專利名稱：一種利用果蠅細胞生產病毒樣顆粒的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種利用果蠅細胞生產病毒樣顆粒的方法及應用。
背景技術：
含有完整且具備生化活性包膜蛋白抗原的病毒樣顆粒(VLP)往往在沒有任何佐劑的情況下，能誘導出很好的免疫反應。此外，因VLP不具有遺傳物質因此不具有復制能力和感染性，與減毒和滅活疫苗相比，VLP的生產和接種更具安全性。事實上，在許多動物模型上的試驗中發現VLP已經是一種極具發展潛力的新型疫苗，目前，已有人類的HPV的及乙肝病毒的VLP疫苗上市。在這里需要指出HPV是非包膜病毒，而HBV的VLP僅含有HBV表面蛋白而不含有病毒的核心，因此，由它們衍生出的VLP與包膜病毒所衍生出的VLP相比更 易于大量生產。目前，包膜病毒如流感和HIV的VLP均是由重組桿狀病毒載體轉染的昆蟲細胞、編碼病毒包膜蛋白和核心蛋白的DNA質粒共轉染的酵母細胞或哺乳動物細胞(239T細胞、COS細胞和Veix)細胞)所產生。釋放在細胞上清液中的VLP在形態上與野生流感和HIV病毒非常相似。然而，目前有關用哺乳或酵母細胞生產VLP的大量研究均依賴于瞬轉系統，所產生的VLP僅能滿足于小動物研究，而不足以用于大動物或者人類研究。為克服這種局限性，用于VLP生產的穩定哺乳動物細胞轉染子隨之產生。盡管此法比瞬轉系統產量高，但仍無法滿足對大動物及人類研究的需求量。采用重組桿狀病毒載體轉染的昆蟲細胞可產生出HIV和流感病毒的VLP，所生產出的VLP可誘導體液和細胞免疫反應，并且流感病毒VLP可以保護小鼠免受流感病毒攻毒。同時也嘗試將HA、NA和Ml同時構建到單一的重組桿狀病毒載體中，其轉染昆蟲細胞后產生出的VLP同樣可誘導出很好的免疫反應和免疫保護性。然而，用重組桿狀病毒載體轉染昆蟲細胞的方法所生產VLP有三大缺陷。首先，細胞上清液中既含有VLP又存在重組桿狀病毒。盡管蔗糖密度梯度法顯示重組桿狀病毒顆粒密度低于流感VLP，但很難將兩者分離開，所以制備出的VLP中混雜著很多重組桿狀病毒，這會嚴重影響VLP的免疫原性，并干擾了對VLP的質量控制。其次，在哺乳動物細胞中流感HA和HIV包膜蛋白的最初合成是先在內質網上初步形成HAq和gPl60的前體，然后再分別由細胞內源性蛋白酶剪切成HAl和HA2或者gpl20和gp41。然而迄今為止，所有相關研究顯示重組桿狀病毒載體轉染的昆蟲細胞所產生的VLP含有HAtl和gpl60前體，說明在這種轉染細胞中HAtl和gpl60不能得到正常剪切。盡管現在還不是十分清楚未剪切的HAtl前體的存在對VLP的免疫原性和免疫保護性是否有影響，但在HIV研究中已確定gpl60前體對HIV的感染性和免疫原性的影響是至關重要的。最后，在細胞被重組桿狀病毒感染后，這些細胞只能在有限的時間(通常5到7天)內存活并表達病毒樣顆粒。因此,每當需要生產表達病毒樣顆粒時,就需要新的重組桿狀病毒去感染細胞，這樣，就會造成每一批表達的病毒樣顆粒在數量和質量上有差異。根據有無包膜，從形態學上病毒可分為有包膜病毒和無包膜病毒。有包膜病毒主要通過2種方式獲得包膜。大部分的包膜病毒在從宿主細胞細胞膜(plasma membrane)上芽生時獲得包膜，包括但不限于流感病毒(Influenzavirus)、人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus)、負黏液病毒(paramyxoviruses)、博爾納病病毒(BornaDisease Virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)等。目前公認的此類包膜病毒獲得包膜過程包括以下四步，首先，細胞核或細胞漿里形成病毒核衣殼粒子(viral nucleocapsid),其次,病毒跨膜糖蛋白大量的聚集在細胞膜上,第三步,這些跨膜的病毒糖蛋白胞漿部分與病毒核衣殼粒子相互作用，可能直接作用，或間接作用，或通過中間的細胞骨架蛋白作用，最后，攜帶跨膜病毒糖蛋白的細胞膜逐漸包裹病毒核衣殼粒子，當病毒核衣殼粒子被脂質雙層完全包裹時，病毒顆粒離開感染細胞芽生形成。另一類病毒在胞質膜(cytoplasmic membrane)如內質網膜或高爾基復合體膜上獲得他們的包膜,包括但不限于黃病毒(flaviviruses)、DNA肝病毒(hepadnaviruses),風疫病毒(rubellavirus),冠狀病毒(coronaviruses)、裂谷熱病病毒(Rift Valley fever virus)和布尼亞病毒(Bunyaviridae)等。主要過程為，首先，細胞核或細胞漿里形成病毒核衣殼粒子(viral nucleocapsid),其次,病毒跨胞質膜糖蛋白大量的聚集在胞質膜上,第三步,攜帶跨胞質膜病毒糖蛋白的胞質膜逐漸包裹病毒核衣殼粒子，當病毒核衣殼粒子被完全包裹時，帶包膜的病毒在內質網內芽生形成，第四，帶包膜的病毒芽生出內質網，進入轉移小泡(transport vesicle),轉移小泡帶著帶包膜的病毒進入高爾基復合體(Golgi complex),帶包膜的病毒通過高爾基復合體，第五，高爾基復合體將病毒包裹在胞吐空泡(exocyticvesicles)內，第六,包膜病毒通過胞吐作用(exocytosis)被釋放到細胞外。再如，皰疫病毒(herpesvirus)可能在細胞核內膜(inner nuclear membrane)上獲得包膜,包膜與細胞核外膜(outer nuclear membrane)融合并被釋放入細胞衆,后續過程與上述過程類似。還有一些病毒獲得包膜的機制不清，如魚類虹彩病毒(iridovirus)和痘病毒(poxvirus),但研究發現它們的包膜可能不來源于任何已經存在的細胞膜(pre-existing membrane)。本世紀70年代，科學家初次發現感染病人的血清中不止存在病毒顆粒還存在與之相似的病毒樣顆粒，經研究表明這些是病毒在復制組裝過程中發生缺陷的病毒，這些病毒樣顆粒未能包裹關鍵的病毒整合于宿主基因組的遺傳物質。截至目前，對于VLP的自組裝機制的了解完全基于對病毒感染后本身的復制組裝成熟過程的了解，反之，VLP的模型也為科學家們了解病毒的天然復制過程提供了很好的工具。因此，科學家們對于三類病毒的VLP生產方法的了解認識也基于它們的天然復制成熟的過程。。綜上所述，本領域還需要進一步優化生產VLP的系統或方法，以期獲得免疫原性強，產量高，生產穩定的VLP，用于工業化生產和臨床應用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用果蠅細胞生產病毒樣顆粒的方法及應用。在本發明的第一方面，提供一種生產包膜病毒的病毒樣顆粒的方法，所述方法包括將編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸轉化果蠅細胞，獲得重組病毒樣顆粒生產細胞；培養該重組病毒樣顆粒生產細胞，從而表達獲得病毒樣顆粒。另一優選例中該果蠅細胞為黑腹果蠅S2細胞。在一個優選例中，所述的核酸包括編碼病毒核心蛋白的核酸和編碼包膜病毒抗原、蛋白的核酸。在另一優選例中，所述方法包括 (A)提供表達構建物I，其包括編碼病毒核心蛋白的核酸序列；(B)提供表達構建物2，其包括編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸序列；(C)將(A)和(B)的構建物轉化黑腹果蠅S2細胞，獲得重組病毒樣顆粒生產細胞；和(D)培養(C)的重組病毒樣顆粒生產細胞，從而表達獲得病毒樣顆粒。在另一優選例中，所述的病毒核心蛋白選自人類免疫缺陷病毒Gag蛋白、流感病毒Ml蛋白、猴免疫缺陷病毒Gag蛋白、小鼠白血病病毒Gag病毒核心蛋白、水皰性口炎病毒M病毒核心蛋白、埃博拉病毒VP40病毒核心蛋白、冠狀病毒M和E蛋白、布尼亞病毒N蛋白、 丙型肝炎病毒核心蛋白C、乙型肝炎病毒核心蛋白、SARS冠狀病毒核心蛋白和其組合物。