結合活性可起乳腺腫瘤中白蛋白結合的瘤內靶標的作用。由于ABX中紫杉醇的轉運取決于白蛋白(參見例如，DesaiSABCS, 2003)，此可解釋ABX相比TAX改善的腫瘤累積。正常組織中ABX累積比TAX更低，與正常組織中缺乏SPARC表達相一致。對SPARC篩查患者使得能鑒定對ABX更多響應的患者。這些腫瘤中SPARC的存在允許利用抗-SPARC抗體的靶向和治療。實施例2該實施例舉例說明了 MX-I腫瘤細胞中SPARC的表達。MX-I細胞培養于蓋玻片上并且利用本領域已知的方法用針對人SPARC的抗體染色。觀察到抗體染色，其證實MX-I表達SPARC。這些結果提示MX-I腫瘤細胞中檢測到的SPARC表達為SPARC通過MX-I腫瘤細胞分泌的結果。對于MX-I腫瘤細胞，染色比正常的初級細胞如HUVEC (人臍靜脈內皮細胞)、HLMVEC (人肺微血管內皮細胞)和HMEC (人乳腺上皮細胞)更強。雖然大部分SPARC染色為內部SPARC，如通過共聚焦顯微鏡檢查和未滲透細胞的染色證實的，檢測到顯著性水平的表面SPARC。實施例3該實施例舉例說明了人乳腺癌細胞中SPARC蛋白的過表達。利用Cybrdi Inc. (Gaithersburg, MD)的腫瘤陣列測定人乳腺癌細胞中的SPARC表達。分析結果在表I中顯示。染色強度分級為“陰性”至4+，數字越高對應的過表達強度就越大。與正常組織的1%相比，49%的乳腺癌SPARC染色陽性(2+和以上)(p < 0. 0001)。
權利要求
1.偶聯至能結合281個氨基酸的SPARC糖蛋白的化合物的治療劑在制備用于治療哺乳動物的腫瘤的藥物中的用途，包括 (1)從哺乳動物分離生物樣品， (2)檢測生物樣品中SPARC蛋白的表達， (3)定量生物樣品中SPARC蛋白的量，和 (4)如果生物樣品中SPARC蛋白的量，向該哺乳動物給予治療有效量的偶聯至能結合281個氨基酸SPARC糖蛋白的化合物的治療劑。
2.權利要求I的用途，其中所述生物樣品分離自腫瘤。
3.權利要求I的用途，其中所述生物樣品分離自體液。
4.權利要求3的用途，其中所述體液選自腦脊液、血液、血漿、血清和尿液。
5.權利要求I的用途，其中所述腫瘤位于頭、頸、膀胱、肝臟、卵巢、腎、消化道、腦或乳腺。
6.權利要求I的用途，其中所述哺乳動物為人。
7.權利要求I的用途，其中所述用SPARC結合化合物檢測SPARC。
8.權利要求7的用途，SPARC結合化合物是結合至281個氨基酸SPARC糖蛋白的抗體。
9.權利要求I的用途，其中所述治療劑選自酪氨酸激酶抑制劑、激酶抑制劑、生物活性齊U、生物分子、放射性核素、阿霉素、安沙霉素抗生素、門冬酰胺酶、博來霉素、白消安、順氯氨鉬、卡波氯氨鉬、亞硝脲氮芥、卡西他濱、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、環磷酰胺、喜樹堿、氮烯唑胺、放線菌素、柔紅霉素、右雷佐生、多烯紫杉醇、阿霉素、鬼白亞乙苷、埃博霉素、5-氟脫氧尿苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、異環磷酰胺、依立替康、環己亞硝脲、二氯甲二乙胺、巰嘌呤、meplhalan、氨甲喋呤、雷帕霉素(西羅莫司(sirolimus))、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亞硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸鹽、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、美羅華、鏈脲霉素、鬼白噻吩苷、硫鳥嘌呤、三胺硫膦、紫杉烷、長春花堿、長春新堿、長春瑞賓、泰索、考布他汀、discodermolides、反鉬、抗-血管內皮細胞生長因子化合物(“抗-VEGF”)、抗-表皮生長因子受體化合物(“抗-EGFR”)、5_氟尿嘧啶及其衍生物和組合。
全文摘要
本發明提供了偶聯至能結合281個氨基酸的SPARC糖蛋白的化合物的治療劑在制備用于治療哺乳動物的腫瘤的藥物中的用途。本發明還提供了用于將化療劑遞送至表達SPARC的人腫瘤的方法，包括給予包含偶聯至結合SPARC蛋白的化合物的化療劑的藥物組合物。本發明進一步提供了包含偶聯至能結合SPARC蛋白的化合物的化療劑和藥學可接受載體的組合物。
文檔編號A61K38/40GK102614521SQ20121000825
公開日2012年8月1日 申請日期2005年5月16日 優先權日2004年5月14日
發明者N·P·德賽, P·蘇恩-施昂, V·特利烏 申請人:阿布拉西斯生物科學公司