專利名稱：負載水溶性維生素e的絲素蛋白納米纖維膜及其制備方法
技術領域：
本發明屬于絲素蛋白納米纖維膜及其制備領域，特別涉及一種負載水溶性維生素 E的絲素蛋白納米纖維膜及其制備方法。
背景技術：
納米纖維由于具有尺度小、比表面積大和物理性能優異等特點，在生物醫學領域具有廣闊的應用前景。納米纖維膜有小的孔徑和高的比表面積能促進止血反應而不用止血齊U。納米纖維膜多孔結構有利于細胞的呼吸而不引起傷口干燥，同時小的孔徑有效阻止細菌侵入，又具有良好的透氣透氧性能。換敷料帶來干擾神經組織再生的幾率。靜電紡納米纖維能給皮膚細胞更好的自我修復路徑，從組織工程的觀點出發，仿生的納米纖維結構有好的細胞傳導性和改善血液的相容性，使傷口更容易愈合和皮膚再生。由于絲素蛋白是一種自然界非常豐富的天然蛋白質，具有良好的生物相容性、生物可降解性、良好的透氣、透濕性、無免疫原性等優異的性能，近年來被廣泛應用于生物醫藥領域。多種維生素被發現與皮膚健康有密切關系，在專利CN 101736430A中，就公布了一種負載有維生素C的絲素蛋白納米纖維的制備方法，其纖維具有護膚功效。維生素E又稱為抗不生育維生素或生育酚，是一種透明淡黃色粘稠油狀物，不溶于水，溶于有機溶劑， 酸堿氫化過程及高溫均不會破壞維生素E。但它在空氣中會緩慢氧化，紫外線照射可使其分解。它可以保護其他易被氧化的物質使其不被破壞，所以它是極有效的氧化劑，可以預防重金屬、產生自由基的肝毒素和可以引起氧化劑致傷的各種藥物損害。聚乙二醇維生素 E 玻拍酸酉旨(D-α -tocopherol polyethylene glycol succinate, TPGS, Vitamin E TPGS, Tocophersolan)是維生素E的水溶性衍生物，由維生素E琥珀酸酯(VEQ的羧基與聚乙二醇(PEG)酯化而成，已載入《美國藥典》。美國現已有TPGS (質量分數為20%的水溶液)產品上市(如Mazuri )，作為維生素E的營養補充劑，折合成維生素E效價約為77. 4IU -^10 此水溶性維生素E非常穩定，室溫放置不水解，且幾乎無味，可作為人維生素E補充劑，特別是那些對脂溶性維生素E吸收有障礙的人。在US 523469中，以亞洲象和非洲象作為受試動物，與服用脂溶性維生素E相比，口服質量分數為20 %的TPGS溶液后，體內維生素E濃度增長快，較低劑量的水溶性維生素E就能達到較高的血藥濃度。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜及其制備方法，該絲素蛋白納米纖維膜應用人工皮膚、醫用敷料、止血材料、護膚產品等多個生物醫藥領域，在本發明整個制備過程中，不涉及到任何對環境和人類健康不友好的物質，無污染，成本低，操作簡單。本發明的一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜，所述納米纖維膜包括絲素蛋白納米纖維和負載于絲素蛋白納米纖維中的水溶性維生素E，納米纖維膜的直徑為 10-800nm。
所述水溶性維生素E為維生素E聚乙二醇琥珀酸酯。所述納米纖維膜的直徑為200-600nm。本發明的一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜的制備方法，包括(1)將水溶性維生素E加熱至融化，攪拌均勻，隨后于80 100°C加入相對于維生素E質量4-9倍的去離子水，攪拌10-20min至透明的澄清液體，即維生素E溶液；(2)在上述維生素E溶液中加入絲素蛋白及去離子水至終濃度，攪拌至絲素蛋白完全溶解，得絲素蛋白-維生素E溶液；其中，維生素E的終濃度為0. l-2wt%，絲素蛋白的終濃度為20-35wt% ； (3)將上述絲素蛋白-維生素E溶液移入注射器中進行靜電紡絲，即得絲素蛋白納米纖維膜。