專利名稱：一種可高效高特異滅殺p53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物脂質(zhì)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及ー種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞T-VISA-miR34a治療載體及其藥物T-VISA_miR34a脂質(zhì)體。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害了人類的身體健康。乳腺癌療效較好，但是仍有一部分患者綜合治療后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，對現(xiàn)有藥物療效很 差。microRNAs (miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的ー類長度為18-24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA。它主要通過與靶標(biāo)基因3’ UTR的完全或不完全配對，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、増殖及分化等生命活動。miRNA在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色，發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用，有望成為癌癥治療的作用靶點(diǎn)。因此，迫切需要探索高效靶向殺滅乳腺癌的新藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供ー種高效靶向乳腺癌BCL-2，⑶44靶點(diǎn)，可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的T-VISA-miR34a治療載體。本發(fā)明的可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的T-VISA_miR34a治療載體，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明克隆端粒酶啟動子hTERT，長度為418bp，具有腫瘤細(xì)胞特異性，但其活性在腫瘤細(xì)胞中不到CMV啟動子活性的I %，因此無法廣泛應(yīng)用，本發(fā)明首先將hTERT啟動子控制Gal4-VP2(兩個(gè)拷貝的VP16，具有強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)錄激活特性)融合蛋白基因；再將Gal4-VP2融合蛋白與Gal4效應(yīng)元件G5E4T結(jié)合，啟動靶基因或目的基因的大量轉(zhuǎn)錄 ’然后將WPRE位于目的基因的3-UTR，增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性的作用，由此構(gòu)建得到hTERT_VP16_GAL4-WP RE (VP16-GAL4-WPRE Integrated Systemic Amplifier, VISA,整合性系統(tǒng)放大器)調(diào)控系統(tǒng)，簡稱為T-VISA(整合性系統(tǒng)放大器)系統(tǒng)，最后，結(jié)合miR34a作為治療基因，建立T-VISA-miR34a治療載體，該T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體，其特征在于，包括脂質(zhì)體和被脂質(zhì)體包被的T-VISA_miR34a治療載體，所述的T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述的脂質(zhì)體可以使用按照常規(guī)方法制備的脂質(zhì)體，優(yōu)選是通過以下方法制備的脂質(zhì)體按照I摩爾膽固醇對應(yīng)I. 7摩爾磷脂酰膽堿的比例，秤取磷脂酰膽堿與膽固醇，用磷脂酰膽堿質(zhì)量1/4的氯仿作為溶劑溶解磷脂酰膽堿與膽固醇，將上述溶液置于旋轉(zhuǎn)燒瓶中，旋轉(zhuǎn)燒瓶使其混合均勻，再用真空抽吸器吸干溶劑，得到ー層附著在燒瓶壁上的脂膜；然后再用按8. 9/100ml/g磷脂酰膽堿的量加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋轉(zhuǎn)真空干燥，然后再加入雙蒸水至上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的葡萄糖溶液的體積，在500C的超聲水浴箱中進(jìn)行超聲處理lmin，再在50°C下收集通過O. I μ m的聚碳酸酯膜濾膜的脂質(zhì)體。通過該方法制備的脂質(zhì)體粒徑為ISOnm左右，容許其穿透腫瘤細(xì)胞中極細(xì)的毛細(xì)血管并被細(xì)胞攝取。所述的藥物T-VISA_miR34a脂質(zhì)體優(yōu)選通過以下方法制備的，將上述脂質(zhì)體加入到5%的葡萄糖溶液中使脂質(zhì)體的濃度為8mM，將T-VISA-miR34a治療載體加入到5%的葡萄糖溶液中使T-VISA-miR34a治療載體的濃度為I μ g/ml，然后將脂質(zhì)體溶液和T-VISA-miR34a治療載體溶液混合靜置20min，由此得到藥物T-VISA_miR34a脂質(zhì)體。利用該方法制備得到的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體的粒徑200 300nm，穩(wěn)定性好，在4 8°C，1-2年無降解。