專利名稱：竹葉青蛇毒l-氨基酸氧化酶的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法及應用，屬于生物醫學技術領域。
背景技術：
長期以來，一直被認為是“不治之癥”的腫瘤是醫藥界研究熱門課題之一。現有的抗腫瘤藥物療效很有限，而且大多有嚴重的副作用，使用效果遠遠沒有達到人們的預期。目前市場上還有一類免疫治療藥物，即經過激活人的免疫功能以達到促進攻擊癌細胞的藥物也不少，但因各種癌細胞本身具有免疫力，所以療效并不理想。因此，目前抗腫瘤藥物的開發也成為本世紀新藥研究的重大課題。蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一種有潛力的抗腫瘤制劑，具有廣闊的臨床應用前景，但目前采用提取蛇毒L-氨基酸氧化酶的工業化生產還不現實。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法及應用，為研制新型的抗腫瘤藥物打下基礎并使得大規模制備蛇毒L-氨基酸氧化酶成為可能。為解決上述技術問題，本發明采用如下的技術方案一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法。該方法按照下列步驟進行(I)竹葉青蛇毒毒腺總RNA的提取和RT從_70°C冰箱取出竹葉青蛇的毒腺，置于研缽中磨成粉末，然后按RNA提取試劑盒說明提取竹葉青總RNA ；以抽提的總RNA為模板反轉錄為cDNA，反應按照Promega公司逆轉錄試劑盒手冊進行，其反應體系為42°C 60min,95°C 10min，4°C保存；(2)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的PCR擴增以cDNA為模板，根據Genebank中公布的竹葉青L-氨基酸氧化酶的基因序列的開放閱讀框利用Primer Primer 5. O軟件設計引物進行PCR擴增；所述引物中，上游引物為含 BamHI 酶切位點 5’ -CGCGGATCCCCACAGTCTTCAAGCCAATA-3 ';含 HindIII 酶切位點 5， CCCAAGCTT GGGACTATAGCTCCTAGAAT-3'；(3) PCR擴增產物的回收將PCR擴增產物于O. 8 %瓊脂糖凝膠中進行電泳分離30min后，在紫外燈下觀察并切下含有目的條帶的凝膠，按照膠回收試劑盒說明回收DNA片段，回收產物保存于_20°C ；(4)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的克隆與測序將擴增竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶目的片段與pMD18-T載體連接，然后轉化感受態細胞，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，并將其鋪于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養基平板中進行培養，在37°C培養12 16h后觀察結果；挑取菌落進行接種在含50 μ g/mL氨芐青霉素(AMP)的LB培養液中，取2μ L為模板進行PCR鑒定，陽性的克隆菌株進行測序；
(5)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶序列分析通過BLAST搜索與其同源性高的基因序列，通過ORF Finder軟件預測竹葉青蛇毒 L-氨基酸氧化酶基因開放閱讀框，并用BLAST驗證；用信號肽預測軟件Signal IP進行信號肽預測，并通過BLAST搜索與竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因閱讀框編碼的氨基酸序列同源性高的其他同系物,并作比較。上述的竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法，步驟⑵中，PCR反應體系為 2 X TaqPCR MasterMix 25μ L ;cDNA 產物3μ L ;無菌水19 μ L，上下游引物各 I. 5μ L ;反應程序為95°C預變性5min ;95°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸45s，循環擴增30次，最后 72°C延伸 IOmin0竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶作為制備抗腫瘤藥物的應用。為驗證竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的治療效果，發明人進行了一系列的實驗，其結果如下I.試劑與材料I. I試劑IPTG，Sigma公司產品;Taq酶，捷瑞生物公司產品；BamH I和Hind III， MBI 公司產品；SDS,TaKaRa 公司產品；DNA Marker DL2000,TaqPCR MasterMix,BL21 (DE3), 大連寶生物公司產品；DNA回收試劑盒，QIAGEN公司產品產品；PCR引物，由上海生工合成； pMD18-T-ALAg,由貴陽中醫學院微生物實驗室制備；Pet28a(+), Invitrogen產品。I. 2材料竹葉青蛇毒，采自貴州省思南縣；白兔，購自貴陽醫學院實驗動物中心； 癌細胞株，購于中科院細胞所。