所述步驟⑵中的絲素蛋白的制備方法為將去蛹蠶繭在100°C的0. 5wt% Na2CO3 水溶液中煮2-5次，每次30min進行脫膠，得到絲素，用摩爾比為1 2 8的CaCl2、C2H5OH 和H2O或用0. 8g/ml LiBr水溶液在40_60°C溶解l_2h，用蒸餾水透析3_5天，冷凍干燥即得。所述步驟O)中的維生素E的終濃度為0. 5-2wt %。所述步驟O)中的絲素蛋白的終濃度為25-30wt%。所述步驟(3)中的靜電紡絲的工藝條件為靜電壓為16-20千伏，接受距離為 80-220mm,紡絲速率為0. 1-1. 0毫升/小時。脂溶性維生素E吸收有障礙人群中常出現的維生素E缺乏或吸收率較低的問題， 本發明提供的納米纖維膜，利用絲素蛋白作為天然高分子材料，通過靜電紡絲，制備得纖維直徑在IO-SOOnm之間的納米纖維膜。有益效果本發明可使維生素E及絲素蛋白同時溶解在水中，在本發明整個制備過程中，不涉及到任何對環境和人類健康不友好的物質，無污染，成本低，操作簡單，并結合利用納米纖維、維生素E和絲素蛋白的優良特點，本發明的負載有水溶性維生素E的納米纖維可應用人工皮膚、醫用敷料、止血材料、護膚產品等多個生物醫藥領域，且水溶性維生素E的加入， 可以提高絲素蛋白紡絲液的可紡性，提高了以水做溶劑，靜電紡絲得到絲素蛋白納米纖維的效率。


圖1為實施例1所制得的納米纖維膜材料的掃描電鏡圖；圖2為實施例2所制得的納米纖維膜材料的掃描電鏡圖；圖3為實施例1所得的納米纖維膜材料的纖維直徑分布圖；圖4為實施例2所得的納米纖維膜材料的纖維直徑分布圖；圖5為維生素E絲素蛋白納米纖維細胞增殖狀態比較；圖6為負載維生素E納米纖維支架細胞抗氧化性能比較；圖7為加入水溶性維生素E對紡絲效率的影響效果圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1(1)將去蛹蠶繭在100°C的0. 5wt% Na2CO3水溶液中煮2次，每次30min進行脫膠，得到絲素，用摩爾比為1 2 8的&(12、(2!150!1和!120在601溶解1.511，冷凍干燥得到疏松的多孔狀固體絲素蛋白；(2)準確稱取0. 16克TPGS，加熱至融化，磁力攪拌均勻，隨后加熱1. 44ml的90°C的去離子水，充分攪拌15min，撤去熱源，攪拌至呈透明的、澄清液體，在水溶性維生素E溶液中加入l.Og絲素蛋白及去離子水，溶液的最終質量為4. 0g，密封后繼續攪拌至絲素蛋白完全溶解，隨后靜置數分鐘后將紡絲液轉移至注射器中，電壓為18kV，注射泵推進速度為0. :3ml/h，采用鋁箔接收，接收距離為18cm，得負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜，平均直徑為388 士 114nm。實施例2(1)將去蛹蠶繭在100°C的0. 5wt% Na2CO3水溶液中煮3次，每次30min進行脫膠，得到絲素，0. 8g/ml LiBr水溶液在45°C溶解池，冷凍干燥得到疏松的多孔狀固體絲素蛋白。(2)準確稱取0. 08克TPGS，加熱至融化，磁力攪拌均勻，隨后加熱0. 72ml的90°C的去離子水，充分攪拌15min，撤去熱源，攪拌至呈透明的、澄清液體，在水溶性維生素E溶液中加入l.Og絲素蛋白及去離子水，溶液的最終質量為4. 0g，密封后繼續攪拌至絲素蛋白完全溶解，隨后靜置數分鐘后將紡絲液轉移至注射器中，電壓為20kV，注射泵推進速度為0. :3ml/h，采用鋁箔接收，接收距離為18cm，得負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜，平均直徑為722 士 300nm。實施例3(1)將去蛹蠶繭在100°C的0. 