專利名稱：沙苑子及其黃酮提取物在制備增強自然殺傷細胞活性藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及沙苑子及其黃酮提取物的新用途，具體涉及利用其對自然殺傷細胞活性的增強作用在藥物制備中的用途。
背景技術：
沙苑子為豆科植物扁莖黃苗(Astragalus complanatus R .Br)的干燥成熟種子，有溫補肝腎，固精、縮尿、益肝明目的功能，為補益肝腎的傳統中藥，味甘、辛溫、無毒。沙苑子主要含有黃酮類、三萜類、有機酸類、氨基酸、多肽、蛋白質、留醇、多糖及鐵、鋅、猛、銅等微量元素，其中沙苑子黃酮有沙苑子式(complanatuside),沙苑子新式 (neocompalnoside),沙苑子楊梅式(myricomplanoside),鼠李朽1 檬素-3_0_β -D-葡萄糖 ft (rhomnocitrin-3-O- β -D-glucoside),紫云英 ft (astragalin),山奈素-3-0-L 阿拉伯批喃糖式(kaempferol-3-0- a -L-arabinoside),山奈酌·(kaompferol),楊梅樹皮素(myricetin),毛蕊異黃酮-7-0-葡萄糖式(calycosin-7-O-glucoside)等。藥理研究表明，沙苑子具有保肝、降脂、降壓、抑制血小板聚集、改變血液流變學指標、抗炎及增加非特異性和特異性免疫功能等作用。自然殺傷細胞(natural killer cell,NK細胞)是體內一類獨特的淋巴細胞,具有無需預先致敏、無主要組織相容性體系(MHC)限制性、能直接殺傷靶細胞的功能特性。在機體抗感染、抗腫瘤、免疫調節和造血調控等方面發揮著重要的免疫功能，因此，NK細胞的臨床治療研究已經成為國內外學者研究的熱點，通過各種途徑擴增和激活NK細胞具有重要意義。而中藥活性成分調節NK活性目前未見有文獻報道
發明內容
本發明的發明目的是提供一種沙苑子及其黃酮提取物的新用途。為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是
沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強自然殺傷細胞活性藥物中的應用。所述沙苑子黃酮提取物中以重量計黃酮含量> 50%。沙苑子黃酮提取物的制備屬于現有技術，例如，可以采用下列方法制備沙苑子粗粉用80%乙醇提取，經AB-8大孔樹脂純化，無水乙醇重結晶，得黃色沙苑子黃酮提取物。上述技術方案中，所述沙苑子黃酮提取物包括黃酮及其醫藥上可接受的鹽。所述藥物含有治療有效量的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物及藥學上可接受的載體。沙苑子黃酮提取物可口服給藥，每日劑量為3. Og-6. 0g，優選4. Og-5. 0g。
由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
I.研究證明，沙苑子黃酮提取物能促進NK細胞增殖，提高NK的殺傷能力，上調NK細胞表面活性分子和NK細胞活化受體的表達；2.本發明首次采用中藥活性成分調節NK活性，具有重要的意義。


圖I是實施例二中沙苑子黃酮提取物(ACF)對NK細胞增殖活性的影響柱狀對比圖。圖2是實施例三中沙苑子黃酮提取物(ACF)對NK細胞殺傷K-562細胞作用的影響圖。圖3是實施例三中沙苑子黃酮提取物(ACF)對NK細胞殺傷SMCC7721細胞作用的影響圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述
實施例一沙苑子黃酮提取物(ACF)的制備
沙苑子粗粉lkg，用80%乙醇8000ml、7000 ml,7000 ml回流提取3次，每次I. 5 h，過濾，合并濾液，回收溶劑至無醇味后，加水稀釋至1000 ml，通過AB-8大孔樹脂，上樣速度為l.Oml/min、上樣濃度為10. Oml/min、樣品液pH 5. O，水洗脫至淡黃色，40 %乙醇洗脫至