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，藥物T-VISA_miR34a脂質(zhì)體與5_氟尿嘧啶脂質(zhì)體存在協(xié)同作用，因此本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物，其特征在于，由藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體和5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體組成。本發(fā)明的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體在體外能高效殺滅P53基因突變的乳腺癌細(xì) 胞系，而對正常細(xì)胞無殺滅作用。由此可見，本發(fā)明的T-VISA-miR34a治療載體經(jīng)脂質(zhì)體包裹輸送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2，CD44靶點(diǎn)，與其3’UTR的完全或不完全配對，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，導(dǎo)致P53基因突變?nèi)橄侔┘?xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞無滅殺作用，可全身給藥，基因表達(dá)量高、時(shí)間長、效率高，藥效確切，毒副作用低，無肝腎毒性，在治療P53突變型乳腺癌中具有廣闊的前景。


圖I是T-VISA_miR34a治療載體的結(jié)構(gòu)示意圖，它是以pUK_21為基本骨架，卡那霉素抗性的可治療性載體；圖2是動態(tài)光散射測量實(shí)施例2制得的脂質(zhì)體(Liposome)和實(shí)施例3的T-VISA-miR34a 脂質(zhì)體(Liposome+T-VISA-miR34a)的粒徑及其分布；圖3是藥物T-VISA_miR34a脂質(zhì)體在體外殺滅P53突變型乳腺癌細(xì)胞系的結(jié)果圖，其中Ctrl表示沒有做任何處理的空白對照，T-VISA-miR34a表示藥物T-VISA_miR34a脂質(zhì)體，P53是指P53基因，M表示突變型，W表示野生型；圖4是藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體抑制BCL2，E2F3的mRNA結(jié)果圖，其中Ctrl表示沒有做任何處理的空白對照；圖5是藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體聯(lián)合5-FU殺傷乳腺癌細(xì)胞的效果圖，其中Ctrl表示沒有做任何處理的空白對照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)ー步說明，而不是對本發(fā)明的限制。一、T-VISA-miR34a 脂質(zhì)體的制備實(shí)施例I :T-VISA-miR34a治療載體的構(gòu)建(一)pCRII-TOPO-hTERT 質(zhì)粒克隆I、常規(guī)方法提取乳腺癌MCF-7細(xì)胞(從美國ATCC公司購買)的DNA。
2、以該DNA作為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增hTERT的PCR引物，hTERT PCR上游(Forward)和下游(Reverse)引物Forward :5' -ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc~3' (XbaI)Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc agegc-3/ 。3、以乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞 DNA 為模板，hTERT PCR 引物(Forward :5' -ata tct agaggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc- ' ；Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccgccc acg tgc gca gca gga cgc age gc~3' )、Pfu DNA polymerase、dNTP 和 PCR 反應(yīng)液，擴(kuò)增獲得hTERT啟動子(-416 to+Ι)產(chǎn)物，其序列如SEQ ID NO. 2所示。其PCR反應(yīng)體系10XPCR buffer 5 μ 1，上游(Forward)和下游(Reverse)引物各 I μ I，MCF-7 細(xì)胞 DNA 為模板 IOOng DN A, 25mM MgCl2 3 μ I，IOmM dNTPs I μ I,Pfu-Taq(IU/ μ I)，最后補(bǔ)水至 50 μ I。PCR反應(yīng)條件94°C熱變性5min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，共進(jìn)行3 O次循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。4、PCR產(chǎn)物用Qiangen公司(美國)PCR DNA回收試劑盒回收，回收約418bp大小片斷。方法參考其說明書。5、將回收的 PCR 產(chǎn)物 2 μ 1，pCRII-TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA) I μ I, DNAligase buffer I μ I,最后補(bǔ)水至 10 μ 1,4°C連接反應(yīng) lOmin。