專利名稱：一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫藥領域領域，尤其涉及一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒及其制備方法。
背景技術：
多糖硫酸酯是多糖衍生物，由多糖鏈單糖分子上的某些羥基被硫酸根取代而形成。多糖硫酸酯大致可分成兩類，一類是天然的硫酸化多糖，如動物糖胺聚糖、褐藻多糖硫酸酯、卡拉膠等。此類藥物需通過分離、純化獲得，來源有限，提純工藝復雜，價格昂貴，產品質量不易控制。另一類是人工半合成產物，通過簡單分離獲得豐富的天然多糖，經硫酸酯化結構修飾獲得多糖硫酸酯，制備工藝簡單，產物成本低，易通過控制反應條件按目標產物的結構進行化學合成。我國是食用菌、藥用菌生產大國，年產量2000多萬噸，占世界總產量的60%以上。以茯苓為例，茯苓國內年產量高達1萬多噸。茯苓多糖含量占干菌核的90%以上，提取、純化相對容易，開發成本低。開發利用真菌多糖這一廉價的豐富資源具有巨大的工業價值。多糖硫酸酯藥學活性十分廣泛，具有抗凝血、抗血栓形成、抗病毒(HIV、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、流感病毒等)、降血脂和抗腫瘤等活性，尤其是其抗艾滋病的功能已引起國內外許多研究者的極大興趣，且硫酸根取代度越高，抗病毒活性越強。1987年原聯邦德國的Beyer與Hoechst公司合作，人工合成硫酸化木聚糖用于艾滋病的治療。硫酸化右旋糖酐鈉鹽(Dextran sulfate sodium)已是臨床治療II a及II b型高血脂癥和保護血管內皮的藥物。眾多研究表明茯苓多糖多為帶少量1，6分支的β -1，3葡聚糖。申請人所在實驗室一直從事多糖的硫酸酯化人工半合成及藥效學實驗研究。目前，已通過中試確定茯苓多糖硫酸酯生產的最佳工藝路線和質量分析監控體系，產品產量、性質穩定，成本較低；藥效學實驗揭示本茯苓多糖硫酸酯屬于低毒或無毒物質，具有抗凝血、抗血栓和抗腎衰作用(參見中國專利 200410013931. 1,200410064766. 2、生物學雜志，2004，21 (1) 36、中國藥學雜志，2005，40(12) :908)。但是，不論是天然硫酸化多糖還是人工半合成多糖硫酸酯，由于分子量大，含有大量硫酸基、羧基陰離子基團而呈強極性，口服吸收比較困難。如肝素廣泛用于血栓栓塞性疾病、彌漫性血管內凝血等疾病的治療，給藥方式基本為靜脈注射和皮下注射，并需要住院觀察。為了方便多糖硫酸酯類藥物給藥，減輕病人和醫院的住院負擔，開發緩釋(降低粘膜出血的副作用)、高效的口服制劑迫在眉睫。采用納米粒制劑技術，將這類藥物和腸吸收載體殼聚糖有機結合，可以實現該類藥物口服吸收。口服給藥無創傷，最為方便和經濟，至今仍為最主要的給藥方式。但由于有胃腸粘膜屏障和生物降解，像疫苗、蛋白、多糖這類大分子、極性藥物口服生物利用度低或無，長期以來人們一直致力于這類藥物的口服制劑的創新與研制，微粒膠體制劑最具代表性的領域。該領域中尤以脂質體和納米粒的研究最為深入。脂質體的制備重現性差，包封率低，不穩定，對成膜材料質量規格要求高，目前國內少量用于滴眼劑、氣霧劑和外敷制劑中。而復合納米粒制劑由于穩定、包封率高、粒徑小(1-1000 nm)、跨腸粘膜吸收性好、制備工藝不使用有機溶劑和超聲波等優點正逐步被越來越重視。納米粒中充當載體的生物化學材料有很多種，殼聚糖是最突出的一種。殼聚糖又名脫乙酰殼多糖，分子結構為β - (1，4) -2-氨基-D-葡聚糖胺，是自然界唯一帶正電荷的多糖。殼多糖為排在纖維素后的地球第二大生物資源。殼聚糖不僅價格低廉，還具有很多優良特性，如生物相容性好、可生物降解、無免疫原性、無毒副作用。分子水平的研究認為殼聚糖作為跨腸粘膜促吸收的作用機制是其分子上攜帶的正電荷連接到腸粘膜上皮細胞膜上，使得細胞間緊密結合蛋白的結構發生改變，從而導致跨膜通道暫時性、可逆性地開放。近年來，我國人口老齡化程度日益加劇，血栓性疾病的發生率不斷上升，抗血栓藥物市場迅速擴容。根據中國數字醫藥網的檢測數據，2006年，全國使用抗血栓藥物總金額在22億元左右，年增長率為15%-20%。而肝素類產品是目前主要的抗血栓產品，市場份額占抗血栓藥物的50%以上。因此開發代肝素的茯苓多糖硫酸酯類藥物新劑型，方便病人使用，降低用藥成本，提高療效，減輕副作用，必將有廣闊的市場前景。

發明內容