淺黃色。收集40%乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，無水乙醇重結晶，結晶真空干燥，得黃色固體狀沙苑子黃酮提取物，采用紫外分光光度法以沙苑子苷為對照品測定總黃酮含量D，結果D 彡 60%ο實施例二 沙苑子黃酮提取物(ACF)對NK細胞增殖活性的影響
實驗方法將NK-92細胞調整密度為I X IO5個細胞/ml，于96孔板中加IOOul/孔，力口入用培養基配制的不同濃度ACF，使終濃度分別為200，100，50，25，12 μ g/ml，于37°C培養2411、4811和7211，每孔加入1(^1^皿17溶液，繼續培養4h，加入100 μ I 10%SDS,待紫色結晶完全溶解后，測定570nm的OD值。實驗結果培養24h、48h和7此后，ACF各劑量對NK-92細胞活性均有增強作用，并呈現一定的劑量依賴關系。與對照組比較，培養24h的ACF-B、48h的ACF-B和ACF_C、72h的ACF-A E組細胞活性顯著增強(/7〈0. 01)，尤以100 μ g/ml的ACF-B組最明顯，見圖I。實驗結果證明，沙苑子黃酮提取物(ACF)能顯著促進NK細胞增殖，提高NK活性。實施例三沙苑子黃酮提取物(ACF)對NK細胞殺傷活性的影響
I.沙苑子黃酮提取物(ACF)對NK細胞殺傷K-562腫瘤細胞作用的影響實驗方法以K-562為靶細胞，細胞濃度調至5 X IO4個細胞/ml，每孔100 μ I，加入96孔板中，不同濃度加藥培養的ΝΚ-92細胞為效應細胞，效靶比為10: 1,5: I, I: 1，每孔100 μ 1，對照組加不含藥培養的ΝΚ-92細胞，每個效靶比設4個復孔，各組設效應細胞和靶細胞對照孔。37°C，5%C02培養24h，吸棄100 μ I上清，加入MTT 10 μ I后繼續培養4h，加入100ull0%SDS，待紫色結晶完全溶解后，測定570nm OD,根據以下公式計算NK細胞殺傷活性
殺傷活性(%) = {1_[(效應細胞+靶細胞OD值)一效應細胞OD值]/靶細胞OD值}X100%
實驗結果NK-92細胞加ACF培養3天后，ACF能增強NK-92細胞對K-562細胞的殺傷作用。與對照組比較，ACF-A, ACF-B和ACF-C組能顯著提高NK-92細胞對K-562細胞的殺傷活性(/KO. 01)，見圖2。2.沙苑子黃酮提取物(ACF)對NK細胞殺傷SMCC7721肝癌細胞作用的影響
實驗方法將3麗(-7721靶細胞調至5\104個細胞/1111，于96孔板中加入100 μ I/孔，培養12h后，按照效靶比為10:1，5: I, I: 1，加入不同濃度加藥培養的NK-92細胞為效應細胞，對照組加不含藥培養的NK-92細胞，每個效靶比設4個復孔，各組設效應細胞和靶細胞對照孔。37°C，5%C02培養24h，吸棄100 μ I上清，加入MTT 10 μ I后繼續培養4h，加入100ull0%SDS，放置過夜，測定570nm 0D,計算NK細胞殺傷活性。實驗結果NK-92細胞加ACF培養3天后，ACF能增強NK-92細胞對SMMC-7721細胞的殺傷作用。當效靶比為10 :1和5 :1時，與對照組比較，ACF-A、ACF-B和ACF-C組能顯著提高NK-92細胞對SMMC-7721細胞的殺傷活性(/X0. 01 )，見圖3。
實驗結果證明，沙苑子黃酮提取物(ACF)能顯著提高NK細胞對腫瘤細胞K562和SMMC-7721的殺傷活性。實施例四沙苑子黃酮提取物(ACF)對NK細胞表型及活化分子表達的影響
實驗方法流式細胞術檢測NK細胞表面分子。NK-92細胞于含不同濃度ACF(終濃度為100，50，25 μ g/ml)的a -MEM培養基中培養7天，實驗同時設對照組，每2天換液I次。收集細胞，PBS洗滌兩次，加入O. 25%BSA封閉30min后，PBS洗滌兩次，加入單抗CD3、CD56、CD16、CD25 (IL-2L)、CD69、CD95 (同時以同型單抗作對照)，冰浴30min, PBA洗滌兩次，流式細胞儀分析。實驗結果細胞表型流式細胞儀檢測顯示，ACF培養7天的NK-92，其細胞膜表面表達的CD56分子與對照組的NK-92細胞相同，均為CD56toight，control組、ACF100, ACF50、ACF25組⑶56分子表達率和平均熒光強度分別為99. 2±0. 5、82. 4±0. 3,99. 1±0. 3、85. 6±0· 2,99. 4±0· 3,84. 8±0· 2,99. 1±0· 1,85. 5±0· 3 ;而 CD3 和 CD16 分子仍為陰性，但⑶25、⑶69分子的表達強度提高，各組⑶25分子表達率和平均熒光強度分別為63. 4±0. 7、