6、將2μ I連接產(chǎn)物與50μ I E. coll DH5 α感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴30min。42 °C水浴熱激動反應(yīng)45sec，然后冰上放置3min。加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基500 μ 1，在37°C下250rpm 震搖 30min。7、取200 μ I LB培養(yǎng)基細(xì)菌液，涂布ampicillin LB培養(yǎng)板上，在37°C下培養(yǎng)16小吋。挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒。8、酶切質(zhì)粒鑒定，進(jìn)行測序分析，證實(shí)hTERT啟動子(其序列如SEQ ID NO. 2所示)已經(jīng)插入克隆載體pCRII-TOPO中，命名為pCRII-TOPO-hTERT。 (ニ)pGL3-hTERT_Luc 質(zhì)粒克隆I、用 KpnI/Xho I 酶切 pCRII-TOPO-hTERT 質(zhì)粒，用 KpnI/Xho I 酶切 pGL-3-basic質(zhì)粒(Promega公司，麥迪遜，WI),該質(zhì)粒中含有突光素酶Luciferase基因。酶切體系IOXBuffer A 2 μ I, KpnI/Xho I I μ 1，質(zhì)粒 5 μ g，補(bǔ)水至 20 μ 1，37°C 水浴 I 小時(shí)。2、酶切產(chǎn)物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收hTERT (418bp大小)片斷和pGL-3-Basis(4792bp大小)片斷。3、酶切產(chǎn)物用Qiangen公司(美國)PCRDNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。4、回收的 hTERT 產(chǎn)物 6μ 1，回收的 pGL-3-basic 產(chǎn)物 2μ 1，DNA ligase I μ I,buffer Ιμ ，最后補(bǔ)水至10 μ 1，4°C連接反應(yīng)4小時(shí)。5、將2μ I連接產(chǎn)物與50μ I E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴30min。42 °C水浴熱激動反應(yīng)45sec，然后冰上放置3min。加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基500μ 1，在37°C下250rpm 震搖 30min。6、取200 μ I LB培養(yǎng)基細(xì)菌液，涂布Ampicillin LB培養(yǎng)板上，在37°C下培養(yǎng)16小吋。挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒。 7、酶切質(zhì)粒鑒定,進(jìn)行測序分析，證實(shí)hTERT啟動子已經(jīng)插入載體pGL_3_basic中，命名為pGL3-hTERT-Luc質(zhì)粒。(三)pGL3-Luc-WPRE質(zhì)粒克隆I、用 Asp718/Sall 酶切 pGEM_3Z_WPRE 質(zhì)粒(Promega 公司，麥迪遜，WI)，然后用DNA polymerase 平端；用 Small 酶切 pGL-3-basic 質(zhì)粒(Promega 公司，麥迪遜,WI)。酶切體系10X Buffer A 2μ 1，Asp718 I μ 1/SalI I μ 1，質(zhì)粒 5 μ g，補(bǔ)水至 20 μ 1，37°C 水浴 I小吋。2、酶切產(chǎn)物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收WPRE (590bp大小)片斷和pG_L3_Basic (約4800bp大小)片斷。3、酶切產(chǎn)物用Qiangen公司(美國)PCRDNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。4、回收的 WPRE 產(chǎn)物 6μ 1，回收的 pGL-3-basic 產(chǎn)物 2μ 1，DNA ligase I μ I, buffer I μ 1，最后補(bǔ)水至10 μ 1，4°C連接反應(yīng)4小時(shí)。5、2 μ I連接產(chǎn)物與50 μ I E. coli DH5感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應(yīng)45sec，然后冰上放置3min。加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基500μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。6、取200 μ I LB培養(yǎng)基細(xì)菌液，涂布Ampicillin LB培養(yǎng)板上，在37°C下培養(yǎng)16小吋。挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒。7、酶切質(zhì)粒鑒定，進(jìn)行測序分析，證實(shí)WPRE插入了 pGL-3-basic中，命名為pGL3-Luc-WPRE 質(zhì)粒。(四)pGU-hTERT-TSTA-Luc質(zhì)粒克隆I、用 Hindlll/Notl 酶切 pCRII-TOPO-hTERT質(zhì)粒(見上)，然后用 DNA polymerase平端；用 MSCI/Nhel 酶切 pGL3_TSTA_Luc 質(zhì)粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)，然后用 DNApolymerase 平端。