在另一優選例中，所述的包膜病毒為從宿主細胞的細胞膜上芽生時獲得包膜的病毒。在另一優選例中，所述的病毒包括流感病毒、人類免疫缺陷病毒、負黏液病毒、博爾納病病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒。在另一優選例中，所述的表達構建物I和表達構建物2位于一個表達載體上；或所述的表達構建物I和表達構建物2位于不同表達載體上。在另一優選例中，所述的表達載體為非病毒載體。在另一優選例中，所述的表達載體中所用的啟動子為果蠅細胞啟動子,選自MT啟動子或Ac5啟動子。在另一優選例中，所述的非病毒載體選自pMT/V5-His、pMT/BiP/V5_His、PMT-DEST48 或 pMT/V5-His_T0P0。在另一優選例中，所述的方法還包括將編碼病毒顆粒蛋白表達調節因子蛋白的核酸轉化該黑腹果蠅S2細胞。在另一優選例中，所述的方法還包括將抗性篩選基因轉化該黑腹果蠅S2細胞。在另一優選例中，所述的病毒樣顆粒是流感病毒來源的病毒樣顆粒，所述方法包括(Al)提供表達構建物I，其包括編碼人類免疫缺陷病毒Gag蛋白的核酸序列或編碼流感病毒Ml蛋白的核酸序列；(BI)提供表達構建物2，其包括編碼流感病毒神經氨酸酶抗原的核酸序列和/或編碼流感病毒的血凝素抗原的核酸序列；(Cl)將(Al)和(BI)的構建物轉化黑腹果蠅S2細胞，獲得重組病毒樣顆粒生產細胞；和(Dl)培養(Cl)的重組病毒樣顆粒生產細胞，從而表達獲得病毒樣顆粒；附加條件是所述的表達構建物I和表達構建物2位于一個表達載體上；或所述的表達構建物I和表達構建物2位于不同表達載體上。在另一優選例中，步驟(BI)所述的表達構建物2中，所述的編碼流感病毒神經氨酸酶抗原的核酸序列和編碼流感病毒的血凝素抗原的核酸序列位于同一個表達載體上或者位于不同表達載體上。
在另一優選例中，所述的病毒樣顆粒是人類免疫缺陷病毒來源的病毒樣顆粒，所述方法包括(A2)提供表達構建物I，其包括編碼人類免疫缺陷病毒Gag蛋白的核酸序列；(B2)提供表達構建物2，其包括編碼人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白前體Gpl60的核酸序列；(C2)將(A2)和(B2)的構建物轉化黑腹果蠅S2細胞，獲得重組病毒樣顆粒生產細胞；和(D2)培養(C2)的重組病毒樣顆粒生產細胞，從而表達獲得病毒樣顆粒；
附加條件是所述的表達構建物I和表達構建物2位于一個表達載體上；或所述的表達構建物I和表達構建物2位于不同表達載體上。在另一優選例中，還包括提供表達構建物3，其包括編碼人類免疫缺陷病毒的rev的核酸序列；將表達構建物3同表達構建物I和2 —起轉化黑腹果蠅S2細胞。在本發明的另一方面，提供由前面任一所述的方法獲得的病毒樣顆粒。在本發明的另一方面，提供所述的病毒樣顆粒在制備預防、控制或治療下述疾病、病癥或狀況的藥物中的用途流感、艾滋病、麻疹、呼吸道合胞體病毒感染、腮腺炎、肺炎病毒感染、博爾納病、狂犬病、埃博拉出血熱。在本發明的另一方面，提供一種具有免疫原性的組合物，所述的組合物包含(a)所述的病毒樣顆粒；和(b)藥學上可接受的載體。在另一優選例中，所述的組合物中還包括免疫佐劑。在本發明的另一方面，提供一種疫苗組合，所述組合包括(i)抗原蛋白；或表達抗原蛋白的構建物，其中含有編碼該抗原蛋白的抗原核酸序列；(ii)病毒樣顆粒，所述的病毒樣顆粒由前面任一所述的方法獲得。在本發明的另一方面，提供一種用于生產病毒樣顆粒的試劑盒，包括(I)表達載體,包括表達構建物I，其包括編碼病毒核心蛋白的核酸序列；和表達構建物2，其包括編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸序列；和(2)果蠅S2細胞。在另一優選例中，所述的試劑盒的(I)中，表達載體還包括表達構建物3，其包括編碼調節病毒顆粒蛋白表達的蛋白質(regulator of exPression of virion Protein)的核酸序列的；和/或表達構建物4，其包括抗性篩選基因的序列；附加條件是所述的表達構建物I和/或表達構建物2和/或表達構建物3和/或表達構建物4位于一個表達載體上或位于不同表達載體上。在本發明的另一方面，提供一種果蠅細胞，該果蠅細胞包含用于生產包膜病毒的病毒樣顆粒的載體。該果蠅細胞優選黑腹果蠅S2細胞。在另一優選例中，所述的生產包膜病毒的病毒樣顆粒的載體包括編碼病毒核心蛋白的核酸和編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖I、制備 HIV VLP (pDOL)所用的質粒示意圖。其中，Gpl60 (HIVenv),rev (HIVrev)和Gag(HIVgag)分別代表編碼HIV_lGpl60 (pDOL)蛋白的基因、編碼Rev蛋白的基因和編碼全長的Gag蛋白的基因。Selection Marker表示用于陽性克隆篩選的質粒(含有Hygromycin B抗性基因的載體質粒)。圖2、在 CdCl2 誘導和不誘導的情況下，pMT-bip-HIVenv pAC-HIVgag, pMT-rev 和pCoBlast共轉染的S2細胞在細胞裂解液和上清中的HIV gpl20和gag表達檢測。S. P.上清；44 :穩轉的果蠅S2克隆#44 ；1 :誘導的；NI :非誘導的；M :分子量標記；PC :陽性對照(被轉染相同質粒的293T細胞裂解液)；6D或3D :誘導后6或3天收集的上清。其中gpl20為gpl60經剪切獲得的片段，P55gag為全長的gag。檢測P55gag和gpl20的第一抗體分別為抗 HIV-1 gag p24 的特異性抗體(購自 AIDS Reagents and Depositary program,NIAID, NIH ；clone 183-H12)和抗 HIV_lgpl20 的特異性抗體(購自 Advanced BioScienceLaboratories, Inc.公司貨號4317)。二抗為AP偶聯的抗小鼠抗體(購自Promega公司貨、號 s3721)。圖3、蔗糖梯度后HIV VLP(pDOL)樣本的Western Blot鑒定。其中，P.C.:陽性對照(被轉染相同質粒的293T細胞裂解液);marker :分子量標記物；unfraction :濃縮但沒有經蔗糖梯度離心分離的樣本；各泳道的數字(如I. 24等)分別表示各泳道樣品未TCA沉淀前的總量。檢測P55gag和gpl20的第一抗體分別為抗HIV-I gag p24的特異性抗體(購自 AIDS Reagents and Depositary program, NIAID, NIH ；clone 183-H12)和抗 HIV-1gpl20 的特異性抗體(購自 Advanced BioScience Laboratories, Inc.公司貨號 4317)。二抗為AP偶聯的抗小鼠抗體(購自Promega公司貨號s3721)。圖4、HIV VLP (pDOL)電鏡觀察。圖5、HIV VLP(pDOL)免疫后小鼠血清中對HIV-1 gpl20抗體(I 1，000稀釋的血清樣品)抗體活性檢測。PBS對照組、DNA plasmid免疫-VLP(pDOL)/CpG/ISA720免疫組；其中CpG和ISA720是兩種免疫佐劑。圖6、不同稀釋度(滴度)的免疫小鼠的血清樣品對同源(pDOL)和異源(Q168)的HIV-I假病毒抗體中和活性抑制率。#21-24樣品編號。圖7、細胞因子(IFN-Y和TNF-a)標記以測定⑶4和⑶8T細胞對于HIV-1肽的應答。圖8、上圖為制備流感病毒VLP所用的質粒示意圖，其中，Selection Marker為blasticidin抗性基因的載體。流感HA，NA，M1和gag蛋白質粒構建和表達檢測。左側A-C圖顯示以Ml為核心蛋白的HA/NA VLP ;右側A-C圖為以HIV-IGag為核心蛋白的HA/NA VLP。