專利名稱：一種具有腫瘤細(xì)胞抑制功能的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種具有腫瘤細(xì)胞抑制功能的多核苷酸。
背景技術(shù)：
真核生物mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)是重要的調(diào)控區(qū)域，控制著該mRNA所攜帶的基因信息表達(dá)為功能蛋白質(zhì)的許多重要階段。但是，在2010年11月之前，對(duì)于高等真核生物細(xì)胞中是否有單獨(dú)的、脫離mRNA其它部分的3’UTR RNA存在，以及如果存在，它們有什么功能，國(guó)際科學(xué)界仍不清楚(Mercer TR, Wilhelm D, Dinger ME, Solda G,Korbie DJ,GlazovEA,et al.,Expression of distinct RNAs from SjUntranslated regions.Nucleic AcidsRes.2011 Mar ；39(6):2393-403.Epub 2010 Nov 12)。本發(fā)明人早在1991-1992年間就已發(fā)現(xiàn)，人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子(后稱為C/EBP β )基因mRNA的3’UTR，在單獨(dú)導(dǎo)入惡性細(xì)胞時(shí)，能表現(xiàn)腫瘤抑制功能，即抑制惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖[劉定干、野田亮、王達(dá)、陳珍珍、井川洋二、李載平，具有抗癌基因活性的一個(gè)cDNA克隆，中國(guó)科學(xué)1991 ；7 =730-737 ;劉定干、朱麗華、陳珍珍、野田亮、郭禮和、李載平，具有抗癌基因活性的一個(gè)cDNA克隆的核苷酸序列，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)1991 ；23(3):246-249;劉定干、審良靜男、岸本忠三、李載平，回復(fù)系RR中一種與回復(fù)相關(guān)的蛋白表達(dá)增強(qiáng)，中國(guó)科學(xué)1995 ；25(4):372-378]。之后長(zhǎng)期的研究表明，該3’ UTR的腫瘤抑制功能具有普遍性，對(duì)于來(lái)自小鼠的惡性DT細(xì)胞(用癌基因Ras惡性轉(zhuǎn)化NIH/3T3細(xì)胞而得)和來(lái)自人的 SMMC-7Ding-Gan Liu, Qiu-Hong Jiang, Yun-Yi Wei, Li Sun, Be1-Bei Fu,Fu-Kun Zhao, Qiong Zhou.Gene expression profile favoring phenotypic reversion:a clue for mechanism of tumor suppression by NF-1L6 SjUTR.Cell research(2003)；13(6):509-514等腫瘤細(xì)胞均具有顯著的抑制作用。進(jìn)一步的研究揭示，該3’UTR的腫瘤抑制功能的分子機(jī)制是通過(guò)與細(xì)胞癌基因蛋白一一蛋白激酶C ε的物理結(jié)合，抑制蛋白激酶 C ε 的憐酸化活力[Ying Wang, Da-Quan Sun, Ding-Gan Liu, Tumor Suppression byRNA from C/EBP β SjUTR through the Inhibition of Protein Kinase Ce Activity,PLoSONE January 2011|Volume 6|Issue l|el6543]。盡管全長(zhǎng)C/EBP β基因3’ UTR的抗腫瘤功能已有較深入的研究，但其作為一種長(zhǎng)度在280多個(gè)堿基的片段在應(yīng)用上是受到限制的，而更短的片段在合成上具有更大的優(yōu)勢(shì)。但是，C/ΕΒΡβ基因3’UTR區(qū)域的較小片段是否獨(dú)立地發(fā)揮作用，且怎樣的片段能夠發(fā)揮作用卻仍然是不清楚的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有腫瘤細(xì)胞抑制功能的多核苷酸。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多核苷酸，其選自:(a)核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示的核糖核酸；
(b)核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的脫氧核糖核酸；(c)在嚴(yán)格條件下能夠與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且具有抑制腫瘤功能的多核苷酸；(d)與(a)或(b)限定的核苷酸序列有70%以上(優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，更優(yōu)選98%以上)相同性(同源性)且具有抑制腫瘤功能的多核苷酸；(e)將(a)或(b)限定的核苷酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(如1_5個(gè)；較佳地1_4個(gè)；更佳地1-3個(gè)；更佳地1-2個(gè))堿基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制腫瘤功能的多核苷酸；或(f)核苷酸序列與(a)-(e)任一限定的多核苷酸序列互補(bǔ)(較佳地，為完全互補(bǔ))的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸是天然分離的，或是人工合成的。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸長(zhǎng)度在40_100bp ;較佳地長(zhǎng)度在50_80bp ;較佳地在 55-70bp。在本發(fā)明的另一方面，提供一種構(gòu)建物，其中包括:表達(dá)調(diào)控元件，以及與之操作性連接的所述的多核苷酸，且該多核苷酸是脫氧核糖核酸。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)調(diào)控元件包括(但不限于):啟動(dòng)子，終止子。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與所述的脫氧核糖核酸相應(yīng)的核糖核酸。