酶切體系10X Buffer A 2 μ l,HindIII/NotI or MSCI/Nhell μ I,質(zhì)粒5 μ g，補(bǔ)水至20μ 1，37°C水浴I小時(shí)。2、酶切產(chǎn)物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收hTERT (418bp大小)片斷和pGL3-TSTA-Luc(7300bp大小)片斷。3、酶切產(chǎn)物用Qiangen公司(美國)PCRDNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。4、回收的 hTERT 產(chǎn)物 6 μ 1，回收的 pGL3_TSTA_Luc 產(chǎn)物 2 μ 1，DNA ligase I μ I,buffer I μ 1，最后補(bǔ)水至10 μ 1，4°C連接反應(yīng)4小時(shí)。5、2 μ I連接產(chǎn)物與50 μ I E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應(yīng)45sec，然后冰上放置3min。加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基500 μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。6、取200 μ I LB培養(yǎng)基細(xì)菌液，涂布Ampicillin LB培養(yǎng)板上，在37°C下培養(yǎng)16小吋。挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒。7、酶切質(zhì)粒鑒定，進(jìn)行測序分析，證實(shí)hTERT啟動子插入了載體pGL3_TSTA-Luc中，命名為 pGL3-hTERT-TSTA-Luc 質(zhì)粒。(五)T-VISA-Luc質(zhì)粒克隆I、用 Notl/Bglll 酶切 pGL3-Luc_WPRE 質(zhì)粒(見上)；用 Notl/Bglll 酶切pGL3-hTERT-TSTA-Luc 質(zhì)粒(見上)。酶切體系10X Buffer A 2 μ I, NotI I μ I, BglIII μ 1，質(zhì)粒5 μ g，補(bǔ)水至20μ 1，37°C水浴I小時(shí)。
2、酶切產(chǎn)物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收WPRE (590bp大小)片斷和 pGL3-hTERT-TSTA-Luc(7593bp 大小)片斷。3、酶切產(chǎn)物用Qiangen公司(美國)DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。4、回收的 WPRE 產(chǎn)物 6 μ 1，回收的 pGL3-hTERT-TSTA_Luc 產(chǎn)物 2 μ 1，DNA ligaseI μ 1，buffer I μ 1，最后補(bǔ)水至10 μ 1，4°C連接反應(yīng)4小時(shí)。5、2 μ I連接產(chǎn)物與50 μ I E. coli DH5感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應(yīng)45sec，然后冰上放置3min。加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基500μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。

6、取200 μ I LB培養(yǎng)基細(xì)菌液，涂布Ampicillin LB培養(yǎng)板上，在37°C下培養(yǎng)16小吋。挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒。7、酶切質(zhì)粒鑒定，進(jìn)行測序證實(shí)，命名為pGL3-hTERT-TSTA-Luc_WPRE質(zhì)粒，簡稱pGL3-hTERT-VISA-Luc 質(zhì)粒，即 T-VISA-Luc 質(zhì)粒。(六)pGL3-T-VISA_miR34a質(zhì)粒I、以 miRBase 數(shù)據(jù)庫公布的人 has-miR_34a (ΜΙ0000268)序列uggcagugucuuagcugguugu,對應(yīng)的 DNA 序列為TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT,另合成隨機(jī)序列(在人緣內(nèi)無靶點(diǎn))5' -GACUAACGCAAGUCCACUGAU-3'，依據(jù)以上序列設(shè)計(jì)合成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸單鏈，在兩條配對單鏈的5'端分別加入BglII、NheI酶切位點(diǎn)，loop環(huán)序列為CTCGAG。寡核苷酸單鏈(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成)體外復(fù)性成雙鏈(復(fù)性緩沖液IOOmmoI/L Tris-HCl，pH 8. O ；IOmmoI/LEDTA, pH 8. O ；lmol/LNaCl 復(fù)性程序95°C孵育lOmin，關(guān)閉電源緩慢冷卻至室溫)，取5 μ L 500nmol/L的復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。