本發明的目的是提出一種成本低、療效好且方便病人使用的口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒及其制備方法。為了實現上述目的本發明采用如下技術方案
一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于其溶解于7<ρΗ<7. 5的37°C左右的溶液中時，不解聚，其粒徑為IOOnm〈粒徑<1000nm，+5mN<zeta電位<+40mV，分散系數<0. 3 ；
其是由下述原料制得茯苓多糖硫酸酯、殼聚糖以及乙酸；殼聚糖與茯苓多糖硫酸酯的重量比為10:0.1-10，所述的乙酸的用量需可完全溶解殼聚糖。所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于所述的殼聚糖脫乙酰度大于60%，其分子量在0. 5-50萬Da之間，所述的乙酸為體積比為0. 1_1%。所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于所述的殼聚糖脫乙酰度大于90%。所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于所述的殼聚糖分子量在1-5萬Da之間。所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于茯苓多糖硫酸酯分子量在0. 5 -5. 0萬Da之間；單糖硫酸根的取代度為1-3。所述的口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟
A、殼聚糖用所述的乙酸完全溶解，茯苓多糖硫酸酯用去離子水配成濃度為0.1%-10%的溶液，在溫度為20-80°C，以及50-1000 rpm攪拌下緩慢將茯苓多糖硫酸酯溶液加入殼聚糖溶液中，持續攪拌0. 5-2小時，此時混合液變混濁，得到穩定的納米膠體溶液；
B、采用噴霧干燥法對所得的納米膠體溶液進行噴霧干燥，噴嘴干燥溫度70-120°C，高溫噴霧干燥，即得產品。
所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于所述的口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒可與適當的賦形劑進一步制作成緩釋或控釋制劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、噴霧劑、氣霧劑、片劑直接服用。包括以下步驟
(1)、茯苓去皮、干燥、粉碎，分3-5次溶于總體積為其10-15倍的0.5 mol/L NaOH中，每次均在4-10 ！浸提多糖5-10 h，合并浸提所得上清液，用10%左右的醋酸將上清液中和至pH6-8，4-10 °C下沉淀過夜，低溫離心收集沉淀，去離子水洗滌沉淀3-5次，再用無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌，70-90 °C干燥，得白色茯苓多糖，研成粉末待用；
(2)、在旋轉蒸發儀的反應瓶中加入氨基磺酸和有機溶劑，預熱至反應溫度80°C左右，氨基磺酸完全溶解后加入步驟(1)所得的干燥的茯苓多糖粉末，多糖和有機溶劑的料液比g:mL =1-20:100，氨基磺酸和茯苓多糖的單糖殘基的摩爾比為2-5:1，反應溫度70-95 °C，反應體系抽真空，旋轉反應0. 2-5小時，轉速60-150 rpm ；
(3)、反應結束后，冷卻至室溫，用飽和堿溶液調反應液pH到9-10，繼續抽真空除氨，當PH值顯著下降至6. 5以下后，再加堿溶液調pH到9-10，再抽真空，如此反復2-10次，直至反應液無氨氣味、PH值維持在7以上為止；
(4)、再向步驟(3)所得的反應液中加其3-5倍體積的95%左右的乙醇，沉淀多糖硫酸酯，過濾后再復溶于水，過濾，放入超濾器中脫鹽并濃縮，用飽和氯化鋇溶液檢測濃縮液中硫酸根的殘留量，直至無白色沉淀，超濾膜分子截留量為3000-15000 Da，濃縮液用其3_5倍體積的95%左右的乙醇沉淀2-5次，最后收集沉淀，80-105 °C烘干粉碎，即得產品。本發明的原理為