5wt% Na2CO3水溶液中煮5次，每次30min進行脫膠，得到絲素，用摩爾比為1 2 8的CaCl2、C2H5OH和H2O在60°C溶解2h，冷凍干燥得到疏松的多孔狀固體絲素蛋白。(2)準確稱取0. 32克TPGS，加熱至融化，磁力攪拌均勻，隨后加熱1. 5ml的90°C的去離子水，充分攪拌15min，撤去熱源，攪拌至呈透明的、澄清液體，在水溶性維生素E溶液中加入l.Og絲素蛋白及去離子水，溶液的最終質量為4g，密封后繼續攪拌至絲素蛋白完全溶解，隨后靜置數分鐘后將紡絲液轉移至注射器中，電壓為20kV，注射泵推進速度為0. :3ml/h，采用鋁箔接收，接收距離為18cm，得負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜，平均直徑為384 士 161nm。實施例4(1)將去蛹蠶繭在100°C的0. 5wt% Na2CO3水溶液中煮5次，每次30min進行脫膠，得到絲素，用摩爾比為1 2 8的CaCl2、C2H5OH和H2O在60°C溶解2h，冷凍干燥得到疏松的多孔狀固體絲素蛋白。(2)準確稱取0. 016克TPGS，加熱至融化，磁力攪拌均勻，隨后加熱0. 064ml的900C的去離子水，充分攪拌15min，撤去熱源，攪拌至呈透明的、澄清液體，在水溶性維生素E溶液中加入1. Og絲素蛋白及去離子水，溶液的最終質量為4. Og,密封后繼續攪拌至絲素蛋白完全溶解，隨后靜置數分鐘后將紡絲液轉移至注射器中，電壓為18kV，注射泵推進速度為0. %il/h，采用鋁箔接收，接收距離為18cm，得負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜。實施例5(1)將去蛹蠶繭在100°C的0. 5wt% Na2CO3水溶液中煮5次，每次30min進行脫膠，得到絲素，用摩爾比為1 2 8的&(12、(2!150!1和!120在601溶解111，冷凍干燥得到疏松的多孔狀固體絲素蛋白。(2)準確稱取0. 16克TPGS，加熱至融化，磁力攪拌均勻，隨后加熱1. 28ml的90°C的去離子水，充分攪拌15min，撤去熱源，攪拌至呈透明的、澄清液體，在水溶性維生素E溶液中加入0.8g絲素蛋白及去離子水，溶液的最終質量為4. 0g，密封后繼續攪拌至絲素蛋白完全溶解，隨后靜置數分鐘后將紡絲液轉移至注射器中，電壓為18kV，注射泵推進速度為0. 5ml/h，采用鋁箔接收，接收距離為12cm，得負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜。實施例6(1)將去蛹蠶繭在100°C的0. 5wt% Na2CO3水溶液中煮5次，每次30min進行脫膠，得到絲素，用摩爾比為1 2 8的CaCl2、C2H5OH和H2O在60°C溶解2h，冷凍干燥得到疏松的多孔狀固體絲素蛋白。(2)準確稱取0. 16克TPGS，加熱至融化，磁力攪拌均勻，隨后加熱1. 44ml的90°C的去離子水，充分攪拌15min，撤去熱源，攪拌至呈透明的、澄清液體，在水溶性維生素E溶液中加入1.6g絲素蛋白及去離子水，溶液的最終質量為4. 0g，密封后繼續攪拌至絲素蛋白完全溶解，隨后靜置數分鐘后將紡絲液轉移至注射器中，電壓為18kV，注射泵推進速度為0. %il/h，采用鋁箔接收，接收距離為18cm，得負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜。效果實施例1生物相容性檢測(1)材料制備及處理如前述實施例1，2，3方法配制溶液并采用實施例1，2，3方法中的其他紡絲參數，采用直徑為14mm的圓形蓋玻片接收靜電紡納米纖維，將纖維膜放置于真空干燥箱中干燥，置于75% (ν/ν)乙醇蒸汽中Mh，進行材料的后處理及消毒滅菌，用于細胞培養。