2、用 Bglll/Nhel 酶切 pGL3_hTERT_VI SA-Luc 質(zhì)粒粘性末端，酶切體系10XBuffer A2 μ 1，BglII I μ 1，NheI I μ 1，質(zhì)粒 5 μ g，補(bǔ)水至 20 μ 1，37°C水浴 I 小時(shí)。3、pGL3-hTERT-VISA-Luc質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與復(fù)性has_miR-34a發(fā)夾結(jié)構(gòu)在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收miR_34a shRNA片段(493bp)和pGL3-hTERT-VISA片斷(1650bp)(酶切去除了熒光素酶基因)。4、酶切產(chǎn)物用Qiangen公司(美國)DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。5、回收的 miR-34a shRNA 產(chǎn)物 6 μ 1，回收的 pGL3_hTERT_VISA 產(chǎn)物 2 μ 1，DNAligase I μ 1，buffer I μ 1，最后補(bǔ)水至10 μ 1，室溫連接反應(yīng)過夜。6、2 μ I連接產(chǎn)物與50 μ I E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應(yīng)45sec，然后冰上放置3min。加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基500 μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。7、取200 μ I LB培養(yǎng)基細(xì)菌液，涂布Ampicillin LB培養(yǎng)板上，在37°C下培養(yǎng)16小吋。挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒。8、酶切質(zhì)粒鑒定，進(jìn)行測序證實(shí)，miR-34a shRNA插入到pGL3_hTERT_VISA中，命名為 pGL3-T-VISA-miR34a 質(zhì)粒。(七)pUK21-T-VISA_miR34a治療載體I、用 Notl/Sall 酶切 pGL3-T-VISA_miR34a 質(zhì)粒，酶切體系10X Buffer A 2μ 1，NotI I μ I,Sail I μ I，質(zhì)粒 5 μ g，補(bǔ)水至 20 μ 1，37°C 水浴 I 小時(shí)。用 Notl/Sall 酶切 pUK21質(zhì)粒，酶切體系為10X Buffer A 2 μ I, NotI I μ 1，Sail I μ 1，質(zhì)粒 5 μ g，補(bǔ)水至 20 μ 1，37°C水浴I小時(shí)。2、酶切產(chǎn)物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收T-VISA_miR34a片段(1049bp)和 pUK21 片段(816bp)。3、酶切產(chǎn)物用Qiangen公司(美國)DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
4、回收的 T-VISA-miR34a 產(chǎn)物 6μ 1，回收的 pUK21 產(chǎn)物 2μ 1，DNA ligase I μ I,buffer I μ 1，最后補(bǔ)水至10 μ 1，4°C連接反應(yīng)4小時(shí)。5、2 μ I連接產(chǎn)物與50 μ I E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應(yīng)45sec，然后冰上放置3min。加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基500 μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。6、取200μ1 LB培養(yǎng)基細(xì)菌液，涂布Kanamycin LB培養(yǎng)板上，在37°C下培養(yǎng)16小吋。挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒。7、酶切質(zhì)粒鑒定，進(jìn)行測序證實(shí)，T-VISA-miR34a片段插入到pUK21質(zhì)粒的NotI/SalI位點(diǎn)，命名為pUK21-T-VISA-miR34a治療載體，簡稱T-VISA_miR34a治療載體，經(jīng)測序其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。pUK21-T-VISA-miR34a治療載體是合成的miR_34a shRNA雙鏈經(jīng)復(fù)性后，miR-34ashRNA 片段插入到 pGL3-hTERT-TSTA-Luc_WPRE 質(zhì)粒的 Bgl II/Nhe I / 平端位點(diǎn)，產(chǎn)生pGL3-T-VISA-miR34a 質(zhì)粒。pGL3-T-VISA_miR34a 質(zhì)粒 Notl/Sall 酶切后，T-VISA_miR34a片段插入到PUK21質(zhì)粒的Notl/Sall位點(diǎn)，產(chǎn)生pUK21-T-VISA_miR34a治療載體，簡稱為T-VISA-miR34a治療載體，其結(jié)構(gòu)如圖I所示。