在另一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子帶有RNA聚合酶的識(shí)別和/或結(jié)合位點(diǎn)。在另一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子是驅(qū)動(dòng)合成與其下游的DNA互補(bǔ)的RNA的啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子是SP6啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體；較佳地，是真核表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多核苷酸或所述的構(gòu)建物的用途，用于制備抑制腫瘤的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物還用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物還用于使得細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯于G2/M期。在另一優(yōu)選例中，，所述的腫瘤是肝癌。在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥物組合物，其包括:(有效量的，如按照重量0.0001% 10% )所述的多核苷酸或所述的構(gòu)建物；以及藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物用于抑制腫瘤。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備藥物組合物的方法，其包括:將(有效量的，如按照重量0.0001% 10% )所述的多核苷酸或所述的構(gòu)建物與藥學(xué)上可接受的載體混
口 O在本發(fā)明的另一方面，提供一種抑制腫瘤細(xì)胞的方法，包括:給予腫瘤細(xì)胞(有效量的，如按照重量0.0001% 10% )所述的多核苷酸或所述的構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制腫瘤細(xì)胞的方法是體外的、非治療性的方法(如針對(duì)離體腫瘤細(xì)胞)。本發(fā)明的其它方 面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1、各種RNA轉(zhuǎn)染對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721生長(zhǎng)的影響。圖2、轉(zhuǎn)染R62影響SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)。A，未轉(zhuǎn)染。B，轉(zhuǎn)染后。圖3各種RNA轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。圖4、轉(zhuǎn)染各試劑的SMMC-7721細(xì)胞的二維流式細(xì)胞儀分析。凋亡細(xì)胞集中在離原點(diǎn)最遠(yuǎn)處。a, SMMC-7721 ；b，單用轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染；C，用凋亡促進(jìn)劑的轉(zhuǎn)染；d, R104 轉(zhuǎn)染；e, R282 的轉(zhuǎn)染；f，R62 的轉(zhuǎn)染。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)來(lái)自C/ΕΒΡβ (又稱白介素6核轉(zhuǎn)錄因子，NF-1L6)基因的3’非翻譯區(qū)的多核苷酸片段能夠獨(dú)立地行使抑制腫瘤細(xì)胞的功能，且這一抑制功能的發(fā)揮不需要C/EBP PmRNA的其它部分(包括3’UTR的其他部分)的參與。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語(yǔ)如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。如本文所用，“核糖核酸”是核酸的一類，是由核苷酸通過(guò)3'，5,-磷酸二酯鍵連接而成的多聚體。RNA的堿基主要有4種，即腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)，其中，U取代了 DNA中的T胸腺嘧啶而成為RNA的特征堿基。如本文所用，“脫氧核糖核酸”是核酸的一類，由4種主要的脫氧核苷酸(dAMP、dGMP、dCMT和dTMP)通過(guò)3 ^，5 ^ -磷酸二酯鍵連接而成。如本文所用，所述的“可操作地連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如:啟動(dòng)子區(qū)被置于相對(duì)于目的核酸序列的特定位置，使得目的核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，“表達(dá)調(diào)控元件”是指可以使得基因有效轉(zhuǎn)錄成本發(fā)明的核糖核酸的元件。通常“表達(dá)調(diào)控元件”包括:啟動(dòng)子、終止子等。如本文所用，所述的“啟動(dòng)子”是指一種核酸序列，其通常存在于目的核酸序列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)目的核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)。多核苷酸及其用途
