一種抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒的真菌提取物的制備方法
【專(zhuān)利摘要】一種抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-1)的真菌提取物的制備方法，所依賴(lài)的菌株是炭團(tuán)菌屬真菌Q-s-4(Hypoxylon?sp.)。真菌Q-s-4經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，制備發(fā)酵產(chǎn)物的提取物。該方法可用于真菌Q-s-4的大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)，并以發(fā)酵產(chǎn)物為原料，工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的提取物。利用該方法制備的提取物，具有顯著抑制HIV-1整合酶的活性，并有抗菌活性，在治療艾滋病和細(xì)菌感染的新藥研發(fā)方面具有重要價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒的真菌提取物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)涉及一種能夠抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-1)整合酶表達(dá)的內(nèi)生真菌提取物的制備技術(shù)。
技術(shù)背景
[0002]獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquiredimmunodeficiency syndrome, AIDs)由感染人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)導(dǎo)致。自1981年由美國(guó)疾病控制中心首次報(bào)道以來(lái)，現(xiàn)已經(jīng)成為世界主要致死病之一。到2007年為止，世界范圍內(nèi)約有3340萬(wàn)人感染HIV病毒，其中2240萬(wàn)居住在非洲撒哈拉以南地區(qū)，約三分之二的人口感染HIV病毒。截至2010年底，全球中低收入國(guó)家中約有660萬(wàn)人接受了抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療，比2001年增長(zhǎng)了近22倍。目前臨床上應(yīng)用的近30種抗HIV-1藥物，輔以高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(Highly Active Antiretroviral Therapy, HAART)可以在一定程度上延長(zhǎng)HIV感染者的生存期和改善感染者的生活質(zhì)量。但是，由于HIV疫苗研究進(jìn)展的緩慢以及越來(lái)越多變異HIV的挑戰(zhàn)，研究開(kāi)發(fā)新型抗HIV化學(xué)藥物及治療方法仍然具有重要意義。HIV進(jìn)入人體后，主要通過(guò)與宿主細(xì)胞膜直接融合進(jìn)入細(xì)胞，HIV的復(fù)制周期主要包括吸附及穿入、逆轉(zhuǎn)錄與環(huán)化、整合、轉(zhuǎn)錄、翻譯、病毒顆粒裝配、病毒體成熟、出芽等階段。抗HIV物質(zhì)針對(duì)不同的作用位點(diǎn)發(fā)揮抗病毒作用現(xiàn)階段，主要抗HIV藥物主要分為五大類(lèi):(I)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶制劑；(2) HIV-1進(jìn)入抑制劑；(3) HIV-1蛋白酶抑制劑；(4) HIV-1整合酶抑制劑；(5)其它。
[0003]因此，基于HIV-1病毒的不穩(wěn)定性，變異迅速，新細(xì)菌株和病毒株不斷出現(xiàn)導(dǎo)致原有藥物治療譜窄，耐藥性嚴(yán)重等新特性，科研工作者針對(duì)HIV-1復(fù)制周期的各個(gè)階段廣泛的尋找和研究用于不同靶點(diǎn)的有效藥物，旨在抑制HIV-1的復(fù)制。
[0004]近年來(lái)，我國(guó)藥用植物內(nèi)生真菌及活性成分的研究成為藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)非常重要的領(lǐng)域，大自然為很多疾病提供了治療藥物的來(lái)源，許多藥用植物已經(jīng)被報(bào)道具有抗HIV-1的特性，這也應(yīng)該是我國(guó)新藥研究的優(yōu)勢(shì)所在，一旦發(fā)現(xiàn)活性，往往以該結(jié)構(gòu)為先導(dǎo)化合物，合成活性更強(qiáng)、可溶性好及毒性低的藥物。但大量開(kāi)采植物會(huì)導(dǎo)致植物資源枯竭，環(huán)境污染破壞。內(nèi)生真菌是存在于植物正常部位而不引起宿主植物明顯癥狀的一類(lèi)真菌。植物與其內(nèi)生真菌的關(guān)系是互惠共生的。近年來(lái)一些研究表明，與藥用植物共生的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分。利用發(fā)酵法生產(chǎn)與植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，具有可大規(guī)
[0005]模工業(yè)化生產(chǎn)和易于進(jìn)行質(zhì)量控制等優(yōu)點(diǎn)，并不會(huì)對(duì)自然資源造成破壞。所以從真菌發(fā)酵產(chǎn)物中尋找新型抗HIV和抗菌藥物或先導(dǎo)化合物的研究，是當(dāng)今國(guó)內(nèi)藥物研發(fā)的重要方向和活躍領(lǐng)域，也為我國(guó)新藥研究的優(yōu)勢(shì)所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法和真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物制備的方法，該方法制備成本低，工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短，且污染小，可用于真菌的大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)，并以真菌發(fā)酵物為原料工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的提取物。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供上述發(fā)酵產(chǎn)物的提取物用于抗人類(lèi)免疫缺陷病毒的研發(fā)和應(yīng)用。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)是:液體發(fā)酵培養(yǎng)真菌Q-s-4，發(fā)酵產(chǎn)物分離為菌絲體和發(fā)酵液兩個(gè)部分，用有機(jī)溶劑分別對(duì)菌絲體和發(fā)酵液部分進(jìn)行提取，得到發(fā)酵產(chǎn)物的提取物。本發(fā)明所利用的真菌Q-s-4是從菊科蒿屬植物黃花蒿(Artemisia annuaL.)的莖中分離得到的，經(jīng)鑒定為炭團(tuán)菌(Hypoxylon sp.)。該菌種于2012年4月23日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6039。保藏和存活證明見(jiàn)附件。