W/0 表示不含有 CdCl2。第一抗體分別為為 Anti-HA (California0609)pAb(購自 eENZYME)，anti-NA抗體選用抗FLAG tag的鼠IgG單抗(購自Sigma公司)，anti-gag (HIV)(購自AIDSReagents and Depositary program, NIAID, NIH ；clonel83-H12)和 anti-Ml(SZ)patientserum(購自 kindly provided by professor Toyota at the IPS), 二抗為 AP 偶聯的抗小鼠抗體(購自Promega公司貨號s3721)。圖9、蔗糖梯度后流感VLP樣本的SDS/PAGE和Western Blot鑒定。上圖為抗HIV-1 gag抗體的鑒定結果；中圖為抗HA血清的鑒定結果；下圖為抗flag tag抗體的鑒定結果。UNF :濃縮但沒有經蔗糖梯度離心分離的樣本；lto 11 :經蔗糖梯度離心分離的樣本。anti-NA抗體選用抗FLAG tag的鼠IgG單抗(購自Sigma公司)，HA免疫血清(用CMV/RHA (Th)質粒肌肉注射BALB/c小鼠三次，注射間隔2 3周，第三次兩周后采集小鼠血液，分離取得HA免疫血清)。圖10、流感VLP電鏡觀察。圖11、同源病毒10MLD50攻毒后小鼠體重改變(左圖)和存活率(右圖)。圖12、異源病毒10MLD50攻毒后小鼠體重改變(左圖)和存活率(右圖)。圖13、同源病毒1，000MLD50攻毒后小鼠體重改變(左圖)和存活率(右圖)。圖14、BALB/c小鼠用1，000MLD50的同源H5N1病毒感染 后大體的病理。(a) PBS對照組的一只代表性小鼠的肺。(b)PBS對照組一只代表性小鼠的下肢局部麻痹。(c)PBS對照組一只小鼠的小腸和大腸松弛。圖15、同源病毒10MLD50攻毒后肺部病理。(a_d)小鼠10MLD50感染(同源(A/Shenzhen/406H/06, clade 2. 3. 4)H5N1病毒)后4天的肺組織用蘇木精和伊紅(HE)染色。其中，(a)為PBS對照組；(b)為同源VLP-VLP組；(c)為同源DNA-DNA組；(d)為異源DNA-VLP 組。圖16、同源病毒I, 000MLD50攻毒后肺部病理。(e_h)小鼠I, 000MLD50感染(同源(A/Shenzhen/406H/06，clade 2. 3. 4) H5N1病毒)后4天的肺組織用蘇木精和伊紅(HE)染色。其中，(e)為PBS對照組；(f)為同源VLP-VLP組；(g)為同源DNA-DNA組；(h)為異源 DNA-VLP 組。圖17、各免疫組的ELISA抗體結合反應結果。圖18、HIV-1 Gag p55 (SEQ ID NO: I)序列。圖19、產生HIV-IVLP (consensus B和C)的代表性S2克隆(VB2)的冷凍電鏡和斷層圖象。A.非線性鹿糖梯度的上帶(upper band)中獲得的代表性的HIV-1VLP (consensusB和C)的冷凍電鏡的橫截面圖象。比例尺為lOOnm。B.非線性鹿糖梯度的下帶(lowerband)中獲得的代表性的HIV-1 VLP (consensus B和C)的冷凍電鏡的橫截面圖象。比例尺為100nm。C.非線性蔗糖梯度的下帶(lower band)中獲得的代表性的HIV-1 VLP的冷凍電鏡斷層圖象(Z-stack)。紅色箭頭指示了刺突的位置。D.由上述冷凍電鏡斷層圖象所合成的HIV-1 VLP的表面模型。圖中白點代表包膜蛋白刺突的位置。圖20、對由DNA-HIV-I VLP (consensus B和C)異源免疫產生的每個免疫血清樣本的ADCC和ADCVI應答。A.用PBS對照鼠和DNA-HIV-I VLP異源免疫鼠的合并血清以及HIV-I病人的合并血清所檢測到的在HIV-1 AD8感染的CEMss-CCR5細胞表面表達的HIV-I包膜蛋白。B.用PKH-26和CFSE熒光染料來染色HIV-1 AD8感染的CEMss_CCR5靶細胞。被染色的靶細胞與來自BALB/c小鼠的脾臟細胞一起孵育(E T = 50 I)，再加上I : 50稀釋PBS對照鼠和DNA-HIV-I VLP異源免疫鼠的每個血清樣本。18小時后，按材料和方法中所述測定ADCC。C. HIV-1 AD8感染的CEMss_CCR5靶細胞與來自BALB/c小鼠脾臟細胞一起孵育(E T = 20 I)，再加上I : 50稀釋PBS對照鼠和DNA-HIV-I VLP異源免疫鼠的每個血清樣本。2天后，用ELISA檢測培養上清中的gag p24蛋白，并按材料和方法中所述的計算方法來算出抑制百分比。D.線性回歸分析的方法來分析PBS對照鼠和DNA-HIV-IVLP異源免疫鼠的每個血清樣本的ADCC抑制百分比和ADCVI抑制百分比之間的相關性。
具體實施例方式本發明人經過多年的深入研究，首次開發了一種穩轉果蠅S2細胞生產病毒樣顆粒的方法。利用本發明的方法生產包膜病毒的病毒樣顆粒，蛋白能夠得到正確的表達、剪切和組裝，最終獲得具有良好的免疫原性的病毒樣顆粒。術語如本文所用，所述的“動物”可以是任何能夠對本發明的病毒樣顆粒生產系統生產的病毒樣顆粒發生免疫應答的動物。包括哺乳動物(包括人，豬、牛、馬、羊、騾等家畜，或其它經濟動物)、家禽(如雞、鴨、鵝)、鳥類(如鵪鶉、觀賞鳥類)等。本發明的病毒樣顆粒生產系統產生的生物病毒樣顆粒可用于人類或動物。本發明中，以鼠作為受試生物，其與人類相比，無論在基因組的組成、個體的發育、代謝方式、器官解剖、疾病發病機制等都非常接近。如本文所用，所述的“抗原蛋白”或“抗原”是指具有免疫原性的蛋白質，或對于構建病毒樣顆粒有用的蛋白質。所述的“抗原蛋白”也包括它們的蛋白變體，只要所述蛋白變·體保留有該“抗原蛋白”的功能或活性。如本文所用，所述的“構建物”是指包含有編碼特定蛋白的核酸序列的、用于轉化細胞的核酸，所述的“構建物”還可包含與編碼特定蛋白的核酸序列操作性連接的啟動子或終止子等。一個或多個構建物可分別包含在一個或多個表達載體中，用于轉化細胞和表達。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區域”，是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。組織或器官特異型啟動子調控下的基因轉錄一般只發生在某些特定器官或組織中。如本文所用，所述的“操作性連接”或“可操作性相連”是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性)的，即具有合理的效益/風險比的物質。如本文所用，所述“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充齊U、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染試劑。對于疫苗，所述的藥學上可接受的載體例如可包括佐劑。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構
成”、“基本上由......構成”、和“由......構成”；“主要由......構成”、“基本上