2.21±0· 2,74. 3±0· 4**、3· 67±0· 3*, 72. 6±0· 5**、2· 58±0· 2,57. 26±0· 6,2. 48±0· 2 ；各組⑶69分子表達率和平均熒光強度分別為13. 2±0. 3、1.93±0. 3，13. 4±0. 2、
5.05±0· 4**，14. 94±0· 3,1. 87±0· 5，13. 1±0· 5,1. 98±0· 2 ;各組 CD95 分子表達率增加，分別為3. 76±0· 2，4. 22±0· 3，4. 98±0· 3*，4. 20±0· 2，而熒光強度無明顯差異。見Fig4-4。實驗結果證明，沙苑子黃酮提取物(ACF)可通過上調⑶25 (IL_2 R)、⑶69和⑶95分子的表達，增加與IL-2的結合而激活殺傷分子的轉錄表達，提高其殺傷作用。實施例五沙苑子黃酮提取物(ACF)對NK細胞活化受體KLRK1、NCR1、NCR2、NCR3表達的影響
實驗方法采用熒光定量RT-PCR檢測NKP46、NKP44、NKP30、NKG2D mRNA的表達。NK-92細胞于含不同濃度ACF (終濃度為100，50，25 μ g/ml)的a-MEM培養基中培養7天，實驗同時設對照組，每2天換液I次。收集細胞，PBA洗滌兩次，按RNA抽提試劑盒說明進行總RNA提取，逆轉錄合成cDNA，在MJ Research Opticon TM2實時熒光定量PCR儀上同時檢測NKP46、NKP44、NKP30、NKG2D和β-actin的表達，以SYBR Green I為熒光染料。以看家基因β-actin表達作為內參照，基因表達水平的改變=2_ΛΛετ。目的基因表達水平Λ CT =目的基因CT 一 β-actin CTo ΛΛ CT =實驗組Λ CT —對照組Λ CT值。重復實驗3次。CT值的含義是每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。引物序列
權利要求
1.沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強自然殺傷細胞活性藥物中的應用。
2.根據權利要求I所述的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強自然殺傷細胞活性藥物中的應用，其特征在于所述沙苑子黃酮提取物中以重量計黃酮含量> 50%。
3.根據權利要求I所述的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強自然殺傷細胞活性藥物中的應用，其特征在于所述沙苑子黃酮提取物包括黃酮及其醫藥上可接受的鹽。
4.根據權利要求I所述的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強自然殺傷細胞活性藥物中的應用，其特征在于所述藥物含有治療有效量的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開了沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強自然殺傷細胞活性藥物中的應用。沙苑子黃酮提取物能促進NK細胞增殖，提高NK的殺傷能力，上調NK細胞表面活性分子和NK細胞活化受體的表達；本發明首次采用中藥活性成分調節NK活性，具有重要的意義。
文檔編號A61P37/04GK102716178SQ20121010651
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者劉春宇 申請人:蘇州大學