CCAAT/ 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 β (CCAAT/enhancer-binding protein β , C/ΕΒΡ β ),又稱NF-1L6，是一個(gè)與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明人在研究C/ΕΒΡ β mRNA的3’非翻譯區(qū)的腫瘤抑制功能的分子機(jī)制時(shí)意外發(fā)現(xiàn)，來(lái)自C/ΕΒΡβ基因的3’非翻譯區(qū)的一段僅62bp的多核苷酸片段能夠獨(dú)立地行使抑制腫瘤細(xì)胞的功能，且這一抑制功能的發(fā)揮不需要C/ΕΒΡ β mRNA的其它部分。所述的對(duì)腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制功能的多核苷酸片段R62，其核苷酸序列為:RNA 片段:5’-UUUU⑶UUUG UUUU⑶UUUU UGGUCUUUUU UUGUAUUAUA AAAAAUAAUCUAUUUCUAUG AG-3’ (SEQ ID NO:1)；相應(yīng)的DNA 片段:5’ -TTTTGTTTTG TTTTGTTTTT TGGTCTTTTT TTGTATTATAAAAAATAATC TATTTCTATG AG-3’ (SEQ ID NO:4)。所述的R62在RNA序列 結(jié)構(gòu)上具有顯著的特點(diǎn):含有多個(gè)(4個(gè)至7個(gè))連續(xù)的U,以及一小段6個(gè)連續(xù)的A。這正是“富AU元件(AU-rich element) ”的特點(diǎn)。眾所周知，作為完整mRNA的一部分的富AU元件，在調(diào)控該mRNA的穩(wěn)定性、介導(dǎo)RNA專一結(jié)合蛋白和mRNA的結(jié)合、調(diào)控mRNA的翻譯等方面是很重要的。這一元件脫離mRNA單獨(dú)在細(xì)胞里游弋，它們將會(huì)有什么作用是本領(lǐng)域至今并不了解的。多核苷酸的雜交是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，特定的一對(duì)核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發(fā)明還涉及與前述指定的核苷酸序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80% (例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99% )相同性(同源性)的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸，只要該多核苷酸也具有抑制腫瘤功能。“嚴(yán)格條件”是指:⑴在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2 X SSC,
0.1% SDS, 600C ;或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85 %以上或90 %以上，更優(yōu)選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸也具有抑制腫瘤功能。本發(fā)明還包括與本發(fā)明的多核苷酸序列具有50%或以上(優(yōu)選60%以上，70%以上，80%以上，更優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，更優(yōu)選98%以上)相同性(同源性)的核酸，所述核酸也具有抑制腫瘤功能。“相同性”是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到本發(fā)明的多核苷酸。然后可將該多核苷酸引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)或細(xì)胞中。此外,還可通過(guò)常規(guī)方法將突變弓I入本發(fā)明蛋白序列中。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，把本發(fā)明的一條多核苷酸(核糖核酸)R62用轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，包括人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549等，觀察了導(dǎo)入后各腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。發(fā)現(xiàn):R62導(dǎo)入惡性細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)后，與未導(dǎo)入R62的惡性細(xì)胞相比，生長(zhǎng)速率顯著變慢；細(xì)胞的形態(tài)變得和表型逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞相似；部分細(xì)胞被阻抑在細(xì)胞周期的G2/M期；轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。這些現(xiàn)象證明，R62轉(zhuǎn)染進(jìn)入惡性細(xì)胞后，能顯著阻礙惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其衰老死亡。本發(fā)明人進(jìn)一步研究了 R62導(dǎo)入惡性細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞功能蛋白的相互作用。發(fā)現(xiàn)R62在細(xì)胞內(nèi)能和多種功能蛋白結(jié)合，如與人RNA結(jié)合蛋白HuR、核內(nèi)不均一核糖核蛋白C (HnRNP-C)以及蛋白激酶Ce均有結(jié)合。本發(fā)明人最近的研究曾發(fā)現(xiàn)C/EBP PmRNA 3’UTR能與蛋白激酶C ε結(jié)合，這一結(jié)合抑制了蛋白激酶C ε的磷酸化活力從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的惡性表型的抑制；而本發(fā)明又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)作為C/EBPi3mRNA 3’UTR的一部分的R62也能與蛋白激酶C ε結(jié)合。這與本發(fā)明人以前的研究結(jié)果相符合。眾所周知，HnRNP C與細(xì)胞內(nèi)多種基因的表達(dá)調(diào)控(包括癌基因和抑癌基因的表達(dá)調(diào)控)密切相關(guān)。雖然分子機(jī)制尚不清楚，但HnRNP C與R62的結(jié)合極可能影響它與細(xì)胞的其它調(diào)控蛋白的結(jié)合，因而也將對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控發(fā)生作用。根據(jù)本發(fā)明人的深入研究，R62是通過(guò)以下三個(gè)途徑發(fā)揮其作用的:(1)R62抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，如CCNB-1、CCNA，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，使腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。