由......構成”和“由......構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。病毒樣顆粒生產果蜆細胞能在實驗室條件下進行穩定的培養(Schneider, J. Embryol. Exp.MorphoI. 27 :353(1972))。許多含有特定編碼序列的載體系統可通過果蠅熱激啟動子和COPIA 啟動子插入到果妮基因組中(DiNocera et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. . USA 80:7095(1983))。而且，熱激啟動子的mRNA能在果蠅細胞中大量翻譯(McGarry et al.，Cell42 :903(1985))oB.J. Bond等揭示了黑腹果蠅肌動蛋白5C基因的結構(B.J. Bond et al, Mol.Cell. Biol. ,6(6) :2080(1986))。該報道還討論了肌動蛋白5C基因的兩個起始位點，這兩個位點在啟動子序列之間融合；細菌氯霉素乙酰轉移酶基因插入到黑腹果蠅宿主細胞中。大腸桿菌gal K基因在果蠅細胞系中表達時受到黑腹果蠅啟動子的調控(H. Johansen et al,28th Annual Drosophila Conference, p.41 (1987))。多篇文獻均討論了潮霉素B(hygromycin B)選擇系統(A. Vanderstraten et al,Proceedings of the 7th International Conference on Invertebrate and Fish TissueCulture,Abstract,University of Tokyo Press,Japan, (1987) ；A. Vanderstraten et al,in" Invertebrate and Fish Tissue Culture" , Eds. Y. Kuroda et al,Japan ScientificSocieties Press, Tokyo,pp.131-134, (1988))。本發明不限于特定的果蠅細胞系，較佳的，本發明使用的果蠅細胞系為黑腹果蠅S2細胞系。S2細胞是一種穩定的多倍體果蠅胚胎細胞(Schneider, J. Embryol. Exp.Morph. 27 :353(1972))。將gpl60或其剪切體形式gpl20或gp41、或其其他派生物的cDNA編碼序列通過DNA轉染技術導入果蠅S2細胞可生產大量的HIV env蛋白。表達tPA也能獲得相似的結果。使用果蠅S2細胞有許多優點，包括但不限于，它能在室溫下進行高密度生長。穩定的篩選系統已獲得了高達1000個拷貝的表達單元插入宿主細胞基因組中。其他的果蠅細胞系統也可在本發明中使用，如無血清細胞系-KC-O黑腹果蠅細
胞系(Schulz et al, Proc, Nat' I Acad. Sci. USA, 83 :9428 (1986))。但早先的研究表明KC-O細胞系轉染比S2細胞系轉染難。另一種可用的細胞系是來自Drosophila hydei的細胞系，該細胞系能用于蛋白表達，但是，蛋白表達效率較低(Sinclair et al, Mol. Cell.Biol.，5 :3208(1985))。其他本發明可用的果蠅細胞系還包括SI細胞系和S3細胞系。本發明使用的果蠅細胞能在多種合適的培養基中培養，包括M3培養基。M3培養基PH值為6. 6，由一系列平衡鹽以及必須氨基酸組成。培養基的制備見文獻描述(Lindquist，DIS, 58 :163(1982))。其他常規培養基也可用于果蠅細胞培養。較佳的啟動子為黑腹果蜆啟動子(Lastowski-Perryet al, J. Biol. Chem. , 260 1527(1985))。該誘導型啟動子能在CuS04存在的情況下高水平轉錄基因。在表達系統中使用黑腹果蠅啟動子，在高拷貝數的情況下也能維持調節能力。然而在哺乳動物細胞中金屬離子對于哺乳動物metalIothionein啟動子的調節能力是隨著拷貝數的增加而減弱的。 在果蠅表達系統中，維持的誘導效力增加了在基因高拷貝數的情況下，基因的表達量。果蠅肌動蛋白5C基因啟動子(B. J. Bond et al,Mol. Cell. Biol. ,6 :2080(1986))也是一種理想的啟動子序列。肌動蛋白5C基因啟動子是一種組成型啟動子，它不需要額外金屬離子的誘導。所以，該啟動子可能比黑腹果蠅啟動子更適用于大規模生產系統。該啟動子的另一個優點是在沒有高濃度銅離子的培養基中，細胞能夠長時間保持更好的狀態。其他果蠅啟動子還包括誘導型熱激(Hsp70)啟動子和COPIA LTR啟動子。SV40早期啟動子系統的表達水平比黑腹果蠅啟動子系統低。通常用于細胞表達載體中的啟動子如arian Rous肉瘤病毒LTR和猿病毒(SV40早期啟動子)，他們在果蠅系統中的功能及表達能力均較差。本發明所述的果蠅S2細胞是一種商業化的細胞,例如可購自Invitrogen公司。現有技術中，所述的果蠅S2細胞常規被應用于外源蛋白的表達與生產。S2細胞可在室溫條件下生長并且不需要C02。由于果蠅S2細胞能夠半懸浮生長，所以可實現高密度地生長。外源蛋白用可誘導的啟動子(如MT啟動子)或穩定表達的啟動子(如Ac5啟動子)表達出來。而且，多種外源信號肽在S2細胞中都可以將分泌蛋白正常釋放出來。盡管果蠅S2細胞已被用于生產多種外源蛋白，但尚未有研究報道采用此系統從 包膜和非包膜蛋白病毒中生產VLP。本發明人經過了大量地研究工作，發明了用果蠅S2細胞來高效地生產病毒樣顆粒(VLP)的方法，特別是用于生產針對流感病毒的病毒樣顆粒以及針對HIV病毒的病毒樣顆粒。本發明人首次在所述的果蠅S2細胞中被轉入編碼病毒核心蛋白的核酸序列以及編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸序列以生產包膜病毒的病毒樣顆粒。較佳地，該包膜病毒為從宿主細胞的細胞膜上芽生時獲得包膜的病毒。作為本發明的優選方式，所述的果蠅S2細胞中還被轉入包含編碼病毒顆粒蛋白表達調節因子蛋白(Rev)的核酸序列的表達構建物，其有助于更高效地形成病毒樣顆粒。Rev蛋白，即調節HIV病毒顆粒蛋白表達的蛋白質(regulator of exPression of virionProtein) 0 Rev蛋白是一個重要的調節HIV基因復制的反式激活因子。對HIV調節蛋白有負調控作用，對病毒顆粒蛋白有正調控作用，其主要功能是促進HIV基因表達由早期(轉錄調節蛋白mRNA)向晚期(轉錄HIV結構蛋白mRNA)的轉化,并促進晚期轉錄的進行。在rev基因缺陷的HIV原病毒，僅有早期基因表達。只有在加入Rev蛋白后，晚期基因才開始轉錄。另外，Rev蛋白還在轉運結構蛋白mRNA進入細胞質的過程中發揮作用，這可能是經過在核內抑制RNA加工系統或增強RNA轉運系統來完成的。編碼病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的片段或變體的抗原核酸序列也是可用的。所述的片段或變體(衍生物或類似物)是指基本上保持所述的病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。所述的病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。所述的病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的片段至少保持50%的所述全長蛋白的活性。在更優選的條件下，所述片段能夠保持全長蛋白的 60%,70%,80%,90%,95%,99%^ 100%的活性。所述的編碼病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的片段或變體的核酸序列可以是經過密碼子優化的，這種密碼子優化可以是根據果蠅S2細胞的偏好設計的。一些商業化的軟件可用于進行密碼子優化的設計。本發明所述的構建物可以是或來自于表達載體。本發明對所述的表達載體沒有特別的限制，只要其包含了一些對于蛋白表達必要的元件，且這些元件可操作性相連。只要能在本發明的果蠅S2細胞內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。作為本發明的優選方式，所述的表達載體中，啟動子為果蠅細胞啟動子，例如選自MT啟動子或Ac5(AC)啟動子。