其中使用質量濃度為25%的純絲素蛋白紡絲液，電壓為20kV，注射泵推進速度為0. :3ml/h，采用直徑為14mm的圓形蓋玻片接收靜電紡納米纖維，接收距離為18cm，作為對比實施例1中的納米纖維組。采用14mm的圓形蓋玻片，作為對比實施例2中的玻片組。對照組同樣置于75% (ν/ν)乙醇蒸汽中Mh，進行材料的后處理及消毒滅菌，用于細胞培養。O) MTT 實驗將IO4個/mL的成纖維細胞懸液接種于M孔培養板中經消毒的實施例1，2，3和對比實施例1，2，每孔接種細胞懸液200 μ L，每組3孔。分別培養ld、3d、5d和7d后，每組3孔換加不含血清的培養液360 μ L和MTT溶液(5mg/mL) 40 μ L，培養箱培養3 4h，吸去孔內培養液，每孔加入400 μ L 二甲基亞砜，振蕩30min使結晶物溶解。每孔各取二甲基亞砜溶解液100 μ L加入96孔酶標板中，然后在酶標儀上用492nm波長段測OD值。每組設3復孔，并重復實驗3次。結果如附圖5所示MTT 效果附圖5為成纖維細胞在不同維生素E濃度下的納米纖維支架上培養1、3、5、7天的增殖情況。與玻片相比(對比實施例2)，細胞在靜電紡納米纖維支架上都有更好的增殖。培養7天后，細胞在負載有維生素E及純絲素納米纖維支架上(實施例1，2以及對比實施例1)的增殖明顯快于玻片組，存在顯著性差異(P <0.05)。由此可知，負載維生素的絲素蛋白復合納米纖維具有優良的生物相容性。效果實施例2抗氧化性能細胞按實驗室常規操作接種至材料上培養至融合度達到90% (生長面積覆蓋約90% )，加入不同濃度的氧化劑t-BHP(50,100，200，400 μ Μ)，共同培養24小時，隨后使用PBS緩沖液洗3遍，每孔加入預熱的DMEM培養基360 μ L，然后加入預熱的MTT 40 μ L繼續培養4小時，吸出培養基，每孔加入DMSO 400 μ L，在37°C搖床中溶解20min，形成紫色溶液，然后用移液槍吸取溶液加入96孔培養板中，每孔100 μ L，測定吸光值。抗氧化結果t-BHP可以誘導成纖維細胞的細胞損傷及凋亡，常用作氧化損傷模型，本實施例考察負載維生素的絲素蛋白納米纖維支架是否有助于皮膚細胞對抗t-BHP造成的氧化損傷。從附圖6中可以看出，玻片對照組(對比實施例2)上的皮膚成纖維細胞活力隨著t-BHP濃度的增大呈現顯著遞減趨勢。而在混紡維生素E的絲素蛋白納米纖維組中，低濃度的t-BHP (50-100 μ M)并未對其細胞活性造成影響，反而輕微地增加了其活性(與未添加t-BHP的純培養基組相比)，t-BHP濃度增加至200 μ M以上時，細胞的活性也保持在85%左右(與未添加t-BHP的純培養基組相比)。而在純絲素納米纖維組中(對比實施例1)，當培養基中的t-BHP濃度增加為400 μ M時，細胞的活性僅為72%左右，其抗氧化效果不及添加有維生素E的納米纖維組。在混紡維生素E的絲素蛋白納米纖維組間并沒有觀察到顯著性的差異。維生素E的抗氧化作用早已為人們所知曉，而TPGS中的維生素E的含量大約為25%，且有研究表明，TPGS清除活性氧效果要優于TOS(維生素E琥珀酸酯)。上述結果表明，混紡維生素E的絲素蛋白納米纖維有助于皮膚成纖維細胞對抗氧化損傷。對比實施例3加入水溶性維生素E對紡絲效率的影響如實施例1方法配制溶液。對比實施例1 不加入維生素Ε，但其他物質的配比均參考實施例1中的方法配制溶液。將實施例1與對比實施例1的溶液，采用實施例1中的紡絲參數，經10分鐘的靜電紡絲后，取下用于接受的金屬薄膜，將它進行SEM的表征，結果如附圖7所示從圖中可知，加入水溶性維生素E的溶液，其成絲效率更高，對比實施例1中僅僅為一些稀疏的纖維，而在實施例1的電鏡照片中，纖維則多得多。說明加入水溶性維生素E帶來了意想不到的技術效果，大大提高了使用水溶液靜電紡絲得到絲素蛋白納米纖維。