(2) R62抑制與細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)的蛋白激酶及其受體、癌基因和抑癌基因的表達(dá)，如 PKC、c-myc, MAPK(ERK1/2), IGF-1R、p53 蛋白等。(3)R62 抑制抗凋亡蛋白 bcl_2 表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白caspase 3表達(dá)。因此，本發(fā)明的多核苷酸具有下列功能:抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；阻礙腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。本發(fā)明的多核苷酸對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制具有功能上的獨(dú)立性，即發(fā)揮功能時(shí)不需要原C/EBP PmRNA分子上其它部分的存在。本發(fā)明的多核苷酸在新型抗癌藥物的開(kāi)發(fā)方面具有應(yīng)用價(jià)值。表達(dá)構(gòu)建物本發(fā)明的多核苷酸(核糖核酸)可以直接用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或可以將多核苷酸(脫氧核糖核酸)與表達(dá)調(diào)控序列可操作性地連接，獲得表達(dá)構(gòu)建物；所述的表達(dá)構(gòu)建物可直接表達(dá)獲得本發(fā)明的核糖核酸，或?qū)⒈磉_(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的核糖核酸。表達(dá)調(diào)控序列的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于進(jìn)行的，所述的多核苷酸序列可有效連接到適當(dāng)啟動(dòng)子的下游，以指導(dǎo)mRNA合成。當(dāng)需要在體外表達(dá)獲得所述的核糖核酸時(shí)，可選擇一些包含RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)其下游基因表達(dá)。目前已經(jīng)有一些包含RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子被商業(yè)化。此外，目前也已經(jīng)有一些專門用于生長(zhǎng)RNA的試劑盒，其中包括了表達(dá)體系以及適合的表達(dá)載體等。表達(dá)構(gòu)建物可包含在重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)。較佳地，所述的表達(dá)載體是真核表達(dá)載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明的多核苷酸序列和合適的表達(dá)調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。藥物組合物本發(fā)明還提供一種具有抑制腫瘤功能的藥物組合物，所述的藥物組合物包含:有效量的本發(fā)明所述的多核苷酸或可表達(dá)多核苷酸的構(gòu)建物(或表達(dá)載體)，和藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用，“藥 學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性)的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在 Remington，s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.C0.,N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體的充分說(shuō)明。在藥物組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等。可將所述的藥物組合物制成各種適合于哺乳動(dòng)物給藥的劑型，所述劑型包括但不限于:注射劑、乳劑、粉劑、凍干粉劑、膠囊劑、片劑。在使用時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明所述的多核苷酸或可表達(dá)多核苷酸的構(gòu)建物施用于哺乳動(dòng)物(如人)，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約I毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例1、R62對(duì)惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)染抑制惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)R282(全長(zhǎng) C/EBP@3’ UTR RNA)序列(SEQ ID NO:2):MGMGAMC GUCUAUGUGU ACAGAUGMU GAUAMCUCU CUGCUUCUCC CUCUGCCCCU 60CUCCAGGCGC CGGCGGGCGG GCCGGUUUCG MGUUGAUGC MUCGGUUUA MCAUGCGUG 120MCGCGUGUG UACACGGGAC UGACGCMCC CACGUGUMC UGUCAGCCGG GCCCUGAGUA 180AUCGCUUAM GAU⑶UCCUA CGGGCUUGUU GCU⑶UGAUG UUUU⑶UUUG UUUU⑶UUUU 240UGGUCUUUUU UUGUAUUAUA AAAAAUAAUC UAUUUCUAUG AG282以上是C/EBP PmRNA 3’ UTR的中間部分282個(gè)堿基的序列，本發(fā)明人所研究的也就是這個(gè)區(qū)域。其中，黑體字母所示即為本發(fā)明的R62。R282系從正常人的cDNA表達(dá)文庫(kù)，用功能篩選的方法取得。詳情請(qǐng)見(jiàn)劉定干、野田亮、王達(dá)、陳珍珍、井川洋二、李載平，具有抗癌基因活性的一個(gè)cDNA克隆，中國(guó)科學(xué)1991 ；7:730-737。R104序列(SEQ ID NO:3):將p0TB7質(zhì)粒用XhoI酶切成線型，再用T7 RNA聚合酶做體外轉(zhuǎn)錄而得。其序列為:5， -GGAGACCGGCAGAUCUACCACUUUGUACAAGAAAGCUGGGUCAGGAAACAGCUAUGACCAUGUGCCAUUUCAUUACCUCUUUCUCCGCACCCGACAUAGAUGCC-3，。相應(yīng)的DNA序列(正鏈)為:5， GGAGACCGGCAGATCTACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGGAAACAGCTATGACCATGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGATGCC 3，R104相應(yīng)的cDNA序列可用 合成法直接獲得。再經(jīng)亞克隆和體外轉(zhuǎn)錄可得到R104的 RNA。