pUK21-T-VISA-miR34a治療載體主要包括hTERT啟動子(其序列如SEQ ID NO. 2所示)、WPRE(其序列如SEQ ID NO. 3所示)、G5E4T(其序列如SEQ ID NO. 4所示)和Gal4_VP2基因(其序列如SEQ ID NO. 5所示)和miR-34a shRNA序列(其序列如SEQ ID NO. 6所示)。hTERT啟動子控制Gal4-VP2 (兩個(gè)拷貝的VP16，具有強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)錄激活特性)融合蛋白基因；Gal4-VP2融合蛋白與Gal4效應(yīng)元件G5E4T結(jié)合，啟動micro RNA34a的大量轉(zhuǎn)錄，micro RNA34a與Bcl_2，⑶44等靶標(biāo)基因3’ UTR的完全或不完全配對，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。實(shí)施例2 :脂質(zhì)體的制備將脂質(zhì)從冰箱中取出(D0TAP儲存于_20°C、膽固醇儲存于_4°C )，恢復(fù)至室溫。水浴加熱2個(gè)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分別至30°C，50°C。稱取68. 75mg膽固醇，放入1000ml圓底燒瓶。向圓底燒瓶中加入IOOmg DOTAP和25mg Chloroform。轉(zhuǎn)動燒瓶，使其充分混合。在30°C的水浴箱中旋轉(zhuǎn)圓底燒瓶2min，使其混合均勻，在燒瓶壁上形成ー層薄膜。打開真空抽吸器，30で下30min。加入8. 9ml預(yù)熱的5%葡萄糖溶液溶解已干燥的薄膜,50で下以105轉(zhuǎn)/min快速旋轉(zhuǎn)45min。然后降低溫度至35°C旋轉(zhuǎn)lOmin。用保鮮膜(或石蠟)封ロ燒瓶，室溫下過夜，避光。測量體積，加雙蒸水至8. 9ml。在50°C的超聲水浴箱中(200W)對燒瓶進(jìn)行超聲處理 I 分鐘。在 50°C下依次通過 I. O μ m，0. 45 μ m，0. 22 μ m，0. I μ m 的濾膜(I. O μ m，O. 45 μ m為 Whatman 的 polysufone 濾膜，貨號分別為 #6780-1310 和 #6780-1304 ；0. 22μπι，0· Iym為Whatman的Anotop濾膜，貨號分別為#6808-1122和#6809-1112)，最后通過0. I μ m的脂質(zhì)體放入潔凈的玻璃瓶中。用氮?dú)馓畛湓嚬?0秒，將脂質(zhì)體保存于試管中置于4°C避光保存?zhèn)溆?同時(shí)防止空氣進(jìn)入)。實(shí)施例3 T-VISA-miR34a脂質(zhì)體的制備T-VISA-miR34a治療載體溶于5%葡萄糖溶液，使其終濃度為lug/ul，同時(shí)將存儲濃度(20mM)的實(shí)施例2的脂質(zhì)體用5%葡萄糖溶液稀釋為工作濃度(8mM)。I μ g DNA/ul的T-VISA-miR34a治療載體緩慢加入8mM的脂質(zhì)體中(治療載體脂質(zhì)體=20ug 50ul)，在室溫中靜置20分鐘，反應(yīng)，形成藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體。然后再檢定、生物特性檢測和內(nèi)毒素等質(zhì)控，無菌分裝。成品檢定，包裝，4_8°C保存；使用前先放室溫20分鐘，可直接用于體外研究， 也可用于體內(nèi)研究，也可用5%葡萄糖溶液稀釋后使用。ニ、效果實(shí)驗(yàn)I、T-VISA-miR34a脂質(zhì)體的生物特性對實(shí)施例3獲得的T-VISA_miR34a脂質(zhì)體進(jìn)行生物特性測定，其生物特性如下脂質(zhì)體大小經(jīng)動態(tài)光散射所測的脂質(zhì)體粒徑在180nm左右，包裹質(zhì)粒后粒徑約為 200nm-300nm(見圖 2)。脂質(zhì)體穩(wěn)定性在4-8度1-2年無降解。濃度4mM。2、T-VISA-miR34a脂質(zhì)體的抗乳腺癌活性2. I體外實(shí)驗(yàn)將T-VISA_miR34a脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞系，48小時(shí)后，收集細(xì)胞、裂解，計(jì)算細(xì)胞存活率，以未做任何處理的癌細(xì)胞作為空白對照(即圖中的ctrl)，結(jié)果如圖3所示，由圖3中可以看出，T-VISA-miR34a脂質(zhì)體可高效殺滅P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞，對P53基因野生型乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞沒有明顯殺傷作用。2. 2機(jī)制實(shí)驗(yàn)將T-VISA_miR34a脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，48小時(shí)后，用Trizol (購自Invitrogen公司)收集細(xì)胞，按照Trizol標(biāo)準(zhǔn)操作步驟提取RNA后，Nanodrop (Thermo)定量RNA,后用MMLV (Invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄酶以O(shè)ligdT逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照以下反應(yīng)體系定量PCR檢測BCL2，E2F3，⑶44基因表達(dá)(反應(yīng)體系模版cdnaIuL,IOuM 弓丨物 F/R 各 O. 5uL, SYBRmix IOuL, ddH20 8uL)(檢測引物為BCL2 F 5' -CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG-3' , R5/ -ACTTGTGGCCCAGATAGGCACCCAG-3' ；E2F3 F :5 ' -TGCTTTCGGAAATGCCCTTACA-3 ' , R :5 ' -GATGACCGCTTTCTCCTAGCT-3 ' ;CD44 F 5' -TCAGAGGAGTAGGAGAGAGGAAAC-3'，R :5, -GAAAAGTCAAAGTAACAATAACAGTGG-3')，以上反應(yīng)體系混勻，置于ABI7900HT儀器中，95°C 5min預(yù)變性后，95°C 15s — 65°C 35s (熒光檢測)，40cycles。