事實上，果蠅細胞中的其它啟動子也可適用于病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的表達。 包含上述的適當的抗原核酸序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質，最終形成病毒樣顆粒。所述的宿主細胞是果蠅S2細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行，例如磷酸鈣轉化(轉染)法。利用本發明的系統可大量地、高效地生產出病毒樣顆粒。生產方法是將所述的構建物轉化所述的病毒樣顆粒生產細胞，獲得重組病毒樣顆粒生產細胞；和培養所述的重組病毒樣顆粒生產細胞，從而表達獲得病毒樣顆粒。本發明的系統僅采用質粒轉化細胞來獲得病毒樣顆粒，其產生出的病毒樣顆粒中不存在重組病毒污染。作為本發明的優選方式，所述的構建物是構建物組合，例如包括構建物1，其中包括以下操作性連接的元件啟動子，人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白前體Gpieo ;構建物2，其中包括以下操作性連接的元件啟動子，病毒顆粒蛋白表達調節因子；和構建物3，其中包括以下操作性連接的元件啟動子，核心蛋白gag。該構建物組合在轉化果蠅S2細胞后，包膜蛋白前體Gpl60可在S2細胞中正確地、適當地剪切成為gpl20和gp41，最終能夠非常高效地獲得病毒樣顆粒，其免疫原性非常高。作為本發明的優選方式，所述的構建物是構建物組合，例如包括構建物1，其中包括以下操作性連接的元件啟動子，流感病毒的血凝素抗原(HA);構建物2，其中包括以下操作性連接的元件啟動子，流感病毒的神經氨酸酶抗原(NA);和構建物3，其中包括以下操作性連接的元件啟動子，流感病毒的基質蛋白Ml。該構建物組合在轉化果蠅S2細胞后，HA和NA包膜蛋白可有效地組裝成VLP，能夠從細胞中釋放出來，其顆粒大小與野生病毒十分相似，其免疫原性非常高。作為本發明的優選方式，所述的構建物是構建物組合，例如包括構建物1，其中包括以下操作性連接的元件啟動子，流感病毒的血凝素抗原(HA);構建物2，其中包括以下操作性連接的元件啟動子，流感病毒的神經氨酸酶抗原(NA);和構建物3，其中包括以下操作性連接的元件啟動子，人類免疫缺陷病毒的核心蛋白gag。該構建物組合在轉化果蠅S2細胞后，HA和NA包膜蛋白可有效地組裝成VLP，能夠從細胞中釋放出來，其顆粒大小與野生病毒十分相似，其免疫原性非常高。
其它形式的帶有病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的核酸序列以及必要的基因表達元件(如啟動子)的構建物也包含在本發明中，只要它們能夠在轉化果蠅后獲得所述的病毒樣顆粒。由此，S2系統所生產出的病毒樣顆粒能克服重組桿狀病毒載體轉染的昆蟲細胞所生產VLP時出現弊端。病毒樣顆粒和組合物本發明還提供了具有免疫原性的病毒樣顆粒，其基本上由本發明所述的病毒樣顆粒生產系統以及方法制備獲得。機體免疫系統的MHC I型和MHC II型對以顆粒狀形式存在的外源性抗原的提呈較對可溶性單體抗原的提呈要強1000或10000倍，即以顆粒狀形式存在的抗原比可溶性單體抗原具有更強的免疫原性，機體免疫系統的MHC I型和MHC II途徑對以顆粒狀形式存在的外源性抗原的提呈較對可溶性單體抗原的提呈要強1000或10000倍，即以顆粒狀形式存在的抗原比可溶性單體抗原具有更強的免疫原性。本發明還提供所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒的用途，根據所采用的編碼抗原蛋白的核酸序列的不同，其用于治療不同的微生物感染疾病。所述的微生物感染疾病在例如(但不限于)感冒、獲得性免疫缺陷綜合征、肺炎、肝炎、氣管炎、皰疹、眼內炎、角膜炎、麻疹、腮腺炎、麻疹、水痘或帶狀皰疹。當所述當抗原蛋白是來源于流感病毒或HIV病毒當情況下，所述當病毒樣顆粒用于預防或治療感冒或獲得性免疫缺陷綜合征。本發明還提供一種具有免疫原性的組合物(預防性或治療性的疫苗)，所述的組合物包含有效量的本發明所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒，和藥學上可接受的載體。所述的藥學上可接受的載體指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到關于藥學上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化齊U、pH緩沖物質和穩定劑，如白蛋白等。可將所述的組合物制成各種適合于哺乳動物給藥的劑型，所述劑型包括但不限于注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑；較佳地為注射劑。動物實驗表明，利用本發明的具有免疫原性的病毒樣顆粒制成的病毒樣顆粒免疫動物后，可在動物體內產生高效價的抗體。在使用時，是將安全有效量的本發明所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒施用于哺乳動物(如人)，其中該安全有效量通常至少約I微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約I微克/千克體重-約I毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。作為本發明的一種方式，所述的組合物中還包括免疫刺激劑或佐劑。例如ISA720、CpG ODN或ISA51等。然而，本發明人的研究結果表明，在不添加任何佐劑的情況下，所述的病毒樣顆粒也具有很好的免疫原性并且異源DNA-VLP免疫策略能夠誘導出較好的中和抗體活性和CTL反應。在流感病毒的攻毒模型中，該策略顯示了完全的免疫保護性。、
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人,分子克隆實驗室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第3版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法細胞
將從Invitrogen公司購買的果蜆S2細胞在添加了 10 %胎牛血清(GIBCO catnol6000)的 Express FIVE SFM(GIBCO cat no 10486)培養基在 28°C無 C02 環境下培養，直至達到每毫升0. 5至2X IO6個細胞濃度時再用于轉染。質粒構建HIV-I包膜(HIVenv)和Rev基因(HIVrev)序列，以及編碼流感M1、HA和NA的基因是用PCR，重疊PCR或recursive PCR來產生。重組質粒構建如下pMT-bip-HIVenv (pDOL)的構建將HIV 包膜蛋白原始質粒 CMV/R_Gpl60 pD0L(購自 AIDS Reagents andDepositary program,NIAID,NIH)上編碼包膜蛋白的核酸序列通過PCR方法擴增(引物正向ctagaattcaacagagaagctgtggg(SEQ ID NO 2):反向GATGCGGCCGCTTACTTTCC(SEQ IDNO :3))然后插入到果蜆 S2 表達載體 pMT-bip vector(購自 invitrogen)的 Bglll’EcoRI位點。HIVenv (pDOL)的氨基酸序列和堿基序列分別如Genbank登錄號AAC82596和AF033819. 3(5771bp-8341bp)所示。pMT_biP-gpl60 (consensus B 和 C)的構建以HIV-lconsensus B和C包膜基因為模板，PCR擴增缺失信號肽的編碼HIVconsensus B 和 C gpl60 的 cDNA(如 Kothe, D. L et al, Virology 360 :218-34 和Virology352 :438-49中方法構建)，將擴增序列插入TA vector (Invitrogen)。