本發明利用分子間的靜電作用將茯苓多糖硫酸酯和殼聚糖在合適的酸堿介質中相互包合形成納米膠體溶液，通過調節主藥和載體之間的比例來控制納米粒粒徑大小，以提高藥物口服吸收的生物利用度。本發明公開的納米粒除了具有普通納米粒優點外，還可以進一步延長藥物作用時間，增加產品穩定性，有利于產品長期存放；還可以進一步制作成緩釋(控釋)制劑、膠囊劑、顆粒劑、栓劑、片劑等，即可直接服用，也可以水化后服用。本發明公開的納米粒可以防治血管栓塞、彌漫性血管內凝血、病毒感染和高血脂等疾病。高效、穩定、安全，生物利用度高，副作用小。Chen Mei-Chin等將脫乙酰殼聚糖與肝素復合制備納米粒(Biomaterials，2009，30: 6629 - 6637)，發現殼聚糖的分子量和溶液pH對粒度大小和zeta電位影響很大，使用30KD殼聚糖在pH<7的溶液環境下才能獲得穩定的納米粒，絕對生物利用度高達20. 5%。當pH>7后，納米粒子隨pH值的增大而逐步崩解，殼聚糖和肝素解聚，向溶液中釋放，當殼聚糖釋放足夠多時生成沉淀。眾所周知，胃部PH值遠小于7，殼聚糖-肝素納米粒可完整存在，但胃的吸收能力十分有限，小腸是吸收藥物的主要部位，但從胃向十二指腸的過渡中，由于胰液的分泌，內容物PH值逐步變大，直至大于7，所以上述殼聚糖-肝素納米粒可能在十二指腸、空腸部位還沒有被完全吸收即解聚，影響藥效。殼聚糖產地不同、脫乙酰方法不同，所得產品分子量也不同，但一般分子量可達IO5數量級，達不到制備上述納米粒的要求，使用前必須降解。降解增加成本和工業化難度。本發明主要針對上述納米粒的制備需要使用小分子殼聚糖和溶液介質PH<7的限制。以茯苓多糖硫酸酯取代肝素作為口服納米粒的活性成分，有益于降低藥物成本。人工半合成茯苓多糖硫酸酯及其殼聚糖納米粒制備的生產工藝簡單，工藝條件溫和，對設備無特殊要求，生產過程無固體廢料，溶劑可回收套用。茯苓多糖原材料來源豐富。人工半合成茯苓多糖硫酸酯具有和肝素相似的抗凝血、抗血栓藥效，通過控制反應條件，可以得到高硫酸根取代度、低分子量的產物，有利于口服吸收和增強藥效。本發明的有益效果
1、用茯苓多糖硫酸酯替代肝素，降低成本，弘揚中醫文化，將茯苓多糖硫酸酯制備成口服制劑，方便用藥，大大降低粘膜出血風險，解決硫酸化多糖的口服不吸收問題，開發緩釋、高效的口服制劑，降低這類藥物注射給藥的粘膜出血副作用，減輕病人和醫院的住院負擔；
2、納米粒制備過程中引入高溫噴霧干燥，納米粒結構被“固定化”，使其適合小腸吸收，提高生物利用度，同時殼聚糖也不再需要降解成小分子，可直接使用；
3、本方法制備的納米粒載藥量大、粒徑小、pH<7.5的酸堿環境下穩定性高，可在十二指腸、空腸部位以完整納米粒的形式與小腸粘膜親和透過，藥物在血液中緩釋。本發明工藝過程簡單，不使用有機溶劑，易放大工業化。


圖1為茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒1000倍顯微鏡照片。
具體實施例方式實施例1
一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于其溶解于7<pH<7. 5的37°C左右的溶液中時，不解聚，其粒徑為IOOnm〈粒徑<1000nm，+5mN<zeta電位<+40mV，分散系數<0. 3 ；
其是由下述原料制得茯苓多糖硫酸酯、殼聚糖以及乙酸；殼聚糖與茯苓多糖硫酸酯的重量比為10:0.1-10，所述的乙酸的用量需可完全溶解殼聚糖。所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于所述的殼聚糖脫乙酰度大于60%，其分子量在0. 5-50萬Da之間，所述的乙酸為體積比為0. 1_1%。所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于所述的殼聚糖脫乙酰度大于90%。所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于所述的殼聚糖分子量在1-5萬Da之間。所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于茯苓多糖硫酸酯分子量在0. 5 -5. 0萬Da之間；單糖硫酸根的取代度為1-3。所述的口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟
A、殼聚糖用所述的乙酸完全溶解，茯苓多糖硫酸酯用去離子水配成濃度為0.1%-10%的溶液，在溫度為20-80°C，以及50-1000 rpm攪拌下緩慢將茯苓多糖硫酸酯溶液加入殼聚糖溶液中，持續攪拌0. 5-2小時，此時混合液變混濁，得到穩定的納米膠體溶液；