[0009]具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的技術(shù)步驟如下:
[0010]1.真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0011]將真菌Q-s-4自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于25°C恒溫培養(yǎng)5-12天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，將菌片打碎，接入麥麩液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。麥麩液體培養(yǎng)基組成按重量百分含量計(jì)算為:麥麩1-5% (煮20-30分鐘，取汁)，葡萄糖1-4%, KH2PO40.1-0.4%, MgSO40.1-0.3%，其余成分為水，培養(yǎng)基pH自然。三角瓶或其他容器裝液 體培養(yǎng)基，裝量為容器體積的30-60%。培養(yǎng)基滅菌后接入真菌Q-s-4，22-26°C振蕩暗培養(yǎng)12-30天，振蕩轉(zhuǎn)速90-130轉(zhuǎn)/分鐘。
[0012]2.真菌發(fā)酵產(chǎn)物的獲得
[0013]真菌Q-s-4經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，用80-120目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，分為菌絲體和發(fā)酵液兩個(gè)部分；菌絲體部分用水沖洗干凈，擠壓除去大部分水分；發(fā)酵液部分40-60°C真空減壓濃縮至原發(fā)酵液體積的10-20%。
[0014]3.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物的制備
[0015]①菌絲體用甲醇或95 %乙醇超聲提取2-3次，每次40-60分鐘，每次提取溶劑用量(V)為菌絲體重量(W)的8-12倍；或菌絲體用甲醇、95%乙醇或丙酮滲漉提取，提取溶劑用量(V)為菌絲體重量(W)的12-15倍，所得提取液于40-60°C減壓濃縮后干燥，得到菌絲體總提取物；
[0016]②發(fā)酵液濃縮物加入95%乙醇或無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，溶劑用量(V)為發(fā)酵液濃縮物體積(V)的3-5.5倍，靜置2處分層，收集上清液，于40-601:減壓濃縮后干燥，得到發(fā)酵液總提取物。
[0017]③分別將菌絲體總提取物和發(fā)酵液總提取物均勻分散于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，至有機(jī)溶劑層無(wú)色；分別合并各溶劑萃取液，于40-60°C減壓濃縮后干燥，得到菌絲體和發(fā)酵液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取部位。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例:
[0019]1.真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0020]將炭團(tuán)菌Q-s-4 (Hypoxylon sp.)自低溫保藏的斜面試管菌種活化后,轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于25°C恒溫培養(yǎng)5天，分別在菌落邊緣打孔成直徑均勻的菌片，并以小碎塊接入麥麩液體培養(yǎng)基。
[0021]麥麩液體培養(yǎng)基組成為:麥麩20克/升(煮30分鐘，取汁)，葡萄糖30克/升，KH2P042克/升，MgSO4I克/升。250mL三角瓶裝培養(yǎng)基lOOmL，122°C滅菌22分鐘，按上述方法接入炭團(tuán)菌Q-s-4 (Hypoxylon sp.),于25°C振蕩暗培養(yǎng)14天,搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘。
[0022]2.真菌發(fā)酵產(chǎn)物的獲得
[0023]真菌Q-s-4經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)后，用100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，分為菌絲體和發(fā)酵液兩部分；菌絲體部分用蒸餾水沖洗干凈，擠壓除去水分；發(fā)酵液部分常壓加熱濃縮至原發(fā)酵液體積的 20%。
[0024]3.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物的制備
[0025]①菌絲體用甲醇超聲提取2次，每次60分鐘，第一次和第二次提取的溶劑用量(V)分別為菌絲體重量(W)的12倍和10倍；合并兩次提取液，60°C減壓濃縮后干燥，得菌絲體總提取物；
[0026]②發(fā)酵液濃縮物加入95%乙醇醇沉，95%乙醇的用量(V)為發(fā)酵液濃縮物體積(V)的4倍，于8°C靜置24h分層，收集上清液，于60°C減壓濃縮，得到發(fā)酵液總提取物。
[0027]③分別將菌絲體總提取物和發(fā)酵液總提取物均勻分散于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取至各有機(jī)溶劑層無(wú)色；合并各萃取液，于60°C減壓濃縮后冷凍干燥，得到菌絲體和發(fā)酵液的石油醚提取部分、乙酸乙酯提取部分和正丁醇提取部位。
[0028]比較例:
[0029]1.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-1)整合酶的抑制作用