測序后，將正確的序列切下插入pMT/BiP/V5-His (Invitrogen)的EcoR I和Xho I位點，獲得的質粒命名為 pMT/BiP-gpl60 (consensus B 和 C), respectively。Gpl60/consensus B 的序列如 SEQ ID NO :14 或 Gene Bank :DQ667594 所不。Gpl60/consensus C 的序列如 SEQ ID NO :15 或 Gene Bank :DQ401075 所不。pMT-bip-HIVrev 的構建將HIVrev 原始質粒 pZeoSV/rev (購自 IPS, Institut Pasteur of Shanghai)上編碼rev的核酸序列通過PCR方法擴增(引物正向CtaRaattcaccatRRcaRRaaRaaR(SEQ IDNO 4)和反向AGTGCGGCCGCCTATTCTTTAGC(SEQ ID NO :5))然后插入到 pMT-bip vector 的EcoR I 和 Not I 位點。HIVrev的氨基酸序列和堿基序列分別如Genbank登錄號CAA41586和X58781所
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pMT-HIVgag 和 pAC-HIVgag 的構建將HIVgag 原始質粒 P55M(I-IO)(如 Ralf Schneider et al. Journal ofVirology 1997 :4892-4903中方法構建)上的gag相應核酸序列通過recursive PCR方法(參見 Ai-Sheng Xiong et al Nature Protocol 1(2)2006:791)擴增(引物正向gtcgaattcaccatgggtgcga(SEQ ID N0:6)，反向GTAGCGGCCGCTTATTGTGACG(SEQ ID NO :7))然后分別插入到 pMT/V5_His A (購自 Invitrogen)和 pAc5. l/V5_His A (購自 Invitrogen)的 EcoR I/Not I 位點。
·
HIVgag的堿基序列(見圖18)。pMT-bip-HA 的構建將HA 原始質粒 CMV/R HA(Th)(如 Tsai C，et al Vaccine. 2009Novl2 ；27(48)6777-90中方法構建)上的HA ORF中aal9_aa568的相應核酸序列通過PCR方法擴增(引物正向GGGAGATCTTGCATCGGATACCACG(SEQ ID NO :8)，反向CCCGAAITCTCAGATGCAGATTCTGC(SEQ ID NO :9))后插入到 pMT-bip vector 的 Bglll，EcoRI 位點。HA的氨基酸序列和堿基序列分別如Genbank登錄號AAS65615和AY555150. 2(lbp-1718bp)中所記載。pMT-bip-NA 的構建將NA 原始質粒 CMV/R NA (Th)-FLAG (如 Tsai C，et al Vaccine. 2009Novl2 ；27(48) :6777-90中方法構建)上的NA ORF全長的相應核酸序列通過PCR方法擴增(引物正向GGGGGATCCATGAATCCTAATAAGAAGATCAT(SEQ ID NO: 10)，反向CCCGAATTCCTCACTTATCGATTGTAAAAGGCA(SEQ ID NO :11))后插入到 pMT-bip vector 的 Bglll，EcoRI 位點。NA的氨基酸序列和堿基序列分別如Genbank登錄號AAS65616和AY555151. 3(21bp-1370bp)中所記載。pAC-Ml 的構建將Ml 原始質粒 CMV/R Ml (SZ)(如 Tsai C，et al Vaccine. 2009Novl2 ；27(48)6777-90中方法構建)上的Ml全長的相應核酸序列通過PCR方法擴增(引物正向CGGGAATT CACCATGAGTCTTCTAACCGAGG(SEQ ID NO: 12)，反向CCCTCTAGATCACTTGAATCGCTGCATCTG(SEQ ID NO :13))后插入到 pGEM T easy vector (購自 Progema)中，再由上述質粒中用EcoR I切下目的片段插入至pAc5. 1/V5-His A的EcoR I位點。Ml的氨基酸序列和堿基序列分別如Genbank登錄號AB036645和EF137707. l(lbp-759bp)中所記載。產生穩定轉染的果蠅S2細胞株為生產HIV VLP(pDOL)，本發明人構建了三個質粒第一個編碼HIV-I的包膜蛋白(HIVenv (pDOL)，又稱為Gpl60 (pDOL))，包膜蛋白的編碼基因插入在可誘導的MT啟動子后，該質粒為 pMT-bip-HIVenv (pDOL);第二個(pMT-HIVgag)和第三個(pAC-HIVgag)均編碼HIV-1 gag蛋白，編碼基因分別插入在可誘導的MT啟動子和穩定性的Ac5啟動子之后。用磷酸|丐轉染的方法將(第一個4. 75 ii g和第二個9. 5 ii g)或(第一個4. 75 ii g和第三個9. 5 u g)質粒連同4. 75 u g pMT-bip-HIVrev以及Iug含有Hygromycin B抗性基因的載體質粒的 pCoBlast (購自 Invitrogen 公司，cat no R210-0IBlasticidin S HCl)一同轉入S2細胞。轉染后48個小時，將hygromycin B加入到培養液中，于室溫無CO2的條件下培養2 3周直到穩定轉染的細胞株出現。由此穩轉細胞株產生的VLP命名為HIVVLP(pDOL)。用抗HIV-1 gag蛋白的抗體和包膜蛋白的單克隆抗體通過蛋白免疫印跡法對穩定轉染的細胞株在使用和不使用5 u molCdCl2誘導3天時對細胞裂解液和細胞培養上清中的HIV-1 gag蛋白和包膜蛋白的表達均進行了檢測。發明人還構建了pMT/BiP_gpl60 (consensus B 和 C),將 4.75iig pMT/BiP-gpl60 (consensus B 和 C)與 9. 5 u g pAC-HIVgag, 4. 75 u g pMT-bip-HIVrev 以及 lug含有Hygromycin B抗性基因的載體質粒的pCoBlast —同轉入S2細胞，同上獲得穩定轉染的細胞株。由此穩轉細胞株產生的VLP命名為HIV VLP (consensus B和C)。為了產生流感病毒VLP，本發明人首先比較了以流感病毒Ml蛋白和HIV-1 gag蛋白為核心蛋白時所產生出的流感病毒VLP顆粒的不同。構建了插入在穩定性啟動子Ac5后 面的編碼流感病毒Ml蛋白的質粒(pAC-Ml)和插入在誘導性啟動子MT后面的編碼流感病毒HA和NA蛋白的質粒(pMT-bip-HA和pMT-bip-NA)。如前面所述，這些質粒，即pAC_Ml，pMT-bip-HA 和 pMT-bip-NA (用于形成 H5N1HA-NA-M1VLP)；或 pAC-HIVgag，pMT-bip-HA 和pMT-bip-NA (用于形成H5N1HA-NA-HIV-1 gag VLP)分別和含有blasticidin抗性基因的載體pCoBlast (購自Invitrogen公司)一起轉入S2細胞并挑出穩定轉染的S2細胞株。然后對廣生的VLP的表達和組裝進彳丁研究。鑒定S2細胞中的轉基因可正常表達后，采用有限稀釋法產生穩定轉染的S2細胞克隆。通常情況下，本發明人從穩定轉染的S2細胞株中挑選20個克隆通過蛋白印跡分析方法鑒定出高表達病毒樣顆粒的克隆。