以未做任何處理的癌細(xì)胞作為空白對照(即圖中的ctrl)，計(jì)算結(jié)果如圖4所示，由圖4中可以看出，T-VISA-miR34a脂質(zhì)體可高效抑制乳腺癌BCL2和E2F3基因的表達(dá)，對CD44mRNA的影響不明顯。2. 3 T-VISA-miR34a脂質(zhì)體聯(lián)合5_FU(5_氟尿嘧啶)用藥效果實(shí)驗(yàn)將T-VISA-miR34a 脂質(zhì)體與 5-FU 混合，終濃度分別為 T-VISA_miR34a 0. 56nM ；5-FU 1. 25ug/mL，然后共轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，以二者単獨(dú)用藥作對照，48小時(shí)后，收集細(xì)胞、裂解，計(jì)算細(xì)胞存活率，以二者単獨(dú)用藥作陽性對照，未做任何處理的癌細(xì)胞作為空白對照(即圖中的ctrl)，結(jié)果如圖5 所示，由圖5中可以看出，T-VISA-miR34a可與5-FU協(xié)同殺傷乳腺癌細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.ー種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的T-VISA-miR34a治療載體，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體，其特征在于，包括脂質(zhì)體和被脂質(zhì)體包被的T-VISA-miR34a治療載體，所述的T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體，其特征在于，所述的脂質(zhì)體是通過以下方法制備的按照I摩爾膽固醇對應(yīng)I. 7摩爾磷脂酰膽堿的比例，秤取磷脂酰膽堿與膽固醇，用磷脂酰膽堿質(zhì)量1/4的氯仿作為溶劑溶解磷脂酰膽堿與膽固醇，將上述溶液置于旋轉(zhuǎn)燒瓶中，旋轉(zhuǎn)燒瓶使其混合均勻，再用真空抽吸器吸干溶劑，得到ー層附著在燒瓶壁上的脂膜；然后再用按8.9/100ml/g磷脂酰膽堿的量加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋轉(zhuǎn)、真空干燥，然后再加入雙蒸水至上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的葡萄糖溶液的體積，在50°C的超聲水浴箱中進(jìn)行超聲處理lmin，再在50°C下收集通過O. I μ m的聚碳酸酯膜濾膜的脂質(zhì)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體，其特征在于，所述的藥物T-VISA_miR34a脂質(zhì)體是通過以下方法制備的將脂質(zhì)體加入到5%的葡萄糖溶液中使脂質(zhì)體的濃度為8mM，將T-VISA-miR34a治療載體加入到5%的葡萄糖溶液中使T-VISA_miR34a治療載體的濃度為I μ g/μ 1，然后將脂質(zhì)體溶液和T-VISA-miR34a治療載體溶液混合靜置20min，由此得到藥物T-VISA_miR34a脂質(zhì)體。
5.一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物，其特征在干，由權(quán)利要求2所述的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體和5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體。可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的T-VISA-miR34a治療載體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體，包括脂質(zhì)體和被脂質(zhì)體包被的T-VISA-miR34a治療載體，所述的T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的T-VISA-miR34a治療載體經(jīng)脂質(zhì)體包裹輸送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2，CD44靶點(diǎn)，與其3’UTR的完全或不完全配對，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞無滅殺作用，可全身給藥，基因表達(dá)量高、時(shí)間長、效率高，藥效確切，毒副作用低，無肝腎毒性，在治療P53突變型乳腺癌中具有廣闊的前景。
文檔編號A61P35/00GK102716498SQ201210064390
公開日2012年10月10日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者伍民慶, 孔亞楠, 李來勝, 肖祥勝, 謝小明, 謝新華, 郭姣麗, 韋尉東 申請人:中山大學(xué)腫瘤防治中心