權利要求
1.一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜，其特征在于所述納米纖維膜包括絲素蛋白納米纖維和負載于絲素蛋白納米纖維中的水溶性維生素E，納米纖維膜的直徑為 10-800nm。
2.根據權利要求1所述的一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜，其特征在于所述水溶性維生素E為維生素E聚乙二醇琥珀酸酯。
3.根據權利要求1所述的一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜，其特征在于所述納米纖維膜的直徑為200-600nm。
4.一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜的制備方法，包括(1)將水溶性維生素E加熱至融化，攪拌均勻，隨后于80 100°C加入相對于維生素E 質量4-9倍的去離子水，攪拌10-20min至透明的澄清液體，即維生素E溶液；(2)在上述維生素E溶液中加入絲素蛋白及去離子水至終濃度，攪拌至絲素蛋白完全溶解，得絲素蛋白-維生素E溶液；其中，維生素E的終濃度為0. l-2wt %，絲素蛋白的終濃度為 20-35wt% ；(3)將上述絲素蛋白-維生素E溶液移入注射器中進行靜電紡絲，即得絲素蛋白納米纖維膜。
5.根據權利要求4所述的一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟O)中的絲素蛋白的制備方法為將去蛹蠶繭在100°C的 0. 5wt% Na2CO3水溶液中煮2-5次，每次30min進行脫膠，得到絲素，用摩爾比為1 2 8 的CaCl2、C2H5OH和H2O或用0. 8g/ml LiBr水溶液在40_60°C溶解l_2h，用蒸餾水透析3-5 天，冷凍干燥即得。
6.根據權利要求4所述的一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟O)中的維生素E的終濃度為0. 5-2wt%。
7.根據權利要求4所述的一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟O)中的絲素蛋白的終濃度為25-30wt%。
8.根據權利要求4所述的一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的靜電紡絲的工藝條件為靜電壓為16-20千伏，接受距離為80-220mm,紡絲速率為0. 1-1. 0毫升/小時。
全文摘要
本發明涉及一種負載水溶性維生素E的絲素蛋白納米纖維膜及其制備方法，納米纖維膜包括絲素蛋白納米纖維和負載于絲素蛋白納米纖維中的水溶性維生素E。制備方法包括(1)將水溶性維生素E加熱至融化，攪拌均勻，隨后于80～100℃加入去離子水，攪拌10-20min至透明的澄清液體，即水溶性維生素E溶液；(2)在上述水溶性維生素E溶液中加入絲素蛋白及去離子水至終濃度，攪拌至絲素蛋白完全溶解，得絲素蛋白-維生素E溶液；(3)將上述溶液移入注射器中進行靜電紡絲，即得。本發明無污染，成本低，操作簡單，本發明的負載有水溶性維生素E的納米纖維可應用人工皮膚、醫用敷料、止血材料、護膚產品等多個生物醫藥領域。
文檔編號A61K8/64GK102560888SQ201210014530
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者何創龍, 崔呈俊, 王紅聲, 盛曉悅, 范林鵬, 莫秀梅, 韓峰 申請人:東華大學