病毒樣顆粒的生產和鑒定在建立出可高產量生產出VLP的穩定轉染的S2細胞株后，將細胞置于150平方厘米的細胞培養瓶中于完全培養基(10%胎牛血清的Express Five SFM培養基)中進行培養，直至細胞濃度達到500 X IO7個。然后收集細胞置于2L的旋轉培養瓶中在含有500ml新鮮培養基(不外加10%胎牛血清的Express Five SFM)中進行培養。收集細胞培養上清液中的VLP濃縮7倍。然后將濃縮的上清液于4°C條件下20000rpm離心2. 5小時(BeckmanCoulter, Fullerton, CA)。將粒子重浮于PBS中，于-80°C冰箱中存放。也可以采用帶有WAVEP0D過程控制單元的微波生物反應器20/50EHT系統(GEHealthcare)，并以分批加料的培養方式培養S2克隆，從而生產HIV_1 VLP和流感病毒VLP。首先，在300ml完全的Express FIVE SFM培養基中接種6X 108S2細胞，將其置于2L細胞袋并在28°C無C02環境下培養。起始的搖擺速度為22rpm，搖擺角度為8°，至第3天，將搖擺速度增加至26rpm，搖擺角度增加至9°。培養至第5、7、8天，分別加入300、200、200ml新鮮的完全Express FIVE SFM培養基。第8天，在培養基中加入CdCl2至終濃度5 U M，用于誘導表達HIV-I包膜蛋白和流感病毒HA、NA蛋白。誘導3天以后，收集培養上清，于4°C離心出，000 Xg) 30分鐘棄沉淀，上清再用0.45 iim過濾器過濾。用帶有50，000NMWCHollow Fiber Cartridge (Model UFP-50-C-4MA)的 QuixStand Benchtop 系統將濾過的上清濃縮5倍。通過20%的蔗糖緩沖液超速離心來收集濃縮上清中的HIV-1 VLP或流感病毒VLP，并重懸于PBS中，分裝并儲藏于_80°C冰箱。在11天的加料分批培養中，每24小時收集少量的細胞上清。細胞的數量及活性通過臺盼藍排斥實驗計算。HIV-1 VLP的量通過檢測 HIV-1 gpl20 和 gag p55 來測定。
為鑒定VLP的特性，采用SW41轉子、25000轉速及4°C條件下對上述重浮的粒子進一步25-65%蔗糖梯度離心16小時。從離心管頭部到底部的各梯度中收集了 12個組份，每份為0.96ml。TCA沉淀后。通過12% SDS-PAGE分離，并轉移到PVDF膜上。蛋白印跡封閉于含有5%的脫脂奶粉和0. I %的吐溫20的Tris鹽酸緩沖液中，隨后與第一抗體抗HIV-Igag p24的抗體、HIV-lgp l60的抗體、抗HIV-1 gpl20的抗體、抗HIV-1 gp41的抗體、抗HA抗體，抗NA抗體或抗Ml抗體孵育，使用二抗為AP偶聯的抗小鼠抗體(Promega)檢測并顯色，以上均可按廠商推薦操作。為進一步鑒定HIV和流感VLP，生產VLP的細胞和濃縮的VLP粒子在用2. 5%戊二醛固定30分鐘后再用1%的四氧化鋨固定。固定好的樣本用50-100%濃度逐漸遞增的酒精脫水，然后包埋于環氧樹脂混合物中。在60°C溫度下聚合72小時。超薄切片用乙酸雙氧鈾染色，最后通過透射電鏡(model JEM 1230，JEOL Ltd.，Japan)進行觀察和拍照。為了檢測HIV-1 VLP的HIV-I包膜蛋白的量，用Iii g/ml抗HIV-1 gpl20 C5捕獲抗體(Santa cruz Cat. #4302)包被96孔EIA/RIA平板(Costar)過夜。包被后的平板用含有5% BSA的PBS于37°C封閉I小時。將含有VLP的培養上清、VLP的濃縮樣本、或作為標準品的連續稀釋(稀釋液10% BSA，0.5% Triton X-IOOin PBS)的純化gpl20蛋白(同Proc Natl Acad Sci USA 91 :8314-8中描述制備)加到包被的96孔板中，并于37°C孵育2小時。然后用PBST緩沖液(0. 05% Tween 20in PBS)洗平板5次。加入按I : 2，000稀釋的抗gpl20抗體(Santa cruz Cat. #4301),再孵育I小時。加入按I : 5，000稀釋的結合有辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗鼠IgG(Chemicon)。使用TMB底物試劑盒(Pierce)進行比色分析，用分光光度計(BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)讀取450nm下的吸光度。以純化gpl20蛋白的量制作標準曲線從而計算HIV-1 VLP的HIV-I包膜蛋白的量。為了檢測HIV-1 VLP的gag p55的量，將含有VLP的培養上清、VLP的濃縮樣本、或作為標準品的倍比稀釋的p24標準品(從400ng開始)(Aalto BioReagents)置于4_12%Bis-Tis膠(Invita)gen)上，然后轉移至PVDF膜。然后用含有5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，隨后用抗gag p24抗體檢測。抗原可直接由按I : 5，000稀釋的結合有辣根過氧化物酶(HRP)的抗鼠IgG抗體(MultiSciences)以及EZ-ECL底物(Thermo)指示。通過比較待測樣本(HIV-1 VLP)中p55和p24標準品的條帶密度，使用Quantity One軟件(Bio-Rad)確定HIV-1 VLP的Gag的量。抗高致病性禽流感H5N1 (highly pathological avian influenza, HPAI)的免疫
與攻毒H5N1HA-NA-HIV-1 gag VLP收獲后，濃縮，用PBS過夜溶解，做血凝實驗來定量(Webster, R. G. , Cox,N. , andStohr,K. (2002)WHO Manual on Animal Influenza Diagnosisand Surveillance. Available from http://www.who. int/csr/resources/publications/influenza/whocdscsrncs20025)。免疫時每只小鼠注射相當于29個HA血凝單位的禽流感H5N1 VLP0年齡6-8周的雌性BALB/c小鼠隨機分成4組，每組6只。免疫和攻毒時間如表I。第一組小鼠(PBS):對其兩只后腿共肌肉注射200uL PBS (pH7. 4)進行初次免疫和加強免疫。第二組小鼠(VLP-VLP):初次免疫和加強免疫用含有29個HA血凝單位的禽流感H5N1VLP的200uL PBS進行肌肉注射。第三組小鼠(DNA-DNA):初次免疫和加強免疫均用將含有IOOug編碼H5HA的質粒DNA(pMT-bip-HA)的 200uL PBS 進行肌肉注射。第四組小鼠(DNA-VLP):肌肉注射含IOOug編碼H5HA的質粒DNA (pMT-bip-HA)的200uL PBS進行初次免疫，再肌肉注射含有29個HA血凝單位的禽流感H5N1VLP的200uLPBS進行加強免疫。第7天初次免疫，第28天加強免疫。在初次免疫的前7天和加強免疫的后7天收集血清樣本，于56°C熱滅活，分裝保存于_80°C。加強免疫后的兩周(第42天)，用50ul IOMLD5tl(10個動物半數致死量)同源H5N1 病毒 A/Shenzhen/406H/06，subclade 2. 3. 4(參見 NEngl J Med. 2007 ；357(14) 1450-1451)，和異源 H5N1 病毒 A/Cambodia/P0322095/05，clade I (參見 Viruses. 2009 ；