2 方法2. I兔抗竹葉青蛇毒LAAO陽性血清的制備竹葉青蛇毒用甲醛脫毒后，按《海峽藥學》，2009，21 (12) :217_220 (張明芳、齊元麟)“眼鏡蛇毒L-氨基酸氧化酶的純化、性質鑒定及細胞毒性測定”方法進行純化竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶，加油佐劑(濃度為O. 2g/L)，免疫分為基礎免疫和超免疫，在兔子的背部兩側肌肉注射(O. Iyg)進行基礎免疫，每次間隔3周，在皮下和肌肉、穴位交替進行加強免疫，每只兔子lmg，每次免疫間隔2周。免疫后采用瓊脂擴散試驗測免疫血清效價，達到 28時進行采血分離血清。2. 2質粒DNA的小量提取從冰箱取出含pMD18-T-LAA0的DH5 α的EP管于冰浴溶解，1000r/min離心5min， 加入IOyL的LB液體培養基，37 °C 200rpm振蕩培養lh，涂布于含有氨芐青霉素(Amp， 100 μ g/mL)的LB瓊脂平扳上，37°C培養12 16h，挑取菌落進行加入100 μ L的LB液體培養基培養，離心取沉淀進行質粒DNA提取。2. 3Pet28a (+) -LAAO 構建和酶切鑒定pMD18-T-LAA0和Pet28a(+)質粒經BamH I和Hind III分別進行雙酶切，回收目的片段進行連接并轉化DH5 α，并將其鋪于含有Amp的LB培養基平板中，挑取單個菌落加入 LB液體培養基中在37°C培養過夜，PCR檢測為陽性菌落進行抽提質粒DNA。采用BamH I和 Hind III進行雙酶切鑒定，將雙酶切鑒定正確的菌株送往大連寶生物公司測序。2. 4重組蛋白誘導表達及SDS-PAGE將測序正確的菌株抽提Pet28a(+)_LAA0質粒轉化BL21(DE3)，加入100 μ L的LB液體培養基，370C 200rpm培養lh，涂布于含有Amp的LB瓊脂平扳上37°C培養12 16h，挑取單個菌落進行PCR，PCR陽性菌株加入5mL培養物經IPTG誘導表達3h，同時設未經IPTG誘導表達菌株作為對照。取誘導和未誘導的細菌培養物離心后，分別取沉淀和上清液按I : I 的比例加入2x上樣緩沖液于煮沸5min，瞬間離心。在樣品孔內分別加入待檢樣品(10 μ L/ 孔)進行電泳，同時設標準蛋白Marker，采用考馬斯亮藍R-250進行染色。2. 5重組蛋白的純化按I : 100比例將培養過夜的BL21 (DE3)接種到新的LB液體培養基中，37°C培養至OD55tl= 1.0。在IPTG誘導表達3h進行大量表達，收集誘導表達菌。用I % PBS (pH 7.2) 洗滌菌體2次，然后用菌體裂解液重懸菌體并經超聲破碎來裂解菌體，最后收集沉淀在4°C 溫度下lOOOOgxlOmin離心，并通過去污劑的充分洗滌得到包涵體。將包涵體溶解于7mol/ L尿素中，經梯度透析復性法復性，即獲得初步純化的復性液，過濾除菌后備用。2. 7ffestern-blot將純化蛋白進行SDS-PAGE，電泳結束后進行轉膜和Western-blot分析。用0. OlM PBS洗膜3次，5min/次(以下同);加入包被液室溫孵育2h ;棄包被液，洗膜；加入兔抗竹葉青蛇毒陽性血清(按I : 500的比例)，4°C孵育12h以上；棄一抗，洗膜3次；加入羊抗兔辣根過氧化物酶偶聯的二抗(作I : 8，000稀釋)，室溫孵育2h;棄二抗，用PBS洗膜4 次；加入顯色液(TMB)避光顯色。2. 8重組蛋白對抑瘤率的影響分別取出凍存人鼻咽癌、人宮頸癌和卵巢癌細胞株復蘇后進行培養。用0.2%臺盼藍染色計數活細胞率。當活細胞率彡95%時，調整細胞數為I X IO6個/ml，分別于小鼠右腋下注射接種0. 2ml/只。建立小鼠鼻咽癌、人宮頸癌和卵巢癌實體瘤模型。動物隨機分5組其中3個組為人鼻咽癌、人宮頸癌和卵巢癌細胞株組，接種癌細胞24h后，每組又分為重組蛋白高、中、低劑量三個小組(100、50和20mg/kg)灌胃；另外2 個組分別為PBS陰性和CTX陽性對照組腹腔注射(0. lml/10g體重)。所有動物每天給藥I 次，連續10d。停藥第2d脫頸處死小鼠，剖取瘤塊進行稱重，采用腫瘤抑制率(％)=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重X 100公式計算抑瘤率。停藥后觀察小鼠存活天數，計算小鼠生命延長率。生命延長率(％)=(給藥組平均存活天數-對照組平均存活天數)/對照組平均存活天數X 100。2. 9數據統計用SPSS軟件進行分析，統計結果用“X土s”來表示。3 結果3. lPet28a(+)ALAg 質粒的酶切鑒定將Pet28a(+)_LAA0質粒轉化大腸桿菌后DH5 α，挑取單個菌落提取質粒，用BamH I和Hind III進行雙酶切鑒定，可得到pET32a(+)載體骨架片段和750bp IOOObp的目的片段，目的片段與預期大小相符(圖I)。結果表明，LAAO基因片段已連接到Pet28a⑴載體中。3. 2SDS-PAGE 和 Western-blot 分析將構建Pet28a(+)-LAAO轉化E. coli DH5 α，挑取陽性克隆進行測序，將正確的克隆菌的質粒轉化到Ε. coli BL21中進行誘導表達，取菌液離心取上清，沉淀經超聲波破碎后離心，分別經SDS-PAGE分析發現表達蛋白主要以包涵體表達。取誘導表達3h的菌液進行 SDS-PAGE，表達產物大小約為58kDa，而含空載體的細菌經誘導后無大小為58KDa條帶，將純化后的蛋白進行Western-blot分析,結果發現含空載體菌表達產物不能和兔抗竹葉青蛇毒LAAO陽性血清發生反應，而含重組載體菌表達產物能與兔抗陽性血清發生反應，結果如圖2。3. 2重組蛋白對荷瘤小鼠抑瘤率的影響純化蛋白對荷瘤小鼠抑瘤率實驗結果表明，小鼠灌服重組蛋白后，低、中、高3個劑量組(50、100、150mg/kg體重，此劑量為換算成藥物劑量)對小鼠實體瘤均有明顯的抑制作用。3個劑量組與陰性對照組相比，實體瘤重明顯降低，體積變小，抑瘤率分別達到 55. 3%,55. 4%和60. 3%。結果分析顯示低、中、高劑量組與陰性對照組比較，差異均極顯著(P <0.01)，但與CTX對照組相比較，也均表現為差異極顯著(P <0.01)。表明灌服重組蛋白可顯著的抑制小鼠實體瘤的生長(表1、2和3)。表I重組蛋白對荷瘤小鼠抑瘤率的影響(X土s，η = 10)