R62 序列:是 C/ΕΒΡ β mRNA 3，UTR 的近 3，端的一段序列，如下(SEQ ID NO:1):5，-UUUU⑶UUU⑶UUU⑶UUUUUG⑶CUUUUUUUGUAUUAUMMMUUMUCUAUUUCUAUGAG-3，；R62序列相應(yīng)的脫氧核糖核酸(正鏈)序列為(SEQ ID NO:4):5’ -TTTTGTTTTGTTTTGTTTTTTGGTCTTTTTTTGTATTATAAAAAATAATCTATTTCTATGAG-3’ ；將以上獲得的各RNA(R282、R104、R62)相應(yīng)的cDNA克隆進(jìn)pSP64表達(dá)質(zhì)粒(購(gòu)自Promega,含SP6啟動(dòng)子)的適當(dāng)?shù)亩嗫寺∥稽c(diǎn)中。獲得的重組質(zhì)粒采用Sp6 Large ScaleRNA ProdTcing Kit (購(gòu)自Promega ;含有SP6 RNA聚合酶)進(jìn)行表達(dá)純化,表達(dá)純化方法參照該試劑盒的說(shuō)明書。綜上，獲得純化的各RNA產(chǎn)物，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)過(guò)程:先用pH 7.2的PBS溶解并用0.2μΜ濾器過(guò)濾除菌的0.5%明膠對(duì)96孔板進(jìn)行包被lh，去除明膠液體，并用PRM1-1640 (GIBCO)清洗3次。人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721在轉(zhuǎn)染前24h進(jìn)行細(xì)胞鋪板，用PRM1-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(10%新生牛血清，杭州四季青)，轉(zhuǎn)染前I小時(shí)更換成DMEM(GIBCO)，SMMC-7721用Lipofectamine2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染，按每孔 0.25 μ L Lipofectamine 2000 和 2.5pmol RNA (R282, R62,R104，或不含RNA僅ddH20 ；RNA加入后，每孔中該RNA濃度為2.5pmol/100 μ L溶液)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6h后更換成PRM1-1640完全培養(yǎng)基。對(duì)轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞用CCK-8 (BeyoTime)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，其時(shí)間分別為轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h和96h。將R282 (全長(zhǎng)C/ΕΒΡ β 3’ TTR RNA)、R104 (對(duì)照RNA)和R62分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，定時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖1，可見(jiàn)R62使SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)速率減慢的程度和全長(zhǎng)3’ TTR RNA相似。實(shí)施例2、R62改變惡性細(xì)胞形態(tài)顯示其干擾惡性細(xì)胞生長(zhǎng)SMMC-7721按實(shí)施例1進(jìn)行R62轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h時(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍片記錄。結(jié)果如圖2，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染了 R62的SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，顯示生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞表現(xiàn)病態(tài)。實(shí)施例3、R62使SMMC-7721細(xì)胞部分停滯在細(xì)胞周期G2/M期對(duì)SMMC-7721按實(shí)施例1進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)染(6孔板)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)時(shí)用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，并用PH7.2的PBS清洗2次，再用pH7.2的PBS重懸，取5_10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1000r/min離心5分鐘，棄上清，加入I毫升冰浴預(yù)冷的70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4°C固定2小時(shí)，IOOOg左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。去上清后在每管細(xì)胞樣品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液(Beyotime)，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37°C避光溫浴30分鐘，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光。