I(3) :335-36)，或者用50ul I, OOOMLD50同源H5N1病毒和異源H5N1病毒對每組小鼠進行攻毒。每日觀察記錄小鼠的病理特征，如昏睡、脫發及體重降低等特征。攻毒4天后，從每個免疫攻毒小組中選I只小鼠處死后，取肺部組織用于組織病理學檢測。而對于其它小鼠，若體重較原始體重減少20%或更多時，將被實施安樂死，統計上記為死亡。期間所有的操作都將嚴格依據農業部下達的關于關注和使用實驗動物的指導方針、動物福利行動、及農業部下達的微生物生物化學實驗室生物安全指導方針進行。表I、免疫和攻毒時間表
權利要求
1.一種生產包膜病毒的病毒樣顆粒的方法，其特征在于，所述方法包括 將編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸轉化果蠅細胞，獲得重組病毒樣顆粒生產細胞；培養該重組病毒樣顆粒生產細胞，從而表達獲得病毒樣顆粒。另一優選例中該果蠅細胞為黑腹果蠅S2細胞。
2.如權利要求I所述的生產方法，其特征在于，所述的核酸包括編碼病毒核心蛋白的核酸和編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (A)提供表達構建物I，其包括編碼病毒核心蛋白的核酸序列； (B)提供表達構建物2，其包括編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸序列； (C)將(A)和⑶的構建物轉化黑腹果蠅S2細胞，獲得重組病毒樣顆粒生產細胞；和 (D)培養(C)的重組病毒樣顆粒生產細胞，從而表達獲得病毒樣顆粒。
4.如權利要求2和3所述的方法，其特征在于，所述的病毒核心蛋白選自人類免疫缺陷病毒Gag蛋白、流感病毒Ml蛋白、猴免疫缺陷病毒Gag蛋白、小鼠白血病病毒Gag病毒核心蛋白、水皰性口炎病毒M病毒核心蛋白、埃博拉病毒VP40病毒核心蛋白、冠狀病毒M和E蛋白、布尼亞病毒N蛋白、丙型肝炎病毒核心蛋白C、乙型肝炎病毒核心蛋白、SARS冠狀病毒核心蛋白和其組合物。
5.如權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的包膜病毒為從宿主細胞的細胞膜上芽生時獲得包膜的病毒。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的病毒包括流感病毒、人類免疫缺陷病毒、負黏液病毒、博爾納病病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒。
7.如權利要求3所述的方法,其特征在于,所述的表達構建物I和表達構建物2位于一個表達載體上；或所述的表達構建物I和表達構建物2位于不同表達載體上。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的表達載體為非病毒載體。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的表達載體中所用的啟動子為果蠅細胞啟動子，選自MT啟動子或Ac5啟動子。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的非病毒載體選自pMT/V5-His、pMT/BiP/V5-His、pMT_DEST48 或 pMT/V5-His_TOPO。
11.如權利要求1-2所述的方法，其特征在于，還包括將編碼病毒顆粒蛋白表達調節因子蛋白的核酸轉化該黑腹果蠅S2細胞。
12.如權利要求1-2所述的方法，其特征在于，還包括將抗性篩選基因轉化該黑腹果蠅S2細胞。
13.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的病毒樣顆粒是流感病毒來源的病毒樣顆粒，所述方法包括 (Al)提供表達構建物1，其包括編碼人類免疫缺陷病毒Gag蛋白的核酸序列或編碼流感病毒Ml蛋白的核酸序列； (BI)提供表達構建物2，其包括編碼流感病毒神經氨酸酶抗原的核酸序列和/或編碼流感病毒的血凝素抗原的核酸序列； (Cl)將(Al)和(BI)的構建物轉化黑腹果蠅S2細胞，獲得重組病毒樣顆粒生產細胞；和(Dl)培養(Cl)的重組病毒樣顆粒生產細胞，從而表達獲得病毒樣顆粒； 附加條件是所述的表達構建物I和表達構建物2位于一個表達載體上；或所述的表達構建物I和表達構建物2位于不同表達載體上。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，步驟(BI)所述的表達構建物2中，所述的編碼流感病毒神經氨酸酶抗原的核酸序列和編碼流感病毒的血凝素抗原的核酸序列位于同一個表達載體上或者位于不同表達載體上。
15.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的病毒樣顆粒是人類免疫缺陷病毒來源的病毒樣顆粒，所述方法包括 (A2)提供表達構建物I，其包括編碼人類免疫缺陷病毒Gag蛋白的核酸序列； (B2)提供表達構建物2，其包括編碼人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白前體Gpl60的核酸序列； (C2)將(A2)和(B2)的構建物轉化黑腹果蠅S2細胞，獲得重組病毒樣顆粒生產細胞；和 (D2)培養(C2)的重組病毒樣顆粒生產細胞，從而表達獲得病毒樣顆粒； 附加條件是所述的表達構建物I和表達構建物2位于一個表達載體上；或所述的表達構建物I和表達構建物2位于不同表達載體上。
另一優選例包括提供表達構建物3，其包括編碼人類免疫缺陷病毒的rev的核酸序列；將表達構建物3同表達構建物I和2 —起轉化黑腹果蠅S2細胞。
16.由權利要求1-15任一所述的方法獲得的病毒樣顆粒。
17.權利要求16所述的病毒樣顆粒在制備預防、控制或治療下述疾病、病癥或狀況的藥物中的用途流感、艾滋病、麻疹、呼吸道合胞體病毒感染、腮腺炎、肺炎病毒感染、博爾納病、狂犬病、埃博拉出血熱。
18.一種具有免疫原性的組合物，其特征在于，所述的組合物包含 (a)權利要求16所述的病毒樣顆粒；和 (b)藥學上可接受的載體。
19.如權利要求18所述的組合物，其特征在于，所述的組合物中還包括免疫佐劑。
20.一種疫苗組合，其特征在于，所述組合包括 (i)抗原蛋白；或表達抗原蛋白的構建物，其中含有編碼該抗原蛋白的抗原核酸序列； (ii)病毒樣顆粒，所述的病毒樣顆粒由權利要求1-15任一所述的方法獲得。
21.一種用于生產病毒樣顆粒的試劑盒，包括 (1)表達載體，包括表達構建物I，其包括編碼病毒核心蛋白的核酸序列；和表達構建物2，其包括編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸序列；和 (2)果蠅S2細胞。
22.如權利要求21所述的試劑盒，其特征在于，(I)中，表達載體還包括表達構建物3，其包括編碼調節病毒顆粒蛋白表達的蛋白質的核酸序列的；和/或表達構建物4，其包括抗性篩選基因的序列； 附加條件是所述的表達構建物I和/或表達構建物2和/或表達構建物3和/或表達構建物4位于一個表達載體上或位于不同表達載體上。
23.—種果蠅細胞，其特征在于，該果蠅細胞包含用于生產包膜病毒的病毒樣顆粒的載體。該果蠅細胞優選黑腹果蠅S2細胞。
24.如權利要求23所述的果蠅細胞，其特征在于，所述的生產包膜病毒的病毒樣顆粒的載體包括編碼病毒核心蛋白的核酸和編碼包膜病毒抗原蛋白的核酸。全文摘要
本發明涉及一種利用果蠅細胞生產病毒樣顆粒的方法及應用。利用本發明的方法生產包膜病毒的病毒樣顆粒，蛋白能夠得到正確的表達、剪切和組裝，最終獲得具有良好的免疫原性的病毒樣顆粒。本發明還提供了表達所述病毒樣顆粒的重組細胞，以及含有所述病毒樣顆粒的組合物。
文檔編號A61K48/00GK102676461SQ20121007313
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月19日 優先權日2011年3月17日
發明者丁衡, 周保羅, 周梵, 宋宇峰, 楊立飛, 蔡車國 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所