權利要求
1.一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法，其特征在于按照下列步驟進行(1)竹葉青蛇毒毒腺總RNA的提取和RT從_70°C冰箱取出竹葉青蛇的毒腺，置于研缽中磨成粉末，然后按RNA提取試劑盒說明提取竹葉青總RNA ；以抽提的總RNA為模板反轉錄為cDNA,反應按照Promega公司逆轉錄試劑盒手冊進行，其反應體系為42°C 60min,95°C 10min，4°C保存；(2)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的PCR擴增以cDNA為模板，根據Genebank中公布的竹葉青L-氨基酸氧化酶的基因序列的開放閱讀框利用Primer Primer 5. O軟件設計引物進行PCR擴增；所述引物中，上游引物為含 BamHI 酶切位點 5，CGCGGATCCCCACAGTCTTCAAGCCAATA-3 '；含 HindiII 酶切位點 5， CCCAAGCTT GGGACTATAGCTCCTAGAAT-3'；(3)PCR擴增產物的回收將PCR擴增產物于O. 8 %瓊脂糖凝膠中進行電泳分離30min后，在紫外燈下觀察并切下含有目的條帶的凝膠，按照膠回收試劑盒說明回收DNA片段，回收產物保存于_20°C ；(4)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的克隆與測序將擴增竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶目的片段與PMD18-T載體連接，然后轉化感受態細胞，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，并將其鋪于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養基平板中進行培養，在37°C培養12 16h后觀察結果；挑取菌落進行接種在含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養液中，取2 μ L為模板進行PCR鑒定，陽性的克隆菌株進行測序；(5)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶序列分析通過BLAST搜索與其同源性高的基因序列，通過ORF Finder軟件預測竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因開放閱讀框，并用BLAST驗證；用信號肽預測軟件Signal IP進行信號肽預測，并通過BLAST搜索與竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因閱讀框編碼的氨基酸序列同源性高的其他同系物，并作比較。
2.根據權利要求I所述的竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法，其特征在于步驟(2)中，PCR反應體系為2XTaqPCR MasterMix 25μ L ;cDNA產物3μ L ;無菌水19 μ L，上下游引物各I. 5yL ;反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，57°C退火30s， 72°C延伸45s，循環擴增30次，最后72°C延伸IOmin0
3.竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶作為制備抗腫瘤藥物的應用。
全文摘要
本發明是一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法及應用，該方法從-70℃的冰箱已保存的竹葉青蛇毒腺進行總RNA的提取，反轉錄成cDNA，根據Genebank中公布的序列(AY277739)利用引物設計軟件進行設計引物，以cDNA為模板，利用RT-PCR技術擴增出竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因，并進行克隆和測序；試驗表明本發明的重組蛋白能被兔抗竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)陽性血清所識別且重組蛋白低、中、高劑量組荷瘤小鼠生命延長率與陰性對照組均存在差異極顯著。本發明為深入開發利用竹葉青蛇毒提供了依據，為進一步研制新型的抗腫瘤藥物打下了良好的基礎，具有廣闊的生產和臨床應用前景。
文檔編號A61K38/44GK102604970SQ201210074428
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月20日 優先權日2012年3月20日
發明者何光志, 曹鋒, 王安宇, 王平, 王文佳, 田維毅, 許滔, 黃高 申請人:貴陽中醫學院