結(jié)果如圖3所示，R62轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，有部分細(xì)胞停滯在G2/M期。實(shí)施例4、R62誘導(dǎo)惡性細(xì)胞凋亡按實(shí)施例3對(duì)SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h時(shí)用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Beyotime)進(jìn)行凋亡染色，先將細(xì)胞按實(shí)施例3進(jìn)行清洗和重懸，取10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，1000r/min離心5分鐘,棄上 清,加入195μ IAnnexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；加入5μ I Annexin V-FITC，輕輕混勻；室溫(20-25 °C )避光孵育10分鐘;1000r/min離心5分鐘，棄上清，加入190 μ I Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；加入10 μ I碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置30min ;隨即進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。對(duì)用R62轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析說(shuō)明，R62除了使部分細(xì)胞停滯在G2/M期外，還使部分細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。這就能嚴(yán)重干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，起到抑制惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。如前述方法獲得R62并轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，觀察了導(dǎo)入后腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):R62導(dǎo)入該惡性細(xì)胞后，與未導(dǎo)入R62的惡性細(xì)胞相比，生長(zhǎng)速率顯著變慢；部分細(xì)胞被阻抑在細(xì)胞周期的G2/M期；轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改， 這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸,其選自: (a)核苷酸序列如SEQID NO:1所示的核糖核酸； (b)核苷酸序列如SEQID NO:4所示的脫氧核糖核酸； (c)在嚴(yán)格條件下能夠與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且具有抑制腫瘤功能的多核苷酸； (d)與(a)或(b)限定的核苷酸序列有70%以上相同性且具有抑制腫瘤功能的多核苷酸； (e)將(a)或(b)限定的核苷酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制腫瘤功能的多核苷酸；或 (f)核苷酸序列與(a)-(e)任一限定的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸。
2.—種構(gòu)建物，其中包括:表達(dá)調(diào)控元件，以及與之操作性連接的權(quán)利要求1所述的多核苷酸，且該多核苷酸是脫氧核糖核酸。
3.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建物,其特征在于,所述的表達(dá)調(diào)控元件包括:啟動(dòng)子,終止子。
4.權(quán)利要求1所述的多核苷酸或權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建物的用途，用于制備抑制腫瘤的藥物。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的藥物還用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的藥物還用于使得細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯于G2/M期。
7.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤是肝癌。
8.—種藥物組合物，其包括:權(quán)利要求1所述的多核苷酸或權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建物；以及藥學(xué)上可接受的載體。
9.一種制備藥物組合物的方法，其包括:將權(quán)利要求1所述的多核苷酸或權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建物與藥學(xué)上可接受的載體混合。
10.一種抑制腫瘤細(xì)胞的方法，包括:給予腫瘤細(xì)胞權(quán)利要求1所述的多核苷酸或權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有腫瘤細(xì)胞抑制功能的多核苷酸。首次發(fā)現(xiàn)來(lái)自C/EBPβ基因的3’非翻譯區(qū)的多核苷酸片段能夠獨(dú)立地行使抑制腫瘤細(xì)胞的功能，且這一抑制功能的發(fā)揮不需要C/EBPβmRNA的其它部分的參與。本發(fā)明的多核苷酸在新型抗癌藥物的開(kāi)發(fā)方面具有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103215256SQ20121001785
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者劉定干, 孫達(dá)權(quán), 王瑩 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院