[0030]真菌Q-s-4接種到PDA培養(yǎng)基的平皿中，25 °C恒溫培養(yǎng)7天，接入麥麩液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基組成為:麥麩30克/升(煮20分鐘，取汁)，葡萄糖20克/升，KH2P043克/升，MgSO4L 5克/升。250mL三角瓶裝培養(yǎng)基125mL，121°C滅菌25分鐘。滅菌培養(yǎng)基接入真菌Q-s-4，于25°C振蕩暗培養(yǎng)21天，搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘。
[0031]結(jié)束培養(yǎng)后，用100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，分離菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體用水沖洗干凈，擠壓除去水分，用95%乙醇超聲提取3次，提取時(shí)間分別為60分鐘、40分鐘和40分鐘，提取溶劑用量(V)分別為菌絲體濕重(W)的10倍、8倍和8倍。合并三次提取液，50°C減壓濃縮，干燥，得到菌絲體的總提取物。發(fā)酵液濃縮至原體積的10%，加入3.5倍體積95%乙醇進(jìn)行醇沉，室溫放置24h分層。收集上清液，50°C減壓濃縮后干燥，得到發(fā)酵液總提取物。
[0032]分別將菌絲體總提取物和發(fā)酵液總提取物均勻分散于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取至有機(jī)溶劑層無(wú)色；合并各萃取液，于50°C減壓濃縮后干燥，得到菌絲體和發(fā)酵液的石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。
[0033]將各部分提取物倍比稀釋?zhuān)肏IV-1整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)測(cè)定提取物對(duì)HIV-1整合酶的抑制率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表I。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:菌絲體石油醚和乙酸乙酯提取部位在所測(cè)試濃度對(duì)HIV-1整合酶的抑制作用隨濃度增加而增加，超過(guò)一定濃度，抑制作用達(dá)到平衡。菌絲體和發(fā)酵液的石油醚和乙酸乙酯的提取部位對(duì)HIV-1整合酶均有顯著的抑制作用；正丁醇部位沒(méi)有顯示明顯的活性。菌絲體的石油醚和乙酸乙酯提取部位對(duì)HIV-1整合酶的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)分別為11.983ii g/mL和7.436y g/mL。發(fā)酵液的石油醚和乙酸乙酯提取部位對(duì)HIV-1整合酶的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)分別為46.314 u g/mL和10.926 u g/mL。[0034]表I真菌Q-s-4發(fā)酵產(chǎn)物提取物對(duì)HIV-1整合酶的抑制作用
[0035]
I
【權(quán)利要求】
1.一種制備保藏編號(hào)為CGMCC N0.6039的炭團(tuán)菌屬真菌Q_s_4 (Hypoxylon sp.)的發(fā)酵產(chǎn)物提取物的方法，包括步驟: (1)真菌的發(fā)酵培養(yǎng) 將真菌Q-s-4自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于25°C恒溫培養(yǎng)5-12天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； 液體培養(yǎng)基組成按重量百分含量計(jì)算為:麥麩1-5 %，煮20-30分鐘，取汁，葡萄糖1-4%, KH2PO40.1-0.4%, MgSO40.1-0.3%，pH自然；三角瓶或其他容器裝液體培養(yǎng)基，裝量為容器體積的30-60% ;滅菌后接入真菌Q-s-4，22-26°C振蕩暗培養(yǎng)12-30天，振蕩轉(zhuǎn)速90-130轉(zhuǎn)/分鐘； (2)真菌發(fā)酵產(chǎn)物的獲得 真菌Q-s-4經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，用80-100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，分離菌絲體和發(fā)酵液；菌絲體用水沖洗干凈，擠壓除去大部分水分；發(fā)酵液40-60°C減壓濃縮至原發(fā)酵液體積的10-20% ； (3)真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物的制備 ①菌絲體用甲醇或95%乙醇超聲提取2-3次，每次40-60分鐘，每次提取用的溶劑體積為菌絲體重量的8-12倍；或菌絲體用甲醇、95 %乙醇或丙酮滲漉提取，提取用的溶劑體積為菌絲體重量的12-15倍；所得提取液于40-60°C減壓濃縮后干燥，得到菌絲體總提取物； ②發(fā)酵液濃縮物加入95%乙醇或無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，所用溶劑體積為發(fā)酵液濃縮物體積的3-5.5倍，放置24h分層 ，收集上清液，于40-60°C減壓濃縮后干燥，得到發(fā)酵液總提取物； ③上述兩種總提取物，分別分散于水中，依次以石油醚和乙酸乙酯萃取至溶劑層無(wú)色；合并各萃取液，于40-60°C減壓濃縮后冷凍干燥，得到各總提取物的石油醚部位和乙酸乙酯部位。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:按上述方法制備的保藏編號(hào)為CGMCCN0.6039的炭團(tuán)菌屬真菌Q-s-4 (Hypoxylon sp.)的提取物，能夠抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒整合酶的活性，能夠用于抗人類(lèi)免疫缺陷病毒藥物的研究和應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K36/062GK103451234SQ201210172132
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月30日
【發(fā)明者】郭順星, 梁寒峭, 陳曉梅, 張大為, 王春蘭, 邢詠梅, 李春艷, 李兵 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所