B、采用噴霧干燥法對所得的納米膠體溶液進行噴霧干燥，噴嘴干燥溫度70-120°C，高溫噴霧干燥，即得產品。所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于所述的口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒可與適當的賦形劑進一步制作成緩釋或控釋制劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、噴霧劑、氣霧劑、片劑直接服用。實施例2
1、茯苓多糖硫酸酯的制備
(1)采用常規堿溶解-酸沉淀的方法從中藥茯苓中提取茯苓多糖，苯酚-硫酸法檢測多糖含量為99. 1。索氏抽提和元素分析結果顯示，所得茯苓多糖中檢測不出蛋白、核酸和脂類物質。粘度法測定粘均分子量為2. 15X IO5 Da
(2)1000ml平底燒瓶中加入吡啶MOml，冷卻至4 °C并攪拌，用分液漏斗慢慢滴加氯磺酸40ml，制備磺化試劑；
(3)向磺化試劑中加入二甲基亞砜(IOOml)預先溶脹的12g茯苓多糖，于75-80 °〇下劇烈攪拌反應1小時；
(4)4NNaOH調pH6，減壓蒸餾去除水和吡啶，一直到蒸干為止；
(5)反應瓶中加500ml熱水溶解，流水透析1天，收集溶液用活性碳脫色；
(6)3倍量的95%乙醇沉淀茯苓多糖硫酸酯，無水乙醇洗滌，真空干燥，得淺黃色粉末13.4 g ；
(7)改良的BaSO4濁度法檢測所得產品硫酸根含量，結果為48.6%，以此計算所得單糖硫酸根取代度為1. 7 ；硝酸銀法檢測NaCl含量小于0. 15% ；
(8)經醋酸纖維素薄膜電泳，甲苯胺藍染色，以已知分子量的肝素、硫酸軟骨素、透明質酸為對照品，檢測所得產品分子量分布范圍為0. 6萬-4. O萬。2、大分子復合法制備茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒
(1)市售高粘度殼聚糖(0. 7-1. O Pa. S)，脫乙酰度>90%，用PH 3的乙酸溶液配成1. 0%乙酸混合溶液，茯苓多糖硫酸酯用去離子水配成0. 1%溶液，在室溫25 °C、快速攪拌(800rpm)下將50mL茯苓多糖硫酸酯溶液逐滴加入500mL殼聚糖乙酸混合溶液中，800 rpm持續攪拌1小時。殼聚糖與茯苓多糖硫酸酯的重量比為100: 1。此時，混合液變混濁，為穩定膠體溶液。8D-1500型噴霧干燥機干燥上述膠體溶液，進風溫度120°C，出風溫度90°C。高溫噴霧干燥產品以1%濃度溶解于37 V左右的、pH7. 5的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，磁力攪拌(200 rpm) 0. 5小時，納米粒不解聚。經過馬爾文粒度儀檢測，粒徑732nm,^ia電位+31mV，分散系數為0. 15，顯微鏡拍出照片如圖1(X1000)。結果說明本發明產品為結構穩定的茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，適合十二指腸、空腸等小腸的吸收。實施例3
1、茯苓多糖硫酸酯的制備
(1)采用常規堿溶解-酸沉淀的方法從中藥茯苓中提取茯苓多糖，苯酚-硫酸法檢測多糖含量為98. 8%。索氏抽提和元素分析結果顯示，所得茯苓多糖中檢測不出蛋白、核酸和脂類物質。粘度法測定粘均分子量為1.98X 105 Da
(2)1000ml梨形瓶中加入二甲基甲酰胺(DMF) 200ml，水浴加熱至80 °C，加入氨基磺酸90 g并完全溶解；(3)加入30g茯苓多糖，氨基磺酸和茯苓多糖單糖殘基摩爾比為5: 1，茯苓多糖與DMF的料液比(g:mL)為15:100 ；梨形瓶接旋轉蒸發儀70 ！旋轉反應3小時，轉速110 rpm,抽真空，真空度達0. 095MPa ；
(4)飽和Na2CO3溶液調反應液pH到9.5 ；繼續抽真空除氨，當pH值顯著下降至6. 5及其以下后，再加Na2CO3溶液調pH到9. 5，再抽真空，如此反復5次，反應液無氨氣味、pH值不再因脫氨下降。(5)反應液中加入4倍體積的95%乙醇，沉淀多糖硫酸酯，過濾后再復溶于水，再過濾，放入超濾器中脫鹽并濃縮，用飽和氯化鋇檢測洗脫液中游離硫酸根的殘留量，直至無白色沉淀；超濾膜分子截留量為10000 Da0(6)濃縮液用5倍體積95%乙醇沉淀3次，最后收集沉淀，90 °C烘干粉碎，得淺黃色粉末，得率115%。(7)元素分析法檢測所得產品硫含量，結果為14. 7%，以此計算所得單糖硫酸根取代度為1. 4 ；
(8)經醋酸纖維素薄膜電泳，甲苯胺藍染色，以已知分子量的肝素、硫酸軟骨素、透明質酸為對照品，檢測所得產品分子量分布范圍為0. 8萬-1. 5萬。2、大分子復合法制備茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒
(1)市售中粘度殼聚糖(0.4-0. 65 Pa. s)，脫乙酰度>90%，用pH 3的乙酸溶液配成1.0%乙酸混合溶液，茯苓多糖硫酸酯用去離子水配成0. 5%溶液，在室溫20 °C、快速攪拌(900rpm)下將50mL茯苓多糖硫酸酯溶液逐滴加入500mL殼聚糖乙酸混合溶液中，900 rpm持續攪拌1小時。殼聚糖與茯苓多糖硫酸酯的重量比為20: 1。此時，混合液變混濁，為穩定膠體溶液。8D-1500型噴霧干燥機干燥上述膠體溶液，進風溫度110°C，出風溫度85°C。高溫噴霧干燥產品以m濃度溶解于37 V左右的、pH7. 5的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，磁力攪拌(200 rpm) 0. 5小時，納米粒不解聚。經過馬爾文粒度儀檢測，粒徑
電位+24mV，分散系數為0. 13。結果說明本發明產品為結構穩定的茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，適合十二指腸、空腸等小腸的吸收。
權利要求
1.一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于其溶解于7<pH<7. 5的37°C左右的溶液中時，不解聚，其粒徑為IOOnm〈粒徑<1000nm，+5mN<zeta電位<+40mV，分散系數 <0. 3 ；其是由下述原料制得茯苓多糖硫酸酯、殼聚糖以及乙酸；殼聚糖與茯苓多糖硫酸酯的重量比為10:0. 1-10，所述的乙酸的用量需可完全溶解殼聚糖。
2.根據權利要求1所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于所述的殼聚糖脫乙酰度大于60%，其分子量在0. 5-50萬Da之間，所述的乙酸為體積比為0.1-1%。
3.根據權利要求1所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于所述的殼聚糖脫乙酰度大于90%。
4.根據權利要求1所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于所述的殼聚糖分子量在1-5萬Da之間。
5.根據權利要求1所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒，其特征在于茯苓多糖硫酸酯分子量在0. 5 -5. 0萬Da之間；單糖硫酸根的取代度為1-3。
6.一種如權利要求1所述的口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟A、殼聚糖用所述的乙酸完全溶解，茯苓多糖硫酸酯用去離子水配成濃度為0.1%-10%的溶液，在溫度為20-80°C，以及50-1000 rpm攪拌下緩慢將茯苓多糖硫酸酯溶液加入殼聚糖溶液中，持續攪拌0. 5-2小時，此時混合液變混濁，得到穩定的納米膠體溶液；B、采用噴霧干燥法對所得的納米膠體溶液進行噴霧干燥，噴嘴干燥溫度70-120°C，高溫噴霧干燥，即得產品。
7.根據權利要求6所述的一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于所述的口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒可與適當的賦形劑進一步制作成緩釋或控釋制劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、噴霧劑、氣霧劑、片劑直接服用。
全文摘要
本發明公開了一種口服茯苓多糖硫酸酯-殼聚糖納米粒及其制備方法，在攪拌下緩慢將茯苓多糖硫酸酯溶液加入殼聚糖溶液中，持續攪拌，此時混合液變混濁，得到穩定的納米膠體溶液，采用噴霧干燥法對納米膠體溶液進行噴霧干燥，噴嘴干燥溫度70-120℃，高溫噴霧干燥，即得產品。本方法制備的納米粒載藥量大、粒徑小、pH<7.5的37℃左右的酸堿環境下穩定性高，可在十二指腸部位以完整納米粒的形式與小腸粘膜親和透過，藥物在血液中緩釋。
文檔編號A61P3/06GK102552153SQ201210062938
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月10日 優先權日2012年3月10日
發明者曹明成, 陳群